Захист еритроцитів пуповинної крові людини при наднизькій температурі

Размещено на http://allbest.ru

ЗАХИСТ ЕРИТРОЦИТІВ ПУПОВИННОЇ КРОВІ ЛЮДИНИ ПРИ НАДНИЗЬКІЙ ТЕМПЕРАТУРІ

Т.О. Калиниченко, М.Ю. Аношина, Г.Т. Глухенька

ДУ «Інститут гематології та трансфузіології НАМН України», Київ

Резюме. Мета. Дослідити ефективність заморожування еритроцитів пуповинної крові (ПК) людини при наднизькій температурі з використанням екстрацелюлярних та внутрішньоклітинних кріопротекторів та їх сумішей.

Методи. Низькотемпературне зберігання еритроцитів ПК здійснювали під захистом кріопротекторів полівінілпіролідон (ПВП), гліцерин, диметилсульфоксид (ДМСО), а також комбінацій ПВП з низькими концентраціями ДМСО або гліцерину. Використані морфологічні, біохімічні, статистичні методи дослідження.

Результати. Вміст еритроцитів у деконсервованих зразках еритроконцентрату, що зберігався під захистом розчинів 10% ПВП, 20% гліцерину, 5 і 10% ДМСО складав відповідно (0,95 ± 0,16)10⁹/мл, (2,01 ± 0,22)10⁹/мл, (1,15 ± 0,18)^10⁹/мл, (2,53 ± 0,22)^10⁹/мл. Найбільша збереженість еритроцитів встановлена при застосуванні комбінації ПВП з 5% ДМСО (вміст еритроцитів - (3,11 ± 0,56)10⁹/мл), що значно (р < 0,001) перевищувало результати кріоконсервування інших груп.

Висновки. Комбінація полімеру ПВП та проникаючого кріопротектора ДМСО у низькій концентрації є дієвою умовою захисту еритроцитів ПК при наднизькій температурі з точки зору отримання високих кількісно-якісних характеристик розмороженого матеріалу.

Ключові слова: кріоконсервування, еритроцити, пуповинна кров, перекисне окислення ліпідів, комбіновані кріозахисні розчини.

ЗАЩИТА ЭРИТРОЦИТОВ ПУПОВИННОЙ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА ПРИ СВЕРХНИЗКОЙ ТЕМПЕРАТУРЕ

Т.А. Калиниченко, М.Ю. Аношина, Г.Т. Глухенькая

ГУ «Институт гематологи и трансфузиологии НАМН Украины», Киев

Резюме. Цель. Изучить эффективность замораживания эритроцитов пуповинной крови (ПК) человека при сверхнизкой температуре с использованием экстрацеллюлярных и внутриклеточных криопротекторов и их смесей.

Методы. Низкотемпературное хранение эритроцитов ПК выполняли под защитой криопротекторов поливинил-пирролидон (ПВП), глицерин, диметил-сульфоксид (ДМСО), а также комбинаций ПВП с низкими концентрациями

ДМСО или глицерина. Использованы морфологические, биохимические, статистические методы исследования.

Результаты. Содержание эритроцитов в деконсервированных образцах эритроконцентрата, хранившегося под защитой 10% ПВП, 20% глицерина, 5 і 10% ДМСО составляло соответственно (0,95 ± 0,16)10⁹/мл, (2,01 ± 0,22)10⁹/мл, (1,15 ± 0,18)10⁹/мл, (2,53 ± 0,22)10⁹/мл. Наибольшая сохранность эритроцитов выявлена при применении комбинации ПВП с 5% ДМСО (содержание эритроцитов - (3,11 ± 0,56)10⁹/мл), что значительно (р < 0,001) превышало результаты криоконсервирования в других группах.

Выводы. Комбинация полимера ПВП и проникающего криопротектора ДМСО в низкой концентрации является действенным условием защиты эритроцитов ПК при сверхнизкой температуре с точки зрения получения высоких количественно-качественных характеристик размороженного материала.

Ключевые слова: криоконсервирование, эритроциты, пуповинная кровь, перекисное окисление липидов, комбинированные криозащитные растворы.

PROTECTION OF HUMAN UMBILICAL CORD BLOOD ERYTHROCYTES AT ULTRALOW TEMPERATURE

T.O. Kalynychenko, M. Yu. Anoshyna, G.T. Glukhen'ka

SI «Institute of Hematology and Transfusiology of NAMS of Ukraine», Kyiv

Summary. Aim. To examine the effectiveness of freeze human cord blood erythrocytes (HCBE) at ultralow temperature with extracellular and intracellular cryoprotectant as well as their mixtures.

Methods. Low temperature storage of HCBE was performed under the protection of polyvinylpyrrolidone (PVP), glycerol, dimethyl sulfoxide (DMSO), and of PVP combinations with DMSO or glycerol at the lower concentrations. The morphological, biochemical, statistical research methods were applied.

Results. Red blood cell content in the thawed the concentrate samples stored under the protection of 9% PVP, 20% glycerol, 5% and 10% DMSO, respectively, was (0.95 ± 0.16)10⁹/ml, (2.01 ± 0.22)10⁹/ ml, (1.15 ± 0.18)d0⁹/ml, (2.53 ± 0.22)10⁹/ml. The highest erythrocytes safety was revealed at the application of PVP combination with 5% DMSO (the red blood cell content - (3.11 ± 0.56) * 10⁹ / ml), that exceed significantly the cryopreservation results of other groups (p <0.001).

Conclusions. The combination of the polymer - PVP and penetrating cryoprotectant - DMSO at the low concentration is an effective prerequisite for the protection of HCBE at ultralow temperature in terms of receiving of the high quantitative and qualitative material characteristics.

Key words: cryopreservation, erythrocytes (red blood cells), umbilical cord blood, lipid peroxide oxidation, combined cryoprotective solutions.

заморожування еритроцити пуповинна кров кріопротектори

Створення резерву запасів компонентів крові є стратегічним завданням сучасної виробничої трансфузіології [3, 8]. Пуповинна кров (ПК) може розглядатися в якості джерела еритроцитарних компонентів крові, що мають перспективу застосування у ранньому дитячому віці для корекції газотранспортної функції крові при травмах і багатьох захворюваннях [6, 7, 13]. Найнадійнішим способом зберігання матеріалу протягом тривалого часу вважається його консервація у стані глибокого анабіозу. У виробництві такі умови забезпечуються на обладнанні, що працює з використанням рідкого азоту та його парів.

Існує пряма залежність кінцевого результату кріоконсервації від процесів, що відбуваються у біологічному об'єкті під час охолодження. Традиційно для попередження розвитку кріоушкодження клітин та забезпечення їх збереженості після розморожування використовуються кріозахисні агенти - кріопротектори. При цьому практичним завданням є досягнення найбільшої збереженості об'єкту кріоконсервування за умови підбору ефективного кріопротектора у найнижчій дієвій концентрації [5].

Мета - дослідити ефективність заморожування еритроцитів ПК людини при наднизькій температурі з використанням екстрацелюлярних та внутрішньоклітинних кріопротекторів та їх сумішей.

Матеріали і методи досліджень. Об'єкт досліджень - еритроконцентрат (ЕК) ПК людини. Заготівлю ПК здійснювали за загальноприйнятою методикою у «замкненій» системі пластикових мішків з обов'язковим виконанням специфічних вимог і етичних принципів [4, 14]. ЕК отримували з використанням методики прискореної седиментації еритроцитів [9].

До готового ЕК додавали один із кріопротекторних розчинів: 40% розчин гліцерину (кріоконсервант ЦНПГПК1І5-М), 18% розчин низькомолекулярного полівінілпіролідону (ПВП) (молекулярна маса 8000, кріоконсервант КІПК), 10 або 20% розчин диметилсульфоксиду (ДМСО) у плазмозаміннику «Реополіглюкін», що є 10% розчином декстрану (молекулярна маса 30000 - 45000). Окрім того використовували суміші кріопротекторів: 20% ПВП із 10% ДМСО або 20% ПВП із 20% гліцерину. Дотримання співвідношення ЕК і кріозахисного розчину як 1:1 знижувало робочу концентрацію кріопротектора вдвічі. Підготовлену до низькотемпературного зберігання завись еритроцитів (ЗЕ) розливали у кріопробірки ємністю 4,5 мл і заморожували до температури мінус 196 °С шляхом швидкого занурення у рідкий азот. Розморожування проводили на водяній бані при температурі (40 ± 2)°С. Видалення внутрішньо - клітинних кріопротекторів - гліцерину (у кінцевій концентрації 20%) і ДМСО (у кінцевій концентрації 10%) проводили методом серійного (триразового) центрифугування з використанням сольових гіпертонічних розчинів [5]. При зменшенні концентрації ДМСО до 5% процедуру скорочували. У якості розчину для відмивання зразків ЗЕ, що заморожували під захистом ПВП, використовували ізотонічний сольовий розчин. Відмиті еритроцити розводили у зважуючому розчині (0,9% NaCl). Виходячи з принципів виробничої трансфузіології, оцінку якості розморожених відмитих еритроцитів (РВЕ) здійснювали за вмістом вільного гемоглобіну (Hb), а також показниками: гематокриту (Ht) [10, 11], кількості еритроцитів, їх осмотичної резистентності (у 0,45% розчині NaCl); активності процесів перекисного окислення нейтральних ліпідів та фосфоліпідів. Останні оцінювали за вмістом ізольованих подвійних зв'язків (ІПЗ), дієнових, триєнових, оксодієнових кон'югатів (ДК, ТК, ОДК), кінцевих продуктів ПОЛ типу шифових основ (ШО). Вміст Hb_v визначали за методом [12], а показники перекисного окислення ліпідів (ПОЛ) - за модифікованим спектрофотометричним методом І.А. Волчегорського зі співавт. [1]. У обох випадках здійснювали перерахунок на вміст еритроцитів у одиниці об'єму суспензії.

Статистичну обробку здійснювали методом варіаційної статистики з використанням комп'ютерної програми Microsoft Excel XP.

Результати та їх обговорення. Використані в дослідженні кріопротектори відрізняються за механізмом захисної дії, що прямо залежить від здатності молекули речовини проникати в клітину. Так, полімерна речовина ПВП є обволікаючою (екстрацелюлярною) речовиною, а ДМСО і гліцерин - внутрішньоклітинними або проникаючими кріопротекторами. Результати заморожування з розчинами, що містять одну з вказаних речовин, використовували в якості базового контролю.

Прогнозовано кращі показники щодо вмісту вільного гемоглобіну в надосадовій рідині РВЕ були продемонстровані під захистом проникаючих у клітину речовин - гліцерину у 20% кінцевій концентрації! і ДМСО у 10% концентрації (відповідно (0,78 ± 0,13)П0^-11 г та (0,34 ± 0,09)-10^-11 г) (Рис. 1). Однак при зниженні концентрації ДМСО до 5% цей показник різко зростав до (7,26 ± 0,75)-10^-11 г (р < 0,001). Після заморожування-відтаювання у присутності 9% ПВП, що не проникає до клітини, а обволікає її, показник вільного Hb досягав (12,94 ± 1,12)П0^-11 г. Додавання до базового розчину ПВП низької концентрації одного з ендоцелюлярних кріопротекторів (ДМСО або гліцерину), приводило до зменшення показника відповідно до (0,20 ± 0,02)-10^-11 г та (2,51 ± 0,10)П0^-11 г (р < 0,001).

Рис. 1 - Вміст вільного гемоглобіну у зразках розморожених відмитих еритроцитів.

Примітка. * - Вірогідна різниця між показниками різних груп.

10⁹/мл

Рис. 2 - Вміст вільного гемоглобіну у 1 мл зразка розморожених відмитих еритроцитів.

Примітка. * - Вірогідна різниця між показниками груп зразків, що заморожували з одним кріопротектором та групою зразків, що зберігались під захистом суміші кріопротекторів ПВП і ДМСО.

Показники Ht зразків після заморожування з 20% гліцерину, 10% ДМСО, а також із сумішшю ПВП і ДМСО були вищими (відповідно - 0,41 ± 0,01; 0,42 ± 0,02; 0,46 ± 0,05). При цьому результат у останній групі зразків вірогідно (р < 0,001) відрізнявся порівняно зі всіма іншими варіантами кріоконсервування.

При застосуванні «коктейлів» кріопротекторів покращення результату збереженості еритроцитів відбулось тільки у групі зразків, що заморожували при поєднанні ПВП і ДМСО. Так, вміст еритроцитів у 1 мл РВЕ і їх загальна кількість у пробі в цьому випадку суттєво (р < 0,001) перевищували результати кріоконсервування інших груп зразків (рис. 2, 3). Вживання комбінації ПВП з гліцерином не продемонструвало ефективного захисту. Присутність гліцерину у низькій концентрації не покращила результат кріоконсервування, отриманий під захистом 9% ПВП (вміст еритроцитів у 1 мл зразка відповідно - (0,76 ± 0,14)-10⁹/мл і (0,95 ± 0,16)-10⁹/мл).

Разом з тим, не було статистично достовірної різниці щодо осмотичної резистентності РВЕ ((68,9 ± 2,7)% - для групи під захистом суміші ПВП і ДМСО, (70,0 ± 5,4)% - ПВП і гліцерину, (64,3 ± 5,6)% - окремо гліцерину, (74,0 ± 2,0)% - окремо 5% ДМСО).

Рис. 3 - Загальна кількість еритроцитів у пробі.

Примітка. * - Вірогідна різниця між показниками груп зразків, що заморожували з одним кріопротектором та групою зразків, що зберігались під захистом суміші кріопротекторів ПВП і ДМСО.

Відомо, що адаптаційні можливості мембран еритроцитів щодо дії факторів кріоконсервування напряму залежать від їх стану. До механізмів, що спричиняють у кінцевому результаті холод-індукований гемоліз клітин, відносяться як пряма руйнація частини мембранних фосфоліпідів при заморожуванні-відігріванні, так і їх вільнорадикальне окислення. Це, в свою чергу, викликає розвиток низькотемпературних патохімічних процесів у мембранах клітин та призводить до накопичення продуктів їх деградації [2]. Специфічний кріозахист за допомогою підбору кріопротекторних розчинів є одним із шляхів вирішення зазначеної проблеми. Тому, для оцінки стану мембран еритроцитів був використаний метод дослідження активності процесів ПОЛ.

Показники перекисного окислення ліпідів у розмороженій еритроцитарній зависі ПК після консервування з кріопротекторами різного механізму дії (М+ш)

Примітки: (- А) - означає підвищення показника після розморожування;

А^1,2,3 - різниця показників до та після розморожування (відповідно р < 0,001; р < 0,01; р < 0,05); І група - зразки, що кріоконсервували під захистом ПВП у кінцевій концентрації 9% (n = 15); ІІ група - під захистом гліцерину у кінцевій концентрації 20% (n = 35); ІІІ група - під захистом ДМСО у кінцевій концентрації 5% (n = 35); IV група - під захистом ДМСО у кінцевій концентрації 10% (n = 35); V група - під захистом суміші ПВП із ДМСО у кінцевих концентраціях відповідно 10% і 5% (n = 8); VI група - під захистом суміші ПВП із гліцерином (обидва кріопротектори - у кінцевих концентраціях 10%) (n = 8).

Найкращі результати за показниками ПОЛ були виявлені в V групі зразків, що зберігали під захистом комбінації ПВП та ДМСО. У цих РВЕ рівень ІПЗ, а також показник різниці (А) до та після розморожування були найнижчими. Концентрації ТК і ОДК у зразках цієї групи після відтаювання суттєво знижувались (р < 0,001). Також гарну збереженість мембрани еритроцитів за показниками ПОЛ виявлено у зразках, що заморожували з гліцерином та ДМСО у більшій концентрації.

Таким чином, результати дослідження кріоконсервування еритроцитів за показниками їх вмісту, вільного Hb та Ht зразків, а також концентрацією молекулярних продуктів ПОЛ прогнозовано підтверджують ефективність захисту еритроцитів ПК від факторів кріоконсервування при вживанні 20% розчину ДМСО у 10% розчині декстрану («Реополіглюкін») і 40% розчину гліцерину (кріоконсервант ЦШІГПКП5-М). Разом з тим, враховуючи токсичність ДМСО у високій концентрації [16], а також наявність питання економічної ефективності і доступності технологій кріоконсервування еритроцитів з гліцерином через трудомісткість та тривалість процесу гліцеринізації-дегліцеринізації [15, 17], існує необхідність пошуку інших шляхів досягнення подібних позитивних результатів. Результатами дослідження показано недостатню ефективність захисної дії ПВП. Суттєвим недоліком групи екстрацелюлярних кріопротекторів, до яких відноситься цей полімер, спеціалісти вважають спричинення надмірної дегідратації клітин, інтенсивність осмотичного стресу [10, 11]. Одним із напрямів уникнення перелічених негативів є використання комбінованої дії кріопротекторних речовин [18].

Ефективність кріоконсервантів, що вміщують одночасно проникаючий кріопротектор і полімер, пояснюється доповненням та врівноваженням дії кожного з них [10, 11]. Так, фахівці стверджують, що комбінація у середовищі заморожування таких речовин сприяє послабленню осмотичного стресу при заморожуванні. Цим можна пояснити значне покращення кріозахисної ефективності ПВП і низької концентрації ДМСО при їх застосуванні в запропонованому нами у цьому дослідженні комбінованому розчині.

Однак, принцип покращення наслідків кріоконсервування при змішуванні кріопротекторів різного механізму дії спостерігається не в усіх випадках. Результат залежить від природи, а також біохімічних властивостей компонентних речовин. Цьому підтвердженням є недостатня кріозахисна ефективність при ультранизькій температурі «коктейлю» ПВП і гліцерину. Скоріш за все, пояснення цьому слід шукати у конкурентній дії вживаних речовин на мембрану клітини: у властивій для гліцерину «спорідненості» до ліпідів, взаємодії з ліпідним бішаром, наявності високого осмотичного тиску його розчинів [5]. Механізми кріозахисту комбінованих кріопротекторних розчинів потребують додаткових ґрунтовних досліджень.

Висновки

1. Розчини ендоцелюлярних кріопротекторів ДМСО та гліцерину відповідно у 20 та 40% концентраціях мають високу кріозахисну ефективність щодо зберігання еритроцитів ПК при ультранизькій температурі.

2. Комбінація обволікаючого низькомолекулярного ПВП і ендоцелюлярного ДМСО у кінцевій концентрації 5% демонструє високі параметри кріозахисту еритроцитів ПК. При цьому підвищення кількісно- якісних характеристик РВЕ ПК відбувається, в тому числі і за рахунок мінімізації можливості токсичних впливів.

3. Слабка кріозахисна ефективність комбінації протекторів різного механізму дії - ПВП і гліцерину щодо зберігання еритроцитів ПК при ультранизькій температурі може пояснюватись їх конкурентним впливом на клітинну мембрану.

Література