Визначення мутації V617F гена JAK2 при хронічних мієлопроліферативних захворюваннях

Размещено на http://www.allbest.ru

ДУ «Інститут патології крові та трансфузійної медицини НАМН України»,

Визначення мутації V617F гена JAK2 при хронічних мієлопроліферативних захворюваннях

М.І. Вороняк

М.В. Кокоруз

Резюме

В роботі обґрунтована доцільність діагностування мутації V617F гена JAK2 при підозрі на хронічні мієлопроліферативні захворювання та проаналізовано результати обстеження 123 хворих на наявність даної мутації.

Ключові слова: мієлопроліферативні захворювання, мутація V617F, ген JAK2, алель, гетерозигота, гомозигота.

DETERMINATION OF V617F JAK2 MUTATION IN CHRONIC MYELOPROLIFERATIVE DISORDERS

M.I Voroniak, M.V. Kokoruz, I.M. Yurchyshak, S.P. Mylyashkevich

SI «Institute of Blood Pathology and Transfusion Medicine of NAMS of Ukraine», Lviv

Summary. The expediency of diagnosing the V617F mutation of the JAK2 gene in suspected chronic myeloproliferative diseases are reasonable in this article and the results of a survey of 123 patients with the presence of this mutation are analyzed.

Key words: myeloproliferative disorders, V617F mutation, JAK2 gene, allele, heterozygote, homozygote.

Хронічні мієлопроліферативні захворювання (ХМПЗ) - група неоплазій (гемобластозів), при яких спостерігається вибіркова, або, частіше, множинна гіперплазія гемопоетичних клітин кісткового мозку, результатом чого є надмірне продукування зрілих клітин еритроїдного, мегакаріоцитарного та гранулоцитарного паростків. Захворювання характеризуються відносно тривалим перебігом. Загальні характеристики, які об'єднують ці хвороби, включають гіперклітинність кісткового мозку, схильність до тромбозів і геморагій, ризик лейкозноі трансформаціі та розвиток фіброзу в процесі еволюції хвороби. Як правило, ці порушення не успадковуються, хоча й зустрічаються сім'і, в яких кілька членів мають ці розлади.

До основних розладів в даній групі відносять хронічну мієлоїдну лейкемію (ХМЛ), істинну поліцитемію (ІП), есенціальну тромбоцитемію (ET) та ідіопатичний або первинний мієлофіброз (ПМФ). ХМЛ є злоякісною пухлиною кровотворної тканини, що бере основу з клітин- попередниць мієлопоезу. При даній патології виникає надмірне утворення гранулоцитів. Властива характерна цитогенетична особливість - транс- локація 9 і 22 хромосом, з утворенням аномального злитого гена BCR-ABL. Дана аномалія отримала назву «філадельфійська хромосома" або Ph+. Так як в інших захворюваннях даної групи ця мутація не виявлена, то їх називають Ph- негативними мієлопроліферативними захворюваннями (Ph- ).

Останні роки ознаменувалися фундаментальними успіхами в розумінні патогенезу Ph--XMTO. В 2005 році була виявлена специфічна для цих захворювань молекулярна аномалія - набута точкова мутація V617F гена Янус-кінази 2 (JAK2 V617F) [4]. Ген JAK2 розташований в короткому плечі хромосоми 9 і складається з 25 екзонів, а його білок містить 1132 амінокислоти. Точкова мутація V617F являє собою заміну гуаніну на тимін у положенні 1849 екзону 14, в результаті чого синтезується білок, в якому замість валіну присутній фенілаланін, що приводить до підвищеної

кіназної активності. Внаслідок цього відбувається посилена неконтрольо- вана проліферація клітин крові еритроїдного, мегакаріоцитарного та гра- нулоцитарного паростків, у результаті чого і виникають ХМПЗ.

Відкриття мутації JAK2 V617F привело до перегляду діагностичних критеріїв, критеріїв відповіді на проведену терапію, а також стало стимулом для створення нового класу таргетних препаратів - низькомолекулярних інгібіторів янус-кіназ, які показали хорошу ефективність і безпеку в клінічних дослідженнях [2, 4, 5, 7, 8, 10]. З кожним роком молекулярно- генетичні методи все ширше впроваджуються в клінічну практику як для вдосконалення діагностичних критеріїв, так і для контролю ефективності лікування. І хоча молекулярно-генетичні тести в більшості випадків не самодостатні, проте вони значно прискорюють встановлення діагнозу та підвищують його достовірність.

За допомогою сучасних молекулярно-генетичних методів (алель- специфічна полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР), піросеквенування, кількісна ПЛР в реальному часі, метод високороздільного плавлення) вдалося визначити частоту виявлення мутації JAK2 V617F при різних ХМПЗ. Дана мутація була виявлена у більшості пацієнтів з ІП - 95-97%, у 50-70% пацієнтів з ЕТ і 40 - 65% - з ПМФ [1, 2, 3, 6, 11, 13].

З 2008 року до основних діагностичних критеріїв ХМПЗ був включений такий критерій, як наявність мутації JAK2 V617F. Дослідження мутацій JAK2 стали стандартним методом діагностики ХМПЗ [2, 3, 8, 11, 12] і використовуються для моніторингу ефективності терапії. Присутність мутації JAK2 V617F або інших мутацій JAK2, включаючи мутації в екзоні 12, тепер використовують у онкогематології як головні критерії для постановки діагнозу ХМПЗ.

Метою роботи стало якісне виявлення мутації JAK2 V617F у пацієнтів з підозрою на ХМПЗ.

Матеріали і методи. Забір венозної крові проводився в вакуумні пробірки з К2 ЕДТА ємністю 3 мл. Виділення ДНК проводилось з крові об'ємом 1 мл у двох повторах для кожного пацієнта за допомогою реактиву «ДНК-ЭКСПРЕСС-кровь» фірми «Литех». У випадку необхідності довготривалого зберігання отримане ДНК заморожували в морозильнику при - 20оС. Визначення мутації V617F гена JAK2 проводили методом полімеразно-ланцюгової реакції (ПЛР) в режимі реального часу постановкою мультиплексної реакції. Використовували набори реактивів для виявлення поліморфізмів у геномі людини методом ПЦР «SNP-ЭКСПРЕСС- SHOT» (Single nucleotide polymorphism- однонуклеотидний поліморфізм). Алель 1 («дикого типу») маркувалась флюорофором HEX, алель 2 (муто- вана) визначалася по каналу FAM. Ампліфікація проводилась на приладі

CFX96TM Real-Time System виробництва фірми Bio-Rad (США). Кожен зразок ДНК хворого досліджувався у двох повторах і для уникнення хиб- нопозитивних чи хибнонегативних результатів під час кожної ампліфікації ставили негативний контроль та 3 позитивні контролі. Зчитування результатів проводилось за допомогою програми CFX Manager TM Software 3,0. Результати аналізу дозволяють дати три типи заключены гомозигота за нормальною алелю 1; гетерозигота (одночасно алель 1 + алель2) і гомозигота по патологічній алелі 2. Аналіз здійснювали за кривими накопичення флюоресцентного сигналу від кожного зразка. Для гетерозиготного зразка різниця циклів виходу кривих накопичення флюоресцентного продукту з нормальним і мутантом варіантом повинна бути не більше 1,5.

Результати та їх обговорення. Наявність мутації JAK2 V617F визначалось у 123 хворих з підозрою на ХМПЗ віком від 21 до 76 років, з яких 51 жінка і 72 чоловіки. Мутацію виявили у 51 пацієнта, з них 27 жінок та 24 чоловіки. Серед пацієнтів з виявленою мутацією було 34 - з гетерозиготою, а 17 - з гомозиготою. Дані результати були використані в подальшому при діагностуванні та лікуванні.

Мутація V617F гена JAK2 стала ключовим молекулярним маркером у діагностиці РИ--ХМПЗ. Так як з 2008 року мутацію JAK2 V617F включено в список основних діагностичних критеріїв ХМПЗ, тому рекомендовано проводити якісне визначення мутації JAK2 V617F під час первинного обстеження пацієнтів з підозрюються на ХМПЗ, а для моніторингу лікування доцільно здійснювати кількісне визначення мутантного гена.

Висновок

мутація ген мієлопроліферативний

JAK2 V617F є соматичною мутацією, що виникає в гемопоетичних клітинах-попередницях. Вона зустрічається у переважної більшості хворих на ХМПЗ, що робить цю мутацію дуже зручним діагностичним маркером. Наявність точкової мутації у положенні 1849 G/T (617 V/F) - феномен, характерний виключно для ураження мієлоїдного паростка, і не описаний для солідних пухлин, ні для пухлин лімфоїдного походження .Зараз молекулярне дослідження входить в діагностичні критерії ВООЗ, а тест на наявність мутації JAK2 став стандартним методом діагностики ХМПЗ. Виявлення мутації вказує на наявність клонального ХМПЗ і виключає можливість реактивного еритроцитозу, тромбоцитозу або мієлофіброзу. В даний час дослідження на наявність мутації JAK2 V617F необхідна умова для встановлення правильного діагнозу і визначення подальшої тактики лікування пацієнта.

Література

Клименко С.В. Діагностика справжньої поліцитемії, есенціальної тромбо- цитемії та ідіопатичного мієлофіброзу / С.В. Клименко, О.М. Костюкевич, В.В. Шолойко // Збірка довідкових матеріалів. - К., 2013. - 15 с.

Клинические рекомендации по диагностике и терапии Ph-негативных мие- лопролиферативных заболеваний (истинная полицитемия, эссенциальная тромбо- цитемия, первичный миелофиброз) // Материалы II конгресса гематологов России.

2014. - 81с.

Материалы 19-го конгресса Европейской гематологической ассоциации (2014 г., Милан). Подгот. Меликян А.Л. и Суборцева И.Н. // Клин. онкогематол.

2014. - № 7(4) - С. 599-608.

Меликян А. Л. Биология миелопролиферативных новообразований. / Меликян А.Л., Суборцева И.Н. // Клиническая онкогематология. - 2016. - № 9(3).

С. 314-325.

Мисюрин А.В. Молекулярный патогенез миелопролиферативных заболеваний / A.B. Мисюрин // Клиническая онкогематология. - 2009. - Т. 2, № 3. - С. 211-219.

Саврилова А.М. Выявление мутации JAK2 V617F при хронических Ph- негативных заболеваниях / А.М. Саврилова, А.В. Костерина, А.Р. Ахмадеев // Генетика, Практическая медицина 04 (14) Инновационные технологии в медицине. Том 1. Електронний ресурс http://mfvt.ru/vyyavlenie-mutacii-JAK2-v617f-pri- xronicheskix-ph-negativnyx-zabolevaniyax/

Соколова М.А. Современные представления о «классических» Ph-негативных хронических миелопролиферативных заболеваниях / М.А. Соколова // Клиническая онкогематология. - 2010. - Т. 3. № 3. - С. 235-242.

Cervantes F. JAK inhibitors: beyond spleen and symptoms? / F. Cervantes, R. Mesa, C. Harrison // Haematologica. - 2013. - 98(2). - P. 160-162.

Hobbs G. S. JAK2 Mutations and JAK Inhibitors in the Management of Myeloproliferative Neoplasms / G.S. Hobbs, R.K. Rampal // Електронний ресурс: //www.onclive.com/publications/contemporary-oncology/2015/february-2015/JAK2- mutations-and-JAK-inhibitors-in-the-management-of-myeloproliferative-neoplasms/ 1#sthash.2uUQKkED.dpuf

Establishing optimal quantitative-polymerase chain reaction assays for routine diagnosis and tracking of minimal residual disease in ,MO-V617F-associated myeloproliferative neoplasms: a joint European LeukemiaNet/MPN&MPNr-EuroNet (COST action BM0902) study / J.V. Jovanovic, A. Ivey, A.M. Vannucchi [et al.] / Leukemia. - 2013. - 27(10). - P. 2032-2039.

Muxi P. J. JAK-2 positive myeloproliferative neoplasms / P.J. Muxi,

С. Oliver // Curr Treat Options Oncol. - 2014. - 15(2). - P. 147-156.

McPherson S. Epigenetics in Myeloproliferative Neoplasms / S. McPherson, M.F. McMullin, K. Ken Mills // J. Cell. Mol. Med. - 2017. - Vol. 21, № 9.

Р. 1660-1667.

Nielsen C. JAK2V617F somatic mutation in the general population: myeloproliferative neoplasm development and progression rate. / C. Nielsen, S.E. Bojesen,

G. Nordestgaard [et al] // Haematologica. - 2014. - 99(9). - P. 1448-1455.

Размещено на Allbest.ru