Активність перекисного окислення ліпідів як індикатор збереженості еритроцитів пуповинної крові в процесі кріоконсервування

Размещено на http://www.allbest.ru/

ДУ «Інститут гематології та трансфузіології НАМН України»

АКТИВНІСТЬ ПЕРЕКИСНОГО ОКИСЛЕННЯ ЛІПІДІВ ЯК ІНДИКАТОР ЗБЕРЕЖЕНОСТІ ЕРИТРОЦИТІВ ПУПОВИННОЇ КРОВІ В ПРОЦЕСІ КРІОКОНСЕРВУВАННЯ

М.Ю. Аношина, Т.О. Калиниченко

Київ

Анотація

Резюме. Мета. Визначити активність процесів перекисного окислення ліпідів (ПОЛ) в еритроцитарній зависі пуповинної крові (ПК) на етапах кріоконсервування під захистом кріопротекторіврізного механізму дії.

Матеріали і методи. Низькотемпературне зберігання еритроцитів ПК здійснювали під захистом кріопротекторів полівінілпіролідону (ПВП), гліцерину, диметилсульфоксиду (ДМСО), а також комбінацій ПВП з низькими концентраціями ДМСО або гліцерину. Використані біохімічні та статистичні методи дослідження.

Результати. Встановлено, що застосування розчинів ендоцелюлярних кріопротекторів ДМСО та гліцерину у кінцевих концентраціях відповідно 10 та 20% сприяло зниженню активності ПОЛ на етапах процесу кріоконсервування. Найменший вміст продуктів пероксидації і вільного гемоглобіну виявлено при використанні комбінованого кріозахисного розчину на основі ПВП і ДМСО у співвідношенні 2:1 (сумарна кінцева концентрація - 15%), що вірогідно (р < 0,001) відрізнялося від інших результатів дослідження.

Висновки. Показники активності ПОЛ правомірно використовувати як індикатор збереженості еритроцитів пуповинної крові в процесі кріоконсервування.

Ключові слова: перекисне окислення ліпідів, кріоконсервування, еритроцити, пуповинна кров, комбіновані кріозахисні розчини.

Аннотация

АКТИВНОСТЬ ПЕРЕКИСНОГО ОКИСЛЕНИЯ ЛИПИДОВ КАК ИНДИКАТОР СОХРАННОСТИ ЭРИТРОЦИТОВ ПУПОВИННОЙ КРОВИ В ПРОЦЕССЕ КРИОКОНСЕРВИРОВАНИЯ

М.Ю. Аношина, Т.А. Калиниченко ГУ «Институт гематологии и трансфузиологии НАМН Украины», Киев

Резюме. Цель. Изучить активность процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) в эритроцитарной взвеси пуповинной крови (ПК) на этапах криоконсервирования под защитой криопротекторов различного механизма действия.

Материалы и методы. Низкотемпературное хранение эритроцитов ПК осуществляли под защитой криопротекторов поливинилпирролидона (ПВП), глицерина, диметилсульфоксида (ДМСО), а также комбинаций ПВП с низкими концентрациями ДМСО или глицерина. Использованы биохимические и статистические методы исследования.

Результаты. Установлено, что использование эндоцеллюлярных криопротекторов ДМСО и глицерина в конечным концентрациях соответственно 10 и 20% способствовало снижению активности ПОЛ на этапах процесса криоконсервирования. Наименьшее содержание продуктов пероксидации и свободного гемоглобина обнаружено при применении комбинированного криозащитного раствора на основе ПВП и ДМСО в соотношении 2:1 (суммарная конечная концентрация -15%), что достоверно (р < 0,001) отличалось от других результатов исследования.

Выводы Показатели активности ПОЛ правомерно использовать как индикатор сохранности эритроцитов пуповинной крови в процессе криоконсервирования.

Ключевые слова: перекисное окисление липидов, криоконсервирование, эритроциты, пуповинная кровь, комбинированные криозащитные растворы.

THE LIPID PEROXIDATION ACTIVITIES AS AN INDICATOR OF THE RED CORD BLOOD CELL SAFETY DURING THE CRYOPRESERVATION PROCESS

M. Yu. Anoshyna, T.O. Kalynychenko SI «Institute of Hematology and Transfusiology of NAMS of Ukraine», Kyiv

Aim. To analyze the activity of the lipid peroxidation (LPO) in the cord blood erythrocyte suspension at the stages of cryopreservation with the cryoprotectant that have the adifferent concepts of the action.

Materials and methods. The low temperature storage of cord blood red was performed under the protection of the polyvinylpyrrolidone (PVP), glycerol, dimethyl sulfoxide (DMSO), and under the combinations of PVP with the lower concentrations of DMSO or glycerol. We used the biochemical and statistical methods.

Results. It was found that the using ofpenetrating cryoprotectants DMSO and glycerol in the final concentrations of 10 and 20% was contributed to the decrease in the LPO activity at the stages of the process of the cryopreservation. The lowest values ofperoxidation products and the free hemoglobin were found when were using the combined cryoprotectant solution based on PVP and DMSO in a ratio of 2: 1 (the total final concentration - 15%), which was significantly (p <0.001) different from the other findings.

Conclusions. The indicators activity LPO is lawful to use as a red blood cell safety indicators in the umbilical cord blood cryopreservation process.

Keywords: lipid peroxidation, cryopreservation, erythrocytes (red blood cells), umbilical cord blood, combined cryoprotective solutions.

Вступ

пуповинний кров ліпід еритроцитарний

На сьогоднішній день пуповинна кров (ПК), що має високий гемопоетичний потенціал, широко використовується при лікуванні багатьох тяжких захворювань [8]. Цей біологічний матеріал може розглядатись як джерело еритроцитарного компоненту для трансфузій у ранньому дитячому віці. Як автологічне, так і алогенне використання ПК має свої переваги у порівнянні з периферичною кров'ю дорослого щодо інфекційної та імунологічної безпеки [3].

Відомо, що єдиним способом накопичення запасів ПК, у тому числі і її еритроцитарних компонентів, є кріоконсервування з максимальним збереженням структури і функції клітин. При цьому найнадійнішим індикатором зберігання є стан клітинних мембран. Багатьма дослідженнями показано, що розвиток деструктивних змін клітинних мембран перш за все пов'язаний з активацією процесів перекисного окислення ліпідів (ПОЛ). Висока життєздатність клітин підтримується рівновагою процесів ПОЛ та антиоксидантного захисту (АОЗ). Інтенсивність ПОЛ залежить від багатьох взаємозв'язаних факторів. До них належать як кисневе забезпечення клітини, так і ступінь ненасиченості жирних кислот (НЖК). Останній фактор є ендогенним біорегулятором широкого спектра біологічної дії, що в філогенезі визначає здатність до тривалої адаптації [2]. Враховуючи все вищезазначене, представлялось доцільним і науково обґрунтованим використання показників ПОЛ для оцінки збереженості мембран еритроцитів ПК при їх кріоконсервуванні.

Мета - визначити активність процесів ПОЛ в еритроцитарній зависі ПК на етапах кріоконсервування під захистом кріопротекторів різного механізму дії.

Матеріали і методи

Об'єкт досліджень - еритроцити ПК. Вилучення ПК проводили за умови отримання інформованої згоди при фізіологічних пологах після народження дитини та відділення її від посліду. Еритроконцентрат (ЕК) отримували з цільної стабілізованої розчином ЦФДА-1 ПК з використанням методики прискореної седиментації еритроцитів [5]. Для заморожування зразків використовували ряд кріопротекторних розчинів: полівінілпіролідону (ПВП) в кінцевій концентрації 10% (кріоконсервант КІПК) - для І-ї групи; гліцерину в кінцевій концентрації 20% (кріоконсервант ЦНІІГПКП5-М) - ІІ-ї групи; розчини диметилсульфоксиду (ДМСО) на «Реополіглюкіні» у кінцевих концентраціях 5% та 10% - відповідно для ІІІ-ї та rV-ї груп. Крім того, застосовували комбінації розчинів ПВП із ДМСО у співвідношенні 2:1 (сумарна кінцева концентрація кріопротекторів - 15%) та ПВП із гліцерином у співвідношенні 1:1 (сумарна кінцева концентрація кріопротекторів - 20%) для V-ї та VT-ї груп зразків відповідно. Підготовлену до низькотемпературного зберігання еритроцитарну завись (ЕЗ) розливали у кріопробірки і заморожували до температури мінус 196°С шляхом занурення у рідкий азот. Розморожували зразки ЕЗ на водяній бані при температурі (40 ± 2)°С. Видалення внутрішньоклітинних кріопротекторів гліцерину і ДМСО проводили загальноприйнятим методом триразового центрифугування з використанням сольових гіпертонічних розчинів з поступовим зниженням концентрації. Зразки ЕЗ, що заморожували під захистом ПВП, відмивали в ізотонічному сольовому розчині. Після ресуспендування еритроцитів у 0,9% розчині NaCl отримували розморожену відмиту еритроцитарну масу (РВЕМ). Вміст продуктів ПОЛ визначали за спектрофотометричним методом І.А. Волчегорського зі співавт. у нашій модифікації [1], який дозволяє здійснювати диференційоване визначення переокислення ацилів в структурі фосфоліпідів (екстрагованих до ізопропанольної фази) і неетерифікованих інтермедіатів пероксидації жирних кислот нейтральних ліпідів (екстрагованих до гептанової фази). Оптичну щільність кожної фази вимірювали на спектрофотометрі Helios а (Англія) при довжині хвилі (X) = 220 нм, що віддзеркалює концентрацію ІПЗ в субстратах ПОЛ. Вміст дієнових кон'югатів (ДК) вимірювали при X = 232 нм; триєнових (ТК) - при X = 268 нм, оксодієнових (ОДК) - при X = 278 нм, кінцевих продуктів ПОЛ типу шифових основ (ШО) - при X = 400 нм. Контролем були гептанова та ізопропанольна фази води. Показники надані у перерахунку на вміст еритроцитів у 1 мл суспензії клітин (цільній ПК, ЕЗ) у од. на 1 * 10⁹. Вміст вільного гемоглобіну (Hb) у зависі розморожених відмитих еритроцитів (ЗРВЕ) визначали за методом [4] у нашій модифікації і виражали в г/л у перерахунку на вміст еритроцитів. З метою проведення порівняльного аналізу активність ПОЛ досліджували на всіх етапах здійснення технології - від ЕЗ цільної ПК до РВЕМ. Статистичну обробку отриманих даних проводили за допомогою методів варіаційної статистики з використанням комп'ютерної програми Microsoft Excel XP.

Результати та обговорення

Встановлено, що концентрація первинних, вторинних та кінцевих продуктів пероксидації нейтральних ліпідів і фосфоліпідів в еритроцитах цільної ПК (табл. 1, група К), що зберігалась у стабілізованому стані при температурі (21,5 - 3,5) ⁰С до двох діб з моменту пологів, вірогідно різнилася. Так, вміст ДК в 1,6 рази (р < 0,05) був вище у гептановій фазі, в той час як ТК, ОДК і ШО відповідно у 2,6 (р < 0,001), в 1,6 (р < 0,05) та у 4,0 рази (р < 0,001) - в ізопропанольній. Індекс окислення первинних молекулярних продуктів фосфоліпідів (співвідношення ДК до ІПЗ - ДК/ІПЗ) був вірогідно нижчим у 1,7 рази порівняно з окисленням нейтральних ліпідів, у той час як індекси окислення вторинних (ОДК/ІПЗ) та кінцевих молекулярних продуктів (ШО/ІПЗ) їх перевищували відповідно в 1,6 і 4,5 рази (р < 0,001).

Таблиця 1

Показники перекисного окислення ліпідів в еритроцитарній зависі ПК на етапах консервування з кріопротекторами різного механізму дії (М - m)

Примітки: а - показники у суспензії підготовлених до кріоконсервування еритроцитів (після еквілібрації з кріопротектором); b - показник у РВЕМ; К - еритроцити цільної ПК (n=35); ^1,2,3 - різниця показників до та після розморожування (відповідно р < 0,001; р < 0,01; р < 0,05); І група (n = 15) - зразки, що кріоконсервували під захистом кріопротектора ПВП у кінцевої концентрації 10%; ІІ група (n = 35) - гліцерину у кінцевої концентрації 20%; ІІІ група (n = 35) - ДМСО у кінцевої концентрації 5%; IV група (n = 35) - ДМСО у кінцевої концентрації 10%; V група (n = 8) - суміші 10% ПВП із 5% ДМСО (сумарна кінцева концентрація - 15%); VI група (n = 8) - суміші 10% ПВП із 10% гліцерину (сумарна кінцева концентрація - 20%)

При перекисному окисленні нейтральних ліпідів усі показники перевищували відповідні при пероксидації фосфоліпідів. Так, ступінь окислення первинних (співвідношення ДК до ТК - ДК/ТК) - у 4,3 рази, вторинних (ДК/ОДК) - у 2,6 рази (р < 0,001) та кінцевих продуктів ПОЛ (ДК/ШО) - у 7,6 разів (р < 0,05). Отримані дані свідчили, що фосфоліпіди бішару мембран еритроцитів цільної ПК є стійкішими до зберігання у стабілізованому стані при температурі (21,5 - 3,5) °С. Проведений аналіз виявив зворотну кореляційну залежність між кількістю еритроцитів в одиниці об'єму цільної ПК і показниками ІПЗ, ДК, ТК, ОДК і ШО при пероксидації нейтральних ліпідів (відповідно r = - 0,682; r = - 0,709; r = - 0,704; r = - 0,591; r = - 0,585, р < 0,001) та ДК, ТК, ОДК і ШО - фосфоліпідів (відповідно r = 0,623; r = - 0,591; r = - 0,600; r = - 0,527, р < 0,001). Також відмічено кореляцію вмісту еритроцитів з показниками ДК/ШО (r = 0,769; р < 0,001) в гептановій фазі ліпідних екстрактів та ТК/ОДК (r = - 0,343; р < 0,05) - в ізопропанольній. Встановлено кореляційний зв'язок між часом зберігання ПК після пологів та показниками ТК/ОДК (r = - 0,400; р < 0,05) і ДК/ШО (r = 0,362; р < 0,05) при пероксидації фосфоліпідів та ДК/ОДК (r = 0,432; р < 0,05) - при перекисному окисленні нейтральних ліпідів. Додавання на етапі виділення ЕК осаджувача гідроксіетилкрохмалю (ГЕК) приводило до зниження в 1,2 рази (р < 0,05) вмісту ТК і ОДК в гептановій фазі ліпідних екстрактів та в 1,3 рази (р < 0,01) ОДК - в ізопропанольній. Концентрація ШО відповідно фазам зростала в 1,3 (р < 0,01) та 1,8 (р < 0,001) рази. Такі результати засвідчували м'який характер впливу етапу виділення еритроконцентрату на мембрани еритроцитів ПК.

При додаванні до ЕЗ кріопротекторів відбувалась активація процесів ПОЛ. У залежності від кріопротектора, що використовували, при перекисному окисленні нейтральних ліпідів вміст ІПЗ зростав від 1,7до 3,7 разів; ДК, ТК і ОДК - від 1,1 до 3,2 разів; ШО - від 1,1 до 2,0 разів. При пероксидації фосфоліпідів рівень ІПЗ зростав від 3,1 до 8,1 разів, ДК - від 4,5 до 17,0 разів,ТК і ОДК - від 1,5 до 3,8 разів, вміст ШО - від 1,4 до 2,5 разів (табл. 1). Тобто, виявлено суттєву різницю в окисленні нейтральних ліпідів і фосфоліпідів. Накопичення модифікованих фосфоліпідів, які здатні збільшувати гідрофільність і порушувати ліпід-ліпідні та білок-ліпідні взаємини, обумовлюють зниження спроможності мембран еритроцитів до деформації. Враховуючи ключову роль фосфоліпідів у регуляції транс - порту речовин, будь-які їх зміни можуть викликати іонний і осмотичний дисбаланси у клітинах.

Після розморожування зразків ЕЗ спостерігалась міжгрупова різниця концентрацій продуктів пероксидації нейтральних ліпідів і фосфоліпідів. Так, у гептановій фазі ліпідних екстрактів І-ї, ІІІ-ї, VT-ї груп вірогідно зростав вміст ІПЗ у 4,0, 4,0 і 2,6 рази відповідно; ДК - у 3,5, 3,2 і 3,7 рази; ТК у 3,8, 3,2 і 4,2 рази; ОДК - у 3,3, 3,2 і 4,2 рази; ШО - у 3,2, 5,4 і 6,6 разів. В ізопропанольній фазі концентрація ІПЗ підвищувалась відповідно у 2,1, 3,2 та 3,9 рази; ДК - у 3,7, 3,2 та 1,5 рази; ТК - у 3,1, 2,4 та 2,2 рази; ОДК у 3,2, 2,4 та 2,5 рази; ШО - у 4,2, 6,5 та 8,3 разів.

У зразках РВЕМ ІІ-ї, !V-i' та V-ї груп активність процесів ПОЛ вірогідно знижувалась (табл. 1). Найнижчі результати були виявлені у V-й групі, ЕЗ якої зберігали під захистом комбінації непроникаючого до клітини кріопротектору ПВП та ендоцелюлярного ДМСО у співвідношенні 2:1 (кінцева сумарна концентрація - 15%). Так, в ізопропанольній фазі концентрація ІПЗ вірогідно знижувалась у 2,0 рази, ДК - у 7,3 разів, ТК та ОДК - відповідно у 2,9 та 2,6 рази. Вміст двох останніх був достовірно зменшеним також відносно еритроцитів цільної ПК. Слід зазначити, що у цих трьох групах спостерігали і меншу різницю між показниками пероксидації нейтральних ліпідів і фосфоліпідів, що, певно, пов'язане з різницею окислюючих властивостей кріопротекторів. Отримані дані свідчать про гарну збереженість мембрани еритроцитів вищезазначених груп, що підтверджено також результатами дослідження концентрації вільного Hb в РВЕМ (табл. 2).

Таблиця 2

Вміст вільного гемоглобіну в зразках РВЕМ залежно від застосованого кріопротекторного розчину (М - m)

Примітки: ¹ - р < 0,001 - різниця між показниками І і ІІ груп; ² - р < 0,05 - І і ІІІ груп; ³ - р < 0,001І і ІУ груп; ⁴ - р < 0,001 -І і V груп; ⁵ - р < 0,05 - І і V! груп; ⁶ - р < 0,001 - ІІ і ІІІ груп; ⁷ - р < 0,01 - ІІ і ІУ груп; ⁸ - р < 0,001ІІ і У груп; ⁹ - р < 0,001 - ІІ і УІ груп; ¹⁰ - р < 0,001 - ІІІ і ІУ груп; ¹¹ - р < 0,001 - ІІІ і У груп; ¹² - р < 0,001 - ІІІ і УІ груп; ¹³ - р < 0,05 - IV і V груп;¹⁴ - р < 0,001 - ІУ і УІ груп; ¹⁵ - р < 0,001 - V і УІ груп

Найнижчий рівень вільного Hb, як і продуктів ПОЛ, виявлено у зразках V-ї групи, які зберігали під захистом комбінації обволікаючого 10% ПВП і внутрішньоклітинного 5% ДМСО, що, напевно, можна пояснити доповненням та врівноваженням дії кожного з кріопротекторів [6, 7]. Відомо, що в основі гемолізу лежать зміни проникності мембрани еритроцитів, утворення на її поверхні порожнин, формування подібної «ситу» структури, через яку відбувається прямий вихід молекул Hb. Прооксидантні властивості вільного Hb, у свою чергу, сприяють подальшій активації процесів ПОЛ, що підтверджують дані дослідження (табл. 1) і результати кореляційного аналізу. Так, встановлена пряма кореляція між концентрацією вільного Hb і показниками пероксидації нейтральних ліпідів, а саме: ШО (r = 0,740; р < 0,01), ТК/ОДК (r = 0,663; р < 0,05) та фосфоліпідів: ІПЗ, ДК, ОДК (відповідно r = 0,794; r = 0,776; r = 0,745; р < 0,01), ТК (r = 0,701; р < 0,05); ДК/ТК (r = 0,699; р < 0,05) і ДК/ОДК (r = 0,742; р < 0,01). Виявлена зворотна кореляція між кількістю еритроцитів і показниками вільного Hb (г = - 0,783; р < 0,01), а також продуктів пероксидації нейтральних ліпідів - ІПЗ (г = - 0,687; р < 0,05), ШО (г = - 0,685; р < 0,05) та фосфоліпідів: ДК (r = - 0,682; р < 0,05), ТК (r = - 0,744; р < 0,01), ОДК (r = - 0,739; р < 0,01), ШО (r = - 0,717; р < 0,01).

Таким чином, за результатами дослідження встановлено суттєву міжгрупову різницю активності процесів ПОЛ в зразках РВЕМ ПК, які заморожували під захистом кріопротекторів різного механізму дії та їх комбінацій, що дає об'єктивні підстави для використання цих показників при оцінці збереженості еритроцитів.

Висновки

1. Показано, що додавання до еритроконцентрату ПК ендоцелюлярних кріопротекторів - ДМСО (кінцева концентрація - 10%) і гліцерину (кінцева концентрація - 20%) вірогідно знижує активність процесів ПОЛ і гемоліз на етапах процесу кріоконсервування.

2. Встановлено, що застосування для зберігання еритроцитів ПК при температурі мінус 196 °С комбінації розчинів кріопротектора непроникаючої дії ПВП у кінцевій концентрації 10% і ендоцелюлярного ДМСО (кінцева концентрація - 5%) сприяє найбільшому зниженню активності ПОЛ на етапах процесу кріоконсервування.

3. Наявність кореляційних зв'язків між вмістом вільного Hb та показниками активності ПОЛ підтверджує правомірність використання останніх в якості тесту оцінки адаптаційних можливостей еритроцитів до стресу кріоконсервування.

Література

1. Аношина М.Ю. Оцінка перекисного окислення ліпідів у зразках кріоконсервованої пуповинної крові / М.Ю. Аношина, Т.О. Калиниченко, Г.Т. Глухенька // Український журнал гематології та трансфузіології. 2011. № 3. С. 12-15.

2. Горожанская Э.Г. Свободнорадикальное окисление и механизмы антиоксидантной защиты в нормальной клетке и при опухолевых заболеваниях (лекция) / Э.Г. Горожанская // Клиническая лабораторная диагностика. 2010. № 6. С. 28-44.

3. Миронов П.И. Кровопотеря и ее восполнение у детей / П.И. Миронов // Детская медицина Северо-запада. 2011. № 1. С. 35-40.

4. Определение свободного гемоглобина плазмы крови гемиглобинцианидным методом / О.Н. Савельев, В.П. Сухоруков, А.В. Киселева, Г.А. Королева // Лабораторное дело. 1990. № 10. С. 45-47.

5. Пат. №56992, UA, МПК (2009) A01N 1/02 A 61K 35/14. Спосіб кріоконсервування ядровмісних клітин пуповинної/плацентарної крові / П.М. Перехрестенко, Т.О. Калиниченко, Г.Т. Глухенька (UA); заявник і патентовласник ДУ «Інститут гематології та трансфузіології НАМН України» (UA). № u 201006071, заявл. 19.05.2010; опубл. 10.02.2011. Бюл. № 3.

6. Пахомова Ю.С. Криозащитные свойства растворов на основе непроникающего ОЭГп=25 в комбинации с проникающими криопротекторами при замораживании эритроцитов человека / Ю.С. Пахомова, В.В. Чеканова, А.М. Компаниец // Проблемы криобиологии и криомедицины. 2013. Т. 23, № 1. С. 26-39.

7. Рамазанов В.В. Осмотические свойства эритроцитов, замороженных в средах с непроникающими и проникающими криопротекторами / В.В. Рамазанов // Проблемы криобиологии. 2010. Т. 20, № 1. С. 47-58.

8. Gluckman E. Ten years of cord blood transplantation: from bench to bedside / E. Gluckman // Br. J. Haematology. 2009. Vol. 147, № 2. P. 192-199.

Размещено на Allbest.ru