Властивості та методи одержання в лабораторних умовах фактора зсідання крові VII

Размещено на http://www.allbest.ru/

ДУ «Інститут патології крові та трансфузійної медицини НАМН України»

Властивості та методи одержання в лабораторних умовах фактора зсідання крові VII

С.Є. Мадич, Т.В. Даниш

Львів

Резюме

Фактор VII використовують при кровотечах і операціях у хворих на гемофілію А або В з інгібіторами до факторів VIII або ІХ, а також для лікування хворих з вродженим дефіцитом фактора VII. Ми показали, що ряд синтезованих нами сорбентів ефективно зв'язує фактор VII. За допомогою вдало підібраних умов елюції вдалось отримати високоочищений препарат цього білка. Отриманий препарат фактора VII за чистотою та специфічною активністю аналогічний комерційним препаратам відомих виробників. Технологія виділення фактора включає також стадії антивірусної обробки.

Ключові слова: плазма крові, фактор зсідання VII, хроматографічні методи, сорбенти, тріазинові барвники.

Resume

PROPERTIES AND METHODS OF OBTAINING BLOOD CLOTTING FACTOR VII IN LABORATORY CONDITIONS

S. Madych, Т. Danysh

SI «Institute of Blood Pathology and Transfusion Medicine of NAMS of Ukraine», Lviv

Factor VII is used in cases of bleeding and operations of patients with haemophilia A or B with inhibitors to VIII or ІХ and for treatment of patients with the acquire and inherit deficit of VII. We have shown that the row of newly synthesized sorbents effectively links factor VII. With the help of accurate conditions of elution highly-purified preparation of this protein was succsessfuly selected. The received preparation of VII according to its cleanness and specific activeness is analogical to commercial preparations of different producers. Technology of selection ofpreparation includes the stages of anti-virus treatment.

Key words: blood plasma, blood clotting FVII, chromatographic methods, sorbents, triazyne dyes.

Вступ

На сьогоднішній день є актуальною проблема переробки донорської плазми крові з метою створення ефективних лікарських препаратів та діагностичних засобів. Створено значну кількість методів фракціонування плазми крові, виділення та очищення її компонентів, зокрема, факторів зсідання крові та фібринолізу. Вивчення ролі такого фактора зсідання крові, як фактор VII, має теоретичне і практичне значення. Для проведення цих досліджень необхідним є наявність очищених препаратів цього білка. Важливими з точки зору ефективності є методи біоспецифічної хроматографії.

Активація фактора VII (FVII) носить локальний характер [5], тому не викликає системної активації зсідання крові, крім окремих випадків множинних пошкоджень. Препарати FVII використовують при кровотечах і операціях у хворих на гемофілію А або В з інгібіторами до факторів УШ або ІХ, а також для лікування хворих з вродженим його дефіцитом.

Застосування антикоагулянтів непрямої дії (синкумар, фенілін та ін.) призводить до порушення синтезу в печінці VII, IX, X факторів зсідання крові. Терапія фібринолітичними препаратами викликає порушення в системі зсідання крові.

Оскільки FVII присутній в плазмі в дуже низькій концентрації (близько 0,005 г/л), технології його виділення є складними [3]. Вихідною сировиною для його одержання може також бути концентрат факторів протромбінового комплексу (ППСБ), добутий шляхом попереднього фракціонування плазми [6]. Афінна хроматографія - це перспективний метод для виділення очищеного FVII [1, 2, 4].

Мета. Підбір вихідної сировини та отримання з неї очищеного FVII методом афінної хроматографії на макропористих кремнеземних сорбентах з біоімітуючими барвниками-лігандами, придатного для діагностичних та лікувальних цілей.

Матеріали і методи. Фракції плазми І, ІІ + ІІІ чи ІІІ за Коном, сольове та поліетиленгліколеве (ПЕГ) фракціонування, афінна хроматографія, електрофорез, макропористий кремнеземний носій, активні тріазинові барвники. Визначення активності FVII проводили фотометричним методом за допомогою гідролізу хромогенного субстрату S-2765 фірми Chro- mogenix. У дослідженнях використовували референтні нормальні плазми, а також плазми, дефіцитні за факторами II, VII, ІХ та Х (фірма «Cormay"), препарат «NovoSeven" (Novo Nordisk A/S), набір білкових молекулярних маркерів PageRuler™ Unstained Protein Ladder (Fermentas, Литва).

Результати та їх обговорення

В нашій лабораторії розробляються методи виділення очищених вірусінактивованих факторів зсідання крові та фібринолізу з продуктів субфракціонування плазми крові за Коном з використанням методу афінної хроматографії на кремнеземних носіях. Використання такої технології дає можливість в один етап отримувати високоочищені терапевтичні кількості вірусінактивованих препаратів практично з утильної сировини станцій переливання крові. Зокрема, наші попередні дослідження показали можливість та достатню ефективність застосування кремнеземних носіїв з тріазиновим барвником - лігандом Активним яскраво-голубим для виділення та очищення тромбіну та фактора зсідання IX. Оскільки FVII, як і попередні виділені нами ферменти, є сериновою протеїназою трипсинового типу, логічною стала необхідність проведення досліджень можливості застосування кремнеземних носіїв з тріазиновими барвниками-лігандами для його виділення та очищення.

Експериментальним шляхом нами доведено, що перевагою кремнеземних сорбентів над органічними при створенні технологій одержання препаратів з плазми крові є висока стабільність, легкість регенерації, стійкість до дії мікроорганізмів, хімічних речовин та стерилізації, можливість застосування високих швидкостей проведення хроматографічного процесу.

В даному дослідженні нами проведено підбір умов визначення вмісту фактора VII у різних субфракціях плазми крові, а також в концентраті IIIІСБ. з метою виявлення найкращої сировини для його біоспецифічного виділення. Іншим важливим фрагментом даної роботи було створення технології його виділення та очищення з цієї сировини, включаючи етапи антивірусної обробки та афінну хроматографію на кремнеземних сорбентах з лігандами - активними барвниками. вірусінактивований кров фібриноліз

Висновки

1. Низка новосинтезованих макропористих кремнеземних сорбентів з лігандами - активними барвниками ефективно зв'язують фактор VII.

2. Підібрані умови елюювання фактора дозволяють отримувати його специфічно в м'яких фізіологічних умовах.

3. Створена лабораторна схема одержання очищеного фактора зсідання VII, яка включає етапи: сольового та ПЕГ-переосадження, одержання концентрату протромбінового комплексу, вірусну інактивацію, його активацію тромбопластин-кальцієвою сумішшю, та безпосереднє очищення фактора методом афінної хроматографії на макропористому кремнеземному сорбенті з лігандом - активним тріазиновим барвником.

Література

1. Мадич С.Є. Технологічні аспекти виділення фактора VII згортання крові / С.Є. Мадич // Гематологія і переливання крові: міжвідомчий збірник. - К., 2015. - Вип. 38. - С. 431-432.

2. Мадич С.Є. Фактор зсідання крові VII: властивості та методи одержання / С.Є. Мадич, Т.В. Даниш // Вісник Львівського університету. Серія біологічна. - 2016. - Вип. 73. - С. 310-313.

3. Broze G. J. Purification and properties of human coagulation factor VII / G.J. Broze, P.W. Majerus. // J. Biol. Chem. - 1980. - V. 255. - P. 1242-1247.

4. Madych S. Selection and purification of blood clotting factor VII suitable for therapeutic and treatment purposes / S. Madych, T. Danysh.// Thrombosis Research: Proceedings of the 5th International Conference on Thrombosis and Hemostasis Issues in Cancer, Stresa (Lake Majiore), Italy, April 23-25, 2010. - V. 125. - Suppl. 2. - P. S187.

5. Patthy L. Evolutionary assembly of blood - coagulation proteins / L. Patthy // Semin. Thromb. Hemost. - 1990. - V. 16. - P. 245-259.

6. New strategy for the design of ligands for the purification of pharmaceutical proteins by affinity chromatography./ K. Sproule, P. Morrill, J.C. Pearson [et al.] // J. Chromatogr. - 2000. - V. 740. - P. 17-33.

Размещено на Allbest.ru