Дослідження антимікробних та сорбційних властивостей гідрогелю метилкремнієвої кислоти і гелевої форми бентоніту

Размещено на http://www.allbest.ru/

„Q„p„x„}„u„‹„u„~„Ђ „~„p http://www.allbest.ru/

Дослідження антимікробних та сорбційних властивостей гідрогелю метилкремнієвої кислоти і гелевої форми бентоніту

Бобир Віталій Васильович доктор медичних наук, професор, доцент кафедри мікробіології, вірусології та імунології, Національний медичний університет імені О.О. Богомольця

Назарчук Олександр Адамович доктор медичних наук, професор кафедри мікробіології, вірусології та імунології, Вінницький Національний медичний університет ім. М. І. Пирогова

Бебик Віра Володимирівна аспірантка кафедри мікробіології, вірусології та імунології, Вінницький Національний медичний університет ім. М. І. Пирогова

Анотація

ентеросорбент гідрогель метилкремнієвої кислоти бентоніту

Розглянуто основні властивості і принципи застосування ентеросорбентів на основі гідрогелю метилкремнієвої кислоти та бентоніту. З аналізу літератури зроблено висновок, що метод ентеросорбції з кожним роком все частіше використовується у медичній практиці.

Показано, що використання сорбентів сприяє оптимізації процесів адаптації і компенсації порушених функцій, корекції патологічних змін метаболізму, досягненню імуномодулюючого, антиоксидантного та інших важливих ефектів.

Зазначено, що з кожним роком стрімко зростає кількість лікарських засобів для підтримання та відновлення мікробіому людини, до яких певною мірою можна віднести й сорбенти.

Водночас зроблено застереження, що при розробці таких препаратів слід враховувати їх сорбційні властивості по відношенню до основних форм непатогенних та умовнопатогенних грампозитивних та грамнегативних мікроорганізмів.

Встановлено, що такі сорбенти як гелева форма бентоніту та гідрогель метилкремнієвої кислоти не мають вираженої бактерицидної активності по відношенню до основних груп грампозитивних та грамнегативних мікроорганізмів бактеріальної природи.

Водночас детально досліджено сорбційні властивості даних речовин по відношенню до основних груп бактерій та грибів. Показано, що при тривалому часі контакту дані сорбенти здатні в різній ступені зв'язувати бактерії. В більшій мірі такі властивості виражені у ГМКК.

Зроблено аргументоване припущення, що пероральне застосування обох сорбентів, зокрема гелевої форми бентоніту не буде позначатись на показниках кишкового мікробіому людини і вони можуть використовуватись з метою конструювання нових засобів для підтримання та відновлення мікроекологічного статусу людини.

Ключові слова: ентеросорбенти, резистентість, стафілококи, кишкова паличка, кандиди, електронна мікрокопія, мікробіом.

Abstract

Bobyr Vitalii Vasil'yevich Doctor of Science, Professor, Bogomolets National Medical University, microbiology, virology and immunology department, Docent

Nazarchuk Oleksandr Adamovych Doctor of Science, Professor, National Pirogov Memorial Medical University, Department of Microbiology, Professor

Bebyk Vira Volodymyrivna National Pirogov Memorial Medical University, Department of Microbiology, PhD student

THE RESEARCH OF ANTIMICROBIAL AND SORBPTION PROPERTIES OF HYDROGEL OF METHYLSILICA ACID AND GEL FORM OF BENTONITE

The main properties and principles of use of enterosorbents based on hydromethylsilica acid and bentonite are studied. On the basis of the analysis of the literature, there was concluded that the enterosorption method was increasingly used in medical practice every year. The use of sorbents was shown to contribute into the optimization of the processes of adaptation and compensation of impaired functions, the correction of pathological changes in metabolism, the achievement of immunomodulating, antioxidant and other important effects.

There is noted that every year the number of medicines for maintaining and restoring the human microbiome is rapidly increasing, which can also include sorbents. At the same time, a caveat is made that when developing such drugs, their sorption properties should be taken into account in relation to the main forms of non- pathogenic and conditionally pathogenic Gram-positive and Gram-negative bacteria and fungi Candida.

There has been established that such sorbents as the gel form of bentonite and hydrogel of methylsilica acid do not have a pronounced bactericidal activity in relation to the main groups of Gram-positive and Gram-negative microorganisms of a bacterial nature. At the same time, with a long contact time, they are able to bind bacteria to varying degrees. To a greater extent, such properties are expressed in hydrogel of methylsilica acid which.

There has been made a reasoned assumption that the oral use of both sorbents, in particular the gel form of bentonite, will not affect the indicators of the human intestinal microbiome and can be used for the purpose of designing new means for maintaining and restoring the microecological status of a person.

Keywords: enterosorbents, resistance, Staphylococci, Escherichia coli, Candida, electronic microcopy, microbiome

Постановка проблеми

Ще донедавна препарати на основі сорбентів найчастіше розглядались як препарати для лікування різного роду інтоксикацій. В наш час сорбенти використовують не лише в якості патогенетичної, але й етіотропної моно- й комбінованої терапії при кишкових інфекціях, що є актуально з огляду на стрімке зростання полірезистентності мікроорганізмів до антибіотиків та хіміопрепаратів [1, 2]. Крім того, сьогодні активно вивчається ефективність використання монтморилонітових глин (смектитів), до яких належить бентоніт, для лікування і профілактики інфекційних кишкових захворювань [3]. Існують дані, що вживання бентонітів може попереджувати порушення мінерального обміну, яке відіграє важливу патогенетичну роль при значній кількості захворювань [4,5].

На даний час накопичено значну кількість науково обґрунтованих свідчень того, що використання сорбентів сприяє оптимізації процесів адаптації і компенсації порушених функцій, корекції патологічних змін метаболізму, досягненню імуномодулюючого, антиоксидантного та інших важливих ефектів.

З року в рік нестримно збільшується арсенал засобів для підтримання та відновлення мікроекологічного статусу людини. Водночас при розробці таких препаратів слід враховувати сорбційні властивості сорбентів, зокрема на основі гелевої форми бентоніту та гідрогелю метилкремнієвої кислоти (ГМКК) по відношенню до основних форм грампозитивних та грамнегативних бактерій та грибів роду кандида.

Аналіз останніх досліджень і публікацій. Раніше під керівництвом академіка Широбокова В.П. проведені дослідження показали позитивний вплив бентоніту на організм білих мишей, який проявляється в тому числі і зростанням тривалості їх життя [6]. Крім того, цим питанням активно цікавляться за кордоном, так наприклад, австралійські колеги Tanka P. Prasai, Kerry B. Walsh, Surya P. Bhattarai, David J. Midmore, Thi T. H. Van Robert J. Moore, Dragana Stanley в дослідах на тваринах показали, що споживання бентоніту сприяє значному зниженню рівня потенційно-патогенних мікроорганізмів [7].

Разом із тим, залишається до кінця не вивченим питання впливу ентеросорбції на умови функціонування природнього мікробіому людини.

Мета статті Дослідити сорбційні властивості гідрогелю метилкремнієвої кислоти та гелевої форми бентоніту по відношенню до основних форм патогенних та умовно патогенних мікроорганізмів, а також дріжджових грибів роду Candida.

Матеріали і методи. Антимікробну активність досліджуваних препаратів вивчали стандартним методом дифузії препарату в агар [8]. В якості тест-культур використовували шість еталонних штамів мікроорганізмів: Enterococcus faecalis УКМ В-915, Candida albicans УКМ В-2681, Escherichia coli УКМ В-906, Pseudomonas aeruginosa УКМ В-900, Proteus vulgaris УКМ В-905 та Staphylococcus aureus УКМ В-918.

З метою дослідження динаміки формування антимікробної активності ГМКК та бентоніту, препарати зважували по 50 мг, змішували з суспензією еталонних штамів мікроорганізмів, які містили 2*10⁶ мікробних клітин в мл. Суміші витримували при кімнатній температурі і через 1, 3, 6 та 24 год висівали надосадову рідину в об'ємі 50 мкл на відповідні тверді поживні середовища. Через 24 год на такі ж середовища висівали і осад (сорбент). В якості контролю використовували вихідні мікробні зависи без сорбентів.

Для дослідження показників сорбційної здатності препарати зважували по 50 мг і додавали до них по 0,1 мл суспензій тест-культур, що містили 2*10⁶ мікробних клітин в 1 мл, витримували 1 годину при 40°С, вносили у флакони з 10 мл фізіологічного розчину, струшували протягом 10 хв і центрифугували протягом 10 хв при 3000 об/хв для отримання осаду. Надосадову рідину в об'ємі 0,05 мл висівали на щільні середовища, оптимальні для тест-культур, при необхідності розбавляючи її фізіологічним розчином. Для експериментів підбирали такі розведення центрифугатів мікроорганізмів, які при посіві на тверді поживні середовища дають можливість підрахувати кількість отриманих колоній. Контролем слугували суспензії мікроорганізмів, які готували і обробляли аналогічно дослідним. Після 24-год інкубації при 37°С підраховували кількість колоній, що виросли і, враховуючи коефіцієнт розведення, визначали загальну їх кількість в дослідах та в контролі. Показники сорбції досліджуваних препаратів визначали за формулою: А=К- О/К*100, де К і О - кількість мікроорганізмів, що висіяні відповідно з дослідного та контрольного зразків.

Міцність зв'язку досліджуваних сорбентів і мікроорганізмів вивчали на прикладі E. coli УКМ В-906 та S. aureus УКМ В-918. Для цього після контакту бактерій з препаратами і центрифугування, як було описано вище, їх висівали з надосадової рідини в об'ємі 0,02 мл на МПА. Надосадову рідину зливали, а до осадів додавали по 5 мл 0,85% розчину NaCl, 10% розчину NaCl, 50% сироватки та м'ясо-пептонний бульйону, які використовували в якості десорбентів. Струшували 10 хвилин та висівали в об'ємі 0,02 мл на МПА. Після інкубації при +37⁰С протягом 24 г підраховували кількість колоній бактерій, що виросли з надосадових рідин і з елюатів та визначали показники елюції мікроорганізмів, сорбованих препаратами.

Виклад основного матеріалу

Антимікробну активність у ГГМКК виявлено через 6 год після його взаємодії зі S. aureus, E. coli та P. aeruginosa, після взаємодії з усіма іншими тест-мікроорганізмами - значно пізніше, після 24 год. Бактерицидна дія у даного сорбенту зафіксована лише по відношенню до Enterococcus faecalis УКМ В-915 після їх контакту протягом доби. У бентоніту така властивість відносно досліджуваних мікроорганізмів протягом 24 год спостереження не зареєстрована, хоча через 24 год контакту з ним відмічали незначне зменшення кількості колоній P. aeruginosa УКМ В-900 та E. coli УКМ В-906 (табл. 1).

Таблиця 1Динаміка прояву антимікробної активності ГГМКК та бентоніту

Примітки: П - час (год) контакту препаратів з мікроорганізмами, коли починає проявлятися антимікробна активність (зменшується кількість колоній). Б - час (год) контакту, при якому реєструється бактерицидна дія.

Сорбційні властивості вказаних препаратів вивчали також за допомогою електронно-мікроскопічних методів (ЕМ). В роботі використовували суспензії S. aureus УКМВ-918 та E. coli УКМВ-906 в концентрації 10⁸ мікробних клітин на 1 мл. До 1 мл суспензій мікроорганізмів у вищезазначених концентраціях додавали 50 мг кожного сорбенту та струшували протягом 2 хв. ЕМ дослідження взаємодії мікроорганізмів з препаратами проводили через 15 хв, 60 хв, 6 год, 9 год та 12 год після їх контакту з бактеріями при кімнатній температурі.

Результати ЕМ дослідження показали наявність сорбційної активності відносно кишкової палички у обох досліджуваних препаратів (рис. 1-4). Разом з тим, зв'язування E. coli УКМ В-906 ГМКК відмічалась значно швидше ніж гелевою формою бентоніту - вже після 60 хв контакту з ГГМКК 50% бактеріальних клітин були сорбовані даним препаратом (рис. 1). У бентоніту такі властивості розпочинали проявлятись лише після 6 годин контакту (рис. 2). Сорбцію стафілококів на поверхні ГМКК починали спостерігати через три години, а після 6 годин контакту більшість клітин S. aureus УКМ В-918 були зв'язані з ним (рис. 3). Сорбційні властивості бентоніту відносно стафілококу зареєстровані лише на 6 годину взаємодії (рис. 4). Після 9 год контакту з бентонітом даних бактерій, вільних від сорбенту, практично не зустрічалось.

Рис. 1А. Електронна мікроскопія. E. coli УКМ В-906 після 60 хв контакту з ГГМКК. Збільшення 20 000*; 1Б. Електронна мікроскопія. E. coli УКМ В-906 після 6 год контакту з гелевою формою бентоніту. Збільшення 20 000*; 1В.

Електронна мікроскопія. S. aureus УКМ В-918 після 6 год контакту з ГГМКК. Збільшення 20 000*. 1Г. Електронна мікроскопія. S. aureus УКМ В-918 після 9 год взаємодії з гелевою формою бентоніту Збільшення 20 000*.

Як показано на рис. 2, найбільш активно ГМКК зв'язував P. vulgaris УКМ В-905. і S. aureus УКМ В-918, 90% і 82% відповідно (рис. 11). Меншою мірою - Е. coli УКМ В-906, P. aeruginosa УКМВ-900, 75% та 71% відповідно. Найгірше він сорбував E. faecalis УКМ В-915, Candida albicans УКМ В-2681 - 52% та 38%, відповідно. У порівнянні з ГГМКК, сорбційна активність гелевої форми бентоніту щодо використаних в експерименті штамів мікроорганізмів була значного нижчою і коливалась в межах 27-45% (р<0,05).

Рис. 2. Показники сорбційної здатності гідрогелю метилкремнієвої кислоти та гелевої форми бентоніту (%).

Сорбційна активність гелевої форми бентоніту щодо використаних в експерименті штамів мікроорганізмів була значного нижчою і коливалась в межах 27-45%. Експерименти також показали, що даний препарат зв'язує більш інтенсивно грамнегативні мікроорганізми. Натомість, відносно ентерококів цей показник не перевищував 25%.

Отримані результати (табл. 2) свідчать про те, що ГМКК наділений помірною міцністю зв'язку з E. coli УКМВ-906, з нього екстрагується від 5,73 до 8,3% бактерій. Найлегше даний сорбент «віддає» кишкову паличку при використанні в якості десорбенту 10% р-н NaCl, в даному випадку з нього звільнялось 8,3% мікроорганізмів, натомість, при використанні 0,85% р-н NaCl цей показник становив 3,92%. Відсоток десорбції S. aureus УКМВ-918 з ГГМКК був близьким до попередніх, в залежності від десорбенту він коливався в межах 1,6 - 4,46%. Найбільш ефективно елюція стафілококів відбувалась при використанні в якості десорбенту 0,85% р-н NaCl.

Порівняно з ГМКК, бентоніт легше «віддавав» зв'язані з ним мікроорганізми. Показники ефективності десорбції S. aureus УКМ В-918 з бентонітом складали 6,8 - 16,2%. Найбільш ефективно десорбція даних мікроорганізмів з бентоніту здійснювалась при використанні в якості десорбенту МПБ та 50% сироватки ВРХ. За таких умов звільнялось 16,2% та 12,5 % стафілококів відповідно. Менш ефективними десорбентами виявились 20% розчин сахарози та 10% розчин NaCl, 8,8% та 6,8% відповідно, ще нижчі показники десорбції зафіксовані при його обробці 0,85% NaCl, в даному випадку вони становили 6,8% (табл. 2). Міцність зв'язку бентоніту з E. coli УКМВ-906 є близькою до характеристики його сорбції зі S. aureus УКМВ-918, відсоток десорбції в залежності від десорбенту коливався у межах 7,25-12,3%. Найлегше даний процес відбувався у зразках, де екстрагентами слугували МПБ та 50 % сироватка ВРХ, в цьому випадку звільнялось 12,3 % та 9,2 % мікроорганізмів відповідно.

Таблиця 2Ефективність десорбції мікроорганізмів з гідрогелю метилкремнієвої кислоти (ГГМКК) та бентоніту (%)

Примітки: А - надосадова рідина після центрифугування; В - елюат;

Висновки

Отже, результати експериментальних досліджень дозволили встановити, що такі сорбенти як гелева форма бентоніту та гідрогель метилкремнієвої кислоти, які здатні активно сорбувати кишкові віруси, не наділені вираженою бактерицидною функцією по відношенню до більшості видів досліджених мікроорганізмів бактеріальної природи. Разом з тим, при тривалому часі контакту, обидва сорбенти здатні в різній ступені зв'язувати бактерії. В більшій мірі такі властивості виражені у ГМКК який, в залежності від виду мікроорганізмів, може сорбувати від 52 до 90% клітин. Показники сорбційної активності та міцність зв'язку мікроорганізмів з гелевою формою бентоніту були не такі виражені і коливалась в межах 27-45%.

Таким чином, можна зробити припущення, що пероральне застосування обох сорбентів, зокрема гелевої форми бентоніту не буде суттєво впливати на кількісні показники кишкового мікробіому людини і крім використання для корекції патологічних змін метаболізму, досягнення імуномоделюючого, антиоксидантного та інших важливих ефектів, вони можуть використовуватись з метою конструювання нових засобів для підтримання та відновлення мікроекологічного статусу людини.

Література

ентеросорбент гідрогель метилкремнієвої кислоти бентоніту

1. Романюк Л.Б., Кравець Н.Я.,. Климнюк С.І, Копча В.С., Дронова О.Й.. Антибіотикорезистентність умовно-патогенних мікроорганізмів: актуальність, умови виникнення, шляхи подолання. Інфекційні хвороби. № 4. С. 63-71. Doi:10.11603/1681- 2727.2019.4.10965.

2. Schooley, Robert T.; Biswas, Biswajit; Gill, Jason J.; Hernandez-Morales, Adriana; Lancaster, Jacob; Lessor, Lauren; Barr, Jeremy J.; Reed, Sharon L. та ін. Development and Use of Personalized Bacteriophage-Based Therapeutic Cocktails To Treat a Patient with a Disseminated Resistant Acinetobacter baumannii Infection. Antimicrobial Agents and Chemotherapy (American Society for Microbiology) 61 (10): e00954-17. ISSN 0066-4804. PMC 5610518. PMID 28807909. doi:10.1128/aac.00954-17.

3. Pharmacologic Agents for Chronic Diarrhea. Intestinal Research 13 (4): 306-312. October 2015. PMC 4641856. PMID 26576135. doi:10.5217/ir.2015.13.4.306.

4. Широбоков В. П., Янковський Д. С., Димент Г. С. Світ глин і здоров'я людини. Світогляд. 2012. №2 (34). С. 6-17.

5. Широбоков В. П., Янковський Д. С., Димент Г. С. На зорі зародження життя: роль глинистих мінералів. Світогляд. 2013. №1 (39). С. 58-65.

6. Широбоков В. П., Понятовський В. А., Яворовський О. П., Янковський Д. С., Димент Г. С., Бобир В. В. Вплив гелю бентоніту на фізіологічні показники лабораторних мишей. Медичні перспективи. 2018. Т.23, №4. С. 4-11. Doi. 10.26641/2307-0404.2018.4.152924.

7. Tanka P. Prasai, Kerry B. Walsh. Biochar, Bentonite and Zeolite Supplemented Feeding of Layer Chickens Alters Intestinal Microbiota and Reduces Campylobacter Load. PLoS ONE 11(4): e0154061. https://doi.org/10.1371/journal.

8. Вивчення спеціальної активності протимікробних лікарських засобів. Методичні рекомендації. Київ. 2004. 38с.

References

1. Romaniuk L.B., Kravets N.Ia.,. Klymniuk S.I, Kopcha V.S., Dronova O.I.. Antybiotykorezystentnist umovno-patohennykh mikroorhanizmiv: aktualnist, umovy vynyknennia, shliakhy podolannia [Antibiotic resistance of opportunistic pathogens: relevance, conditions of occurrence, ways to overcome]. Infektsiini khvoroby. № 4. S. 63-71. Doi:10.11603/1681-2727.2019.4.10965. [in Ukrainian]. '

2. Schooley, Robert T.; Biswas, Biswajit; Gill, Jason J.; Hernandez-Morales, Adriana; Lancaster, Jacob; Lessor, Lauren; Barr, Jeremy J.; Reed, Sharon L. та ін. Development and Use of Personalized Bacteriophage-Based Therapeutic Cocktails To Treat a Patient with a Disseminated Resistant Acinetobacter baumannii Infection. Antimicrobial Agents and Chemotherapy (American Society for Microbiology) 61 (10): e00954-17. ISSN 0066-4804. PMC 5610518. PMID 28807909. doi:10.1128/aac.00954-17.

3. Pharmacologic Agents for Chronic Diarrhea. Intestinal Research 13 (4): 306-312. October 2015. PMC 4641856. PMID 26576135. doi:10.5217/ir.2015.13.4.306.

4. Shyrobokov V.P., Yankovskyi D.S., Dyment H.S. Svit hlyn i zdorovia liudyny [The world of clay and human health]. Svitohliad. 2012. №2 (34). S. 6-17. [in Ukrainian].

5. Shyrobokov V. P., Yankovskyi D. S., Dyment H. S. Na zori zarodzhennia zhyttia: rol hlynystykh mineraliv [At the dawn of life: the role of clay minerals]. Svitohliad. 2013. №1 (39). S. 58-65. [in Ukrainian].

6. Shyrobokov V.P., Poniatovskyi V.A., Yavorovskyi O. P., Yankovskyi D.S., Dyment H.S., Bobyr V. V. Vplyv heliu bentonitu na fiziolohichni pokaznyky laboratornykh myshei [The influence of bentonite gel on the physiological parameters of laboratory mice]. Medychni perspektyvy. 2018. T.23, №4. S. 4-11. Doi. 10.26641/2307-0404.2018.4.152924. [in Ukrainian].

7.. Tanka P. Prasai, Kerry B. Walsh. Biochar, Bentonite and Zeolite Supplemented Feeding of Layer Chickens Alters Intestinal Microbiota and Reduces Campylobacter Load. PLoS ONE 11(4): e0154061. https://doi.org/10.1371/journal.

8. Vyvchennia spetsialnoi aktyvnosti protymikrobnykh likarskykh zasobiv. Metodychni rekomendatsii. Kyiv. 2004. 38s. [in Ukrainian].

Размещено на Allbest.ru