Оцінка стану стромального мікрооточення та кісткових структур у дітей з гострими лейкеміями

Размещено на http://allbest.ru

¹ ДУ «Національний науковий центр радіаційної медицини

НАМН України», Київ

² Інститут біохімії ім.О.В.Палладіна НАН України, Київ

Оцінка стану стромального мікрооточення та кісткових структур у дітей з гострими лейкеміями

В.Г. Бебешко¹, К.М. Бруслова¹,Т.Т. Володіна², Н.М. Цвєткова¹,

Т.І. Пушкарьова¹, Л.М. Панченко¹, С.М. Яцемирський¹

Резюме

Оцінка стану стромального мікрооточення та кісткових структур у дітей з гострими лейкеміями

Мета. Вивчення стану стромального мікрооточення та складу гідроксиапатиту кісткової тканини у дітей з ГЛ з урахуванням їх ендокринної регуляції, медіани виживаності та обґрунтування сучасних методів корекції цих порушень

Матеріали і методи. Обстежено 99 хворих на ГЛ в І гострий період захворювання та ремісію. До групи порівняння увійшло 32 дитини без гематологічної патології.

Вивчали ефективність колонієутворення стромальних фібробластів, склад амінокислот в сечі, інфрачервоні спектри сухого залишку добової сечі; кальцій, загальний білок, рівень кортизолу, ТТГ АКТГ в сироватці крові, щільність кісткової тканини, дози опромінення хворих та застосовували методи математичної статистики.

Результати. Ефективність колонієутворення стромальних фібробластів кісткового мозку у дітей в І гострий період лейкемій була в 2,0-2,4 рази нижча порівняно зі здоровими дітьми.

Встановлено кореляційний зв'язок між концентрацією кортизолу в сироватці крові у дітей та показником ефективності колонієутворення стромальних фібробластів (rs= + 0,47).

У дітей з ГЛ, у яких рівень кортизолу в сироватці крові був нормативним, медіана виживаності складала 76,1+2,2 міс., при зниженому рівні кортизолу медіана виживаності хворих була найкоротшою -21,8+2,2 міс. Визначені дисбаланс амінокислот, підвищена екскреція фосфатів кальція в сечі та знижена щільності кісток у детей.

Висновок. Доведені зміни в стромальному мікрооточенні, метаболізмі кісток у дітей з ГЛЛ та ГМЛ залежно від рівня кортизолу, встановлено зв'язок показників з медіаною виживаності хворих та обґрунтуванні методи корекції цих порушень.

Ключові слова: діти, гострі лейкемії, стромальне мікрооточення, структура кісток, кортизол, тиреотропний гормон гіпофізу, лікувальні заходи

Резюме

Оценка состояния стромального микроокружения и костных структур у детей с острыми лейкемиями

В.Г. Бебешко¹, Е.М. Бруслова¹, Т.Т. Володина², Н.М. Цветкова¹,

Т.И. Пушкарева¹, Л.М. Панченко¹, С.М. Яцемирский¹

¹ ГУ«Национальный научный центр радиационной медицины НАМН Украины», Киев

² Институт биохимии им.А.В.Палладина НАН Украины, Киев

Цель. Изучение состояния стромального микроокружения и состава гидроксиапатита костной ткани у детей с ОЛ с учетом их эндокринной регуляции, медианы выживаемости и обоснование современных методов коррекции этих нарушений.

Материалы и методы. Обследовано 99 больных ОЛ в I острый период заболевания и ремиссию. В группу сравнения вошло 32 ребенка без гематологической патологии. Изучали ЭКОЕф, состав аминокислот в моче, инфракрасные спектры сухого остатка суточной мочи; кальций, общий белок, уровень кортизола, ТТГ АКТГ в сыворотке крови, плотность костной ткани, дозы облучения больных и применяли методы математической статистики.

Результаты. Эффективность колониеобразования стромальных фибробластов костного мозга у детей в I острый период лейкемий была в 2,0-2,4 раза ниже по сравнению со здоровыми детьми. Установлена корреляционная связь между концентрацией кортизола в сыворотке крови у детей и показателем эффективности колониеобразования стромальных фибробластов (rs = + 0,47).

Ключевые слова: дети, острые лейкемии, стромальное микроокружение, структура костей, кортизол, тиреотропный гормон гипофиза, лечебные мероприятия.

Summary

Evaluation of stromal microenvironment and bone structure in children with acute leukemia.

V.G. Bebeshko¹, E.M. Bruslova¹, T.T. Volodina, N.M. Tsvetkova¹,

T.I. Pushkareva¹, L.M. Panchenko¹, C.M. Jatsemyrsky¹

¹ SI«National research centre for radiation medicine NAMS Ukraine », Kyiv 2 Palladia Institute of Biochemistry of the NAS of Ukraine, Kyiv

Aim. The study of the state of the stromal microenvironment and structure of hydroxyapatite bone in children with AL in accordance with their endocrine regulation, median survival andjustification ofmodern methods of correcting these violations.

Materials and methods. The study involved 99 patients with AL in I acute period and remission. The comparison group included 32 children without hematological pathology. Studied ECFSf composition of amino acids in the urine, the infrared spectra of a dry residue of daily urine; calcium, total protein, cortisol, ACHP, TSH in serum, bone tissue density, dose patients and statistical methods used.

Results. The effectiveness of colony stromal fibroblasts of bone marrow in children in the acute phase of leukemia I was -2.4 2.0 times lower compared with healthy children. Established correlation between the concentration of serum cortisol in children and indicator of the effectiveness of stromalfibroblast colony (rs = + 0,47).

Keywords: children, acute leukemia, stromal microenvironment, bone structure, cortisol, thyroid-stimulating hormone pituitary, therapeutic measures.

Вступ

Встановлені механізми регенерації кісткової тканини та процесів остеогенезу. Доведена роль стромальних фібробластів у колагеноутворенні, структурній цілісності сполучної тканини та процесах диференціювання і проліферації гемопоетичного мікрооточення [2]. Досліджується також їх роль у формуванні ніш для фізіологічного функціонування гемопоезу [3]. Вивчено вплив кортизолу на розвиток остеопорозу у людей. Однак майже немає робіт, в яких йдеться мова про біохімічні та біофізичні зміни структури кісток у дітей з гострими лейкеміями (ГЛ) залежно від ініціального рівня кортизолу, варіантів ГЛ, медіани виживаності та доз опромінення [1]. Залишаються також не вирішеними питання пошуку методів корекції структурних змін кісткової тканини при лейкеміях.

Метою роботи було вивчення стану стромального мікрооточення та складу гідроксиапатиту кісткової тканини у дітей з ГЛ з урахуванням їх ендокринної регуляції, медіани виживаності та обґрунтування сучасних методів корекції цих порушень.

Матеріали і методи

Було обстежено 99 хворих на ГЛ віком від 3 до 18 років. З них: з гострою лімфобластною лейкемією (ГЛЛ) 73 дитини, мієлобластною (ГМЛ) 26 осіб.

Обстеження проводились в І гострий період захворювання до початку лікування (n 83) та фазу ремісії (n-16). До групи порівняння увійшло 32 дитини того ж віку без гематологічної патології.

Показники мієлограми та гемограми досліджувались в мазках кісткового мозку та периферичної крові, забарвлених за Романовським-Гімзою, в світловому мікроскопі (збільшення n х 900). Ефективність колонієутворюючих одиниць фібробластів кісткового мозку (ЕКУОф) визначалась за методикою С.Я. Фріденштейна в модифікації В.С.Астахової (2001). фібробласт кістковий мозок лейкемія

Склад амінокислот в сечі досліджувався на аналізаторі амінокислот типу Т-339 (Чехія). Для визначення мінеральної компоненти кісткової тканини вивчались інфрачервоні спектри сухого залишку добової сечі на устаткуванні «ІЧС-31».

Визначався субпопуляційний склад імунокомпетентних клітин та експресія поверхневих антигенів за імунологічними маркерами (відділ клінічної імунології ІКР керівник відділу, чл.-кор.НАМНУ, д-р мед.наук, професор Д.А. Базика).

Біохімічні параметри сироватки крові: кальцій (Са), загальний білок визначали на біохімічному аналізаторі Humostar-600 (Германія). Рівень кортизолу, тиреотропного гормону (ТТГ) та адренокортикотропного гормону гіпофізу (АКТГ) в сироватці крові досліджувались за допомогою радіоімунного методу (RIA-Kits). Щільність кісткової тканини визначалась на денситометрі Ultrasonometer Lunar (США). Дози опромінення хворих були розраховані згідно з даними «Загальнодозиметричної паспортизації населених пунктів України...».

Обробка отриманих матеріалів проводилась за методами математичної статистики (коефіцієнт кореляції Ст'юдента, Спірмена, метод інтервального оцінювання), формулою Байєса.

Результати та обговорення

Результати дослідження ЕКУОф кістко-вого мозку у 58 хворих на ГЛ, показали, що вона була достовірно нижчою за нормативну і становила 24,6+1,7 проти 47,3+2,3 (серед 10⁵ ядровмісних клітин) порівняно зі здоровими дітьми (р<0,05). В І гострий період захворювання ЕКУОф дорівнювала 19,8+2,2, фазу ремісії 29,3+2,1 (серед 10⁵ ядровмісних клітин).

Оцінка індивідуальних значень ЕКУОф кісткового мозку показала, що в І гострому періоді у 70% хворих показники ЕКУОф знаходились в межах від 0,1 до 19,0 (серед 10⁵ ядровмісних клітин).

В період ремісії майже у всіх дітей показник підвищувався і був в інтервалі від 10,0 до 38,0 (серед 10⁵ ядровмісних клітин), однак не досягав нормативних значень. У деяких хворих, у яких ЕКУОф була вищою за 50,0 (серед 10⁵ ядровмісних клітин) в подальшому спостерігався несприятливий перебіг ГЛЛ.

Встановлений прямий кореляційний зв'язок між числом еритроїдних клітин-попередників в мієлограмі у хворих (проеритробластів, еритробластів, нормоцитів) та вмістом проліну в стромальних фібробластах, вирощених in vitro (r_s=+0,83).

Між іншими амінокислотами, що входять до складу стромальних фібробластів, та числом мієлоїдних клітинпопередників в кістковому мозку зв'язку не було. Тобто, стромальні фібробласти кісткового мозку відіграють суттєву роль в функціонуванні клітин-попередників еритроїдного ряду у хворих на гострі лейкемії.

Як видно з табл.1, екскреція амінокислот в сечі хворих пов'язана з періодом обстеження. Відомо, що пролін, лізин, оксипролін, гліцин, глютамінова та аспарагінова кислоти відображають стан стуктури колагену, в тому числі і кісткового. В дебюті захворювання у хворих був підвищений рівень лізину, проліну, оксипроліну, глютамінової кислоти при дефіциті гліцину та аспарагінової кислоти в сечі порівняно з контрольною групою спостереження.

Таблиця 1 Вміст амінокислот в сечі у хворих на ГЛ в різні періоди захворювання (М+m)

Примітки: * різниця між І гострим періодом та групою порівняння;

** різниця між ремісією та групою порівняння (р<0,05).

В усі періоди спостереження екскреція проліну з сечею у хворих на ГЛ, який є попередником оксипроліну, була підвищеною, що вказує на прискорення процесу розпаду колагену.

Слід зупинитися на екскреції тирозину з сечею, який приймає участь в продукції адреналіну та норадреналіну. Зниження його вмісту у хворих в період ремісії відбувається за рахунок функціональної неповноцінності кори наднирників після лікування хворих на ГЛЛ високими дозами преднізолону протягом тривалого часу (8-10 тижнів) згідно з протоколом.

Нами визначалась екскреція фосфатів кальцію в сечі та іонізованого кальцію в сироватці крові у дітей в різні фази хвороби. Результати обстеження показали, що рівень іонізованого кальцію в І гострий період захворювання був нижчим, ніж у осіб групи порівняння (0,81+0,03 ммоль/л проти 0,98+0,10 ммоль/л) (р<0,05). Це можна пояснити дефіцитом його в організмі за рахунок аліментарного фактору, вживанням кортикостероїдів, змінами в амінокислотному складі сечі та відповідно білковій компоненті структури кісткової тканини. В період ремісії рівень його не розрізнявся з групою порівняння.

Екскреція фосфатів кальцію з сечею у хворих на ГЛ була вищою порівняно зі здоровими дітьми, особливо це стосується більш розчинних форм, зокрема дигідрофосфатів кальцію та дигідрофосфатів тетрагідратів кальцію. Крім того, у хворих на ГМЛ вміст дигідрофосфатів кальцію та дигідрофосфатів тетрагідратів кальцію в сечі був вищим порівняно з дітьми з ГЛЛ (р <0,05).

Нами вивчались деякі показники ендокринної системи у хворих на ГЛ залежно від періоду захворювання (табл.2).

Таблиця 2 Рівні гормонів в сироватці крові у хворих на ГЛ залежно від періоду захворювання (М+m)

Примітка. * різниця з показниками в групі порівняння (р<0,05).

Оцінка середніх величин визначених показників показала, що рівень кортизолу в сироватці крові у хворих на ГЛ не розрізнявся порівняно з контрольною групою, хоча в І гострий період захворювання його вміст був нижчий, ніж у дітей групи порівняння. В період ремісії вміст кортизолу не відрізнявся від нормативних значень (р<0,05).

Концентрація ТТГ в сироватці крові у дітей суттєво не розрізнялась між собою в усі періоди обстеження. Середні значення АКТГ в сироватці крові у хворих на гострі лейкемії як лімфобластні, так і мієлобластні, не відрізнялись і складали 11,1+1,0 пмоль/л. Ці величини не мали різниці з групою порівняння (14,2+1,7 пмоль/л).

Оцінка розподілу дітей за рівнем кортизолу в сироватці крові, наданого в трьох градаціях (до 200 нмоль/л, 200-500 нмоль/л та вищим за 500 нмоль/л), показала, що осіб з ГЛ з низькими рівнями кортизолу в І гострому періоді було більше, ніж серед дітей групи порівняння (градація І: 0,35-0,30-0,40; градація ІІ: 0,20-0,06-0,08). Аналогічний розподіл спостерігався у дітей з рівнем кортизолу вищому за 500 нмоль/л: кількість їх була більшою серед осіб без онкогематологічної патології.

Нами була проаналізована медіана виживаності у дітей з ГЛЛ з урахуванням ініціальних рівнів кортизолу в сироватці крові, визначених за трьома вищенаведеними градаціями. Найкоротша медіана (21,8+2,2 міс.) була притаманна дітям з низьким рівнем кортизолу. У дітей, у яких рівень кортизолу був в межах від 200 нмоль/л до 500 нмоль/л, вона становила в середньому 76,1+2,2 міс. У хворих з рівнем кортизолу в сироватці крові вищому за 500 нмоль/л медіана виживаності складала 62,4+2,3 міс. Встановлено кореляційний зв'язок між концентрацією кортизолу в сироватці крові у дітей та показником ЕКУОф (rs=+0,47).

Що стосується денситометрії кісткової тканини, як інтегрального показника стану органічного та мінерального матриксу, то в І гострий період хвороби, він був вірогідно нижчим, ніж у осіб групи порівняння. В період ремісії показник у хворих підвищувався, однак не досягав нормативних значень (р<0,05).

Дози опромінення дітей з ГЛ знаходились в межах від 0,12 мЗв до 36,0 мЗв (середні величини дорівнювали 4,25+0,63 мЗв). У хворих на ГЛЛ доза становила 3,86+0,63 мЗв, у хворих на ГМЛ 4,64+0,82 мЗв (р>0,05). Ми не встановили кореляційного зв'язку між дозами опромінення дітей, хворих на ГЛ, та показником ЕКУОф, рівнем кортизолу в сироватці крові і щільністю кісткової тканини (r= 0,06).

Таким чином, на етапах лікування хворих на ГЛ діагностовані зміни з боку метаболічних показників структури кісткової тканини. Враховуючи наявність змін в органічній та мінеральній компонентах кісток, нами був розроблений лікувальний комплекс для хворих, котрий вміщував: раціональне харчування; корекцію білкового складу за рахунок аліментарного фактору, харчових білкових сумішів; препарати на основі гліцину, який входить до складу колагену кісток (33%). При змінах в мінеральному складі гідроксиапатиту кісткової тканини призначались препарати дифосфату та дигідрофосфату кальцію, вітаміни Вб, В15, котрі приймають участь в нормалізації метаболічних процесів у кістковій тканині. Проводилась корекція ендокринного статусу у хворих.

Ефективність лікувальних заходів у хворих базувалась на оцінці стану опорно-рухового апарату дитини, рівню кальцію в сироватці крові, вмісту оксипроліну та гліцину в сечі, рівнів гормонів (кортизолу, тиреотропного гормону гіпофізу) та показника щільності кісток. При позитивному ефекті визначені показники нормалізувались до рівня вікових величин. Позитивний ефект спостерігався в І гострий період у 56,0% хворих, в фазу ремісії у 85,2%.

Висновки

1. ЕКУОф у дітей в І гострий період лейкемій була в 2,0-2,4 рази нижча порівняно зі здоровими дітьми (19,8+2,2 проти 47,3+2,2 серед 10⁵ ядровмісних клітин). Встановлено кореляційний зв'язок між концентрацією кортизолу в си-роватці крові у дітей та ЕКУОф (rs= + 0,47).

2. В І гострий період у половини дітей з ГЛ рівень оксипроліну в сечі був підвищений, гліцину знижений; екскреція дигідрофосфатів та дигідрофосфатів тетрагідратів кальцію в сечі була вища у дітей з ГМЛ порівняно з ГЛЛ. В І гострий період показник денситометрії був нижчий, ніж у осіб групи порівняння, в період ремісії він підвищувався, однак не досягав нормативних значень. Зміни в показниках свідчать про прояви остеопенії у хворих в дебюті хвороби.

3. У дітей з ГЛ, у яких рівень кортизолу в сироватці крові знаходився в межах від 200 нмоль/л до 500 нмоль/л, медіана виживаності складала 76,1+2,2 міс., у хворих з рівнем кортизолу більшим за 500 нмоль/л вона дорівнювала 62,4+2,3 міс., при зниженому рівні кортизолу в сироватці крові медіаною виживаності хворих була найкоротшою (21,8+2,2 міс.) (р <0,05).

4. Ефективність лікувальних заходів, спрямованих на корекцію порушень в показниках метаболізму кісткової тканини, залежала від періоду ГЛ: позитивний ефект спостерігався у 56,0% хворих в І гострий період, у 85,2% в фазу ремісії.

Література

1. Роль радіаційних та нерадіаційних факторів у розвитку та перебігу ГЛ у дітей [Текст] / В. Г. Бебешко, К. М. Бруслова, О. Є. Кузнецова [та ін.] // Лікувальна справа. 2012. № 7-8. С. 29-35.

2. Mesenchymal Stromal Cells Derived from the Bone Marrow of Acute Lymphoblastic Leukemia Patients Show Altered BMP4 Production: Correlations with the Course of Disease [Text] / V.Lopez, M.NohemfV.Garda [et al.] // Journal. Pone. 2014. N 6. P. 47-54.

3. Metabolomics of the Tumor Microenvironment in Pediatric Acute Lymphoblastic Leukemia [Text] / S. Tiziani, Y. Kang, R. Harjanto [et al.]// Plos one. 2013. Vol.8, Issue 12. P. 82859.

Размещено на Allbest.ru