Вплив тривалого введення нестероїдних протизапальних засобів на рівень повногеномного метилювання ДНК та її фрагментації у щурів

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Вплив тривалого введення нестероїдних протизапальних засобів на рівень повногеномного метилювання ДНК та її фрагментації у щурів

Бурлака К.А.

Запорізький державний медичний університет (м. Запоріжжя, Україна)

Резюме

ВПЛИВ ТРИВАЛОГО ВВЕДЕННЯ НЕСТЕРОЇДНИХ ПРОТИЗАПАЛЬНИХ ЗАСОБІВ НА РІВЕНЬ ПОВНОГЕНОМНОГО МЕТИЛЮВАННЯ ДНК ТА ЇЇ ФРАГМЕНТАЦІЇ У ЩУРІВ

Бурлака К.А.

Епігенетика - це розділ генетики, о вивченні спадкових змін в активності або функції генів, які не пов'язані з будь-якою зміною самої послідовності ДНК. Хоча практично всі клітини організму містять однакову генетичну інформацію, але не всі гени експресуються одночасно у всіх типах клітин. У більш широкому сенсі епігенетичні механізми опосередковують різноманітні профілі експресії генів у різних клітинах і тканинах багатоклітинних організмів. За останні роки спостерігається бурхливе зростання епігенетичних досліджень, пов'язане з розвитком нових молекулярних і цитологічних підходів. Проте, основні фундаментальні спостереження пов'язані з вивченням процесів диференціювання у розвитку. Останніми дослідженнями було встановлено, що хімічні сполуки можуть мати епігенетичний вплив, тобто впливати на активність експресії певних генів. А найчастіше, це пов'язано з людьми які мають хронічні захворювання, тому що вони вимушені застосовувати лікарські засоби тривало, з метою покращення якості життя. Відомо, що тривалий прийом не- стероїдних протизапальних лікарських засобів (НПЗЗ) приводить до утворення ерозій, виразок і онкологічних захворювань шлунка та кишечника. Висловлюється припущення, що побічні ефекти є не тільки результатом пошкодження слизової оболонки під впливом НПЗЗ, але і можливим впливом НПЗЗ на гени, які регулюють клітинний цикл, особливо при їх тривалому застосуванні.

У дослідженнях були використані 60 щурів-самців, які були розподілені на чотири групи по 15 тварин, котрим вводили щоденно у продовж 3 місяців НПЗЗ: 1-а - контрольна (КГ), розчин натрію хлориду 0,9%, 2-га

- щури, котрим вводили індометацин, 3-я - щури, котрим вводили ацетилсаліцилову кислоту та 4-а група - щури, котрим вводили мелоксикам. Тривале призначення всіх НПЗЗ призводило до статистично вірогідного збільшення повногеномного метилювання ДНК та до інтенсифікації процесів її фрагментації. Важливо зазначити, що за ступенем епігенетичного впливу, дія досліджуваних НПЗЗ була різного ступеня вираженості.

Найбільш вираженими ефектами володів індометацин (збільшення MspI/HpaII на 99%; фрагментації ДНК

- на 90% по відношенню до інтакту). Враховуючи встановлені ефекти НПЗЗ, щодо їх здатності підвищувати рівень повногеномного метилювання ДНК та їх фргментації, перспективним напрямом є вивчення рівня метилювання генів, що регулюють клітинний цикл шлунка та кишечника, а також вивчення їх експресивної/ білоксинтетуючої функції.

Ключові слова: метилювання ДНК, епігенетика, ульцерогенна дія, нестероїдні протизапальні лікарські засоби.

Abstract

INFLUENCE OF LONG-TERM ADMINISTRATION OF NON-STEROIDAL ANTI-INFLAMMATORY DRUGS ON THE LEVEL OF WHOLE GENOME DNA METHYLATION AND ITS FRAGMENTATION IN RATS

Burlakа K.A.

Epigenetics is the branch of genetics concerned with the study of inherited changes in the activity or function of genes that are not associated with any change in the DNA sequence itself. Although almost all cells of the body contain the same genetic information, not all genes are expressing simultaneously in all cell types. More broadly, epigenetic mechanisms mediate different gene expression patterns in different cells and tissues of multicellular organisms. In recent years, there has been a rapid growth in epigenetic research associated with the development of new molecular and cytological approaches. However, the main fundamental observations are connecting with the study of the processes of differentiation in development. Recent studies have found that chemical compounds can have an epigenetic effect, that is, affect the activity of the expression of certain genes. And most often this is due to people who have chronic diseases, because they are forced to use drugs for a long time, in order to improve the quality of life. It is known that long-term use of non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) leads to the formation of erosions, ulcers and oncological diseases of the stomach and intestines. It has been suggested that side effects are not only the result of mucosal damage under the influence of NSAIDs, but also the possible effect of NSAIDs on genes that regulate the cell cycle, especially with their long-term use.

In the studies, 60 male rats were used, which were divided into four groups of 15 animals, which were administered daily for 3 months with NSAIDs: 1st - control (CG), sodium chloride solution 0.9%, 2nd - rats , which were injected with indomethacin, the 3rd group - rats that were injected with acetylsalicylic acid and the 4th group - rats that were injected with meloxicam. Long-term administration of all NSAIDs led to a statistically probable increase in whole-genome DNA methylation and intensification of its fragmentation processes. It is important to note that according to the degree of epigenetic impact, the effect of the studied NSAIDs was of varying severity.

Indomethacin had the most pronounced effects (an increase in MspI/HpaII by 99%; DNA fragmentation by 90% relative to intact). Considering the established effects of NSAIDs, in terms of their ability to increase the level of genome-wide DNA methylation and their fragmentation, a promising direction is to study the level of methylation of genes that regulate the cell cycle of the stomach and intestines, as well as to study their expressive/biloxinsynthesizing function.

Key words: DNA methylation, epigenetics, ulcerogenic effect, non-steroidal anti-inflammatory drugs.

За останні роки, спостерігається бурхливе зростання епігенетичних досліджень, пов'язаних з розвитком нових молекулярних і цитологічних підходів. Останніми дослідженнями було встановлено, що хімічні сполуки можуть мати епігенетичний вплив, тобто впливати на активність експресії певних генів. А найчастіше, це пов'язано з людьми які мають хронічні захворювання, тому що вони вимушені застосовувати лікарські засоби тривало, з метою покращення якості життя. Відомо, що тривалий прийом нестероїдних протизапальних лікарських засобів (НПЗЗ) приводить до утворення ерозій, виразок і онкологічних захворювань шлунка та кишечника. Висловлюється припущення, що побічні ефекти є не тільки результатом пошкодження слизової оболонки під впливом НПЗЗ, але і можливим впливом НПЗЗ на гени, які регулюють клітинний цикл, особливо при їх тривалому застосуванні. У дослідженнях були використані 60 щурів-самців, які були розподілені на чотири групи по 15 тварин, котрим вводили щоденно у продовж 3 місяців НПЗЗ: 1-а - контрольна (КГ), розчин натрію хлориду 0,9%, 2-га - щури, котрим вводили індометацин, 3-я - щури, котрим вводили ацетилсаліцилову кислоту та 4-а група - щури, котрим вводили мелоксикам. Тривале призначення всіх НПЗЗ призводило до статистично вірогідного збільшення повногеномного метилювання ДНК та до інтенсифікації процесів її фрагментації. Важливо зазначити, що за ступенем епігенетичного впливу, дія досліджуваних НПЗЗ була різного ступеня вираженості. Найбільш вираженими ефектами володів індометацин (збільшення MspI/HpaII на 99 %; фрагментації ДНК - на 90% по відношенню до інтакту). Враховуючи встановлені ефекти НПЗЗ, щодо їх здатності підвищувати рівень повногеномного метилювання ДНК та їх фрагментації, перспективним напрямом є вивчення рівня метилювання генів, що регулюють клітинний цикл шлунка та кишечника, а також вивчення їх експресивної/білоксинтетуючої функції.

Зв'язок публікації з плановими науково-дослідними роботами

нестероїдний протизапальний засіб днк

Робота виконана у рамках науково-дослідної роботи кафедри клінічної та лабораторної діагностики ЗДМУ «Розробка нових ефективних шляхів діагностики та ендогенної цитопротекції ішемічних пошкоджень коронарного і церебрального кровообігу (клінічно-експериментальне дослідження)», № державної реєстрації - 0118U004369.

Вступ

В процесі життєдіяльності людини організм підлягає впливу негативних факторів зовнішнього середовища, призводячи до епігенетичних змін, та відповідно, до порушення експресійної/білоксин- тетуючої функції клітин організму. Дослідженнями останнього десятиріччя встановлено, що лікарські засоби можуть виступати у якості епігенетичних факторів, особливо при їх тривалому введенні, окремі лікарські засоби розглядають у якості епігенетично активних ксенобіотиків, які здатні хімічно взаємодіяти із нуклеїновими кислотами клітини, призводячи до модифікації гістонів та метилювання ДНК [1, 2].

Відомо, що епігенетична модифікація ДНК впливає на активність експресії певних генів на кількох рівнях, що призводить до зміни фенотипу клітини. В організмі, існують молекулярно-біохімічні системи, спрямовані на інактивацію ксенобіотиків, у тому числі й лікарських засобів, проте відомо, що лікарські препарати змінюють не лише молекулярні реакції, фізіологічні функції, а й здатні моделювати генну експресію [3].

Давно відомо, що генні мутації відіграють важливу роль у формуванні онкогенезу. Однак лише недавно було визнано, що епігенетичні зміни роблять значний внесок у розвиток онкологічних захворювань [3, 4, 5].

Виходячи з вищевикладеного, цікавим є вивчення епігенетичного впливу лікарських препаратів на епігенетичні зміни генів. За останні роки спостерігається бурхливе зростання епігенетичних досліджень, пов'язаних з розвитком нових молекулярних і цитологічних підходів. Встановлено, що існують основні епігенетичні механізми, або, як часто кажуть епігенетичні маркери. В даний час найбільш вивчено ДНК-метилювання. Метилювання ДНК каталізується сімейством ДНК-метилтрансфераз (Dnmts), які переносять метильну групу з S-аденілметіоніну (SAM) на п'ятий вуглець залишку цитозину з утворенням 5mC. Dnmt3a та Dnmt3b можуть встановлювати новий па- терн метилювання немодифікованої ДНК і тому відомі як Dnmt de novo. З іншого боку, Dnmt1 функціонує під час реплікації ДНК, копіюючи патерн метилювання ДНК з батьківського ланцюга ДНК на знову синтезований дочірній ланцюг [2, 3, 6, 7].

На сьогодні, здатність лікарських засобів епеге- нетично впливати на експресію генів, розглядають як один з вірогідних механізмів небажаних побічних реакцій.

Є дані , що тривалий прийом нестероїдних протизапальних лікарських засобів (НПЗЗ) приводить до утворення ерозій, виразок і онкологічних захворювань шлунка та кишечника. Висловлюється припущення, що дані побічні ефекти є не тільки результатом пошкодження слизової оболонки під впливом НПЗЗ, але і можливим впливом НПЗЗ на гени, які регулюють клітинний цикл, особливо при їх тривалому застосуванні [8].

Таблиця - Повногеномне метилювання ДНК (MspI/HpaN) та її фрагментація у лімфоцитах крові щурів на тлі тривалого введення НПЗЗ

Примітка: *- р<0,05 по відношенню до інтактної групи тварин.

Мета дослідження

Дослідження впливу різних НПЗЗ на рівень по- вногеномного метилювання ДНК та процесів її фрагментації.

Об'єкт і методи дослідження.

У дослідженнях були використані 60 щурів-сам- ців лінії Wistar масою 200-400 грамів, отримані з розплідника ДУ «Інститут фармакології та токсикології НАМНУ». Усі експериментальні дослідження проводили з дотриманням основних положень Європейської конвенції про охорону хребетних тварин, що використовуються з експериментальними та іншими науковими цілями (Страсбург, 1986 р.). Догляд, утримання і годування тварин здійснювався згідно з вимогами нормативних документів в стандартних умовах віварію. До початку проведення дослідження комісія з питань біоетики ЗДМУ перевірила і погодила протокол дослідження (№7 від 11.11.2019р.), а також всі процедури, пов'язані з утриманням тварин, гуманним поводженням з тваринами і їх використанням в експерименті. Кожна група включала в себе 15 тварин (15 самців). Тривалість карантину (акліматизаційного періоду) для всіх тварин становила 14 днів. Протягом карантину проводили щоденний огляд кожної тварини (поведінку і загальний стан), двічі в день тварин спостерігали в клітинах (захворюваність і смертність).

60 лабораторних щурів масою 200-400 гр. були розподілені на чотири групи по 15 тварин наступним чином: 1-а - контрольна (КГ), котрим вводили щоденно у продовж 3 місяців розчин натрію хлориду 0,9%, 2-га - щури, котрим вводили щоденно індоме- тацин (Інд) протягом 3 місяців в дозі 0,6 мг/кг., 3-я - щури, котрим вводили щоденно протягом 3 місяців ацетилсаліцилову кислоту (Аск) 3 місяці в дозі 0,6 мг/ кг та 4-а група - щури, котрим вводили щоденно ме- локсикам (Мкс) в дозі 0,1 мг/кг - 3 місяці.

Рівень фрагментації та метилювання ДНК встановлювали за методикою DNA-comet assay. При дослідженні процесів метилювання використовували рестриктази MspI та HpaII (Abcam, USA). Ступінь фрагментації ДНК виражали у відсотках. Рівень метилювання ДНК виражали у відсотках MspI та HpaII у ядрах клітин крові [9].

Статистичну оцінку результатів дослідження проводили із використанням програмного пакету Statistica 10,0 (Statsoft Inc., USA). Отримані результати подано у вигляді медіани інтерквантильного розмаху. Відмінності між групами оцінювалися із застосуванням непараметричних методів із використанням критерію Манна-Уітні. Статистично значущими вважали відмінності при p<0,05.

Результати дослідження та їх обговорення

Тривале призначення всіх НПЗЗ призводило до статистично вірогідного збільшення повногеномно- го метилювання ДНК та до інтенсифікації процесів її фрагментації (табл.). Важливо зазначити, що за ступенем епігенетичного впливу, дія досліджуваних НПЗЗ була різного ступеня вираженості. Так, найбільший вплив на кількість MspI/HpaII чинило тривале призначення індамітацину (збільшення на 99% по відношенню до інтактної групи тварин), далі - аце- тілсаліцилова кислота та мелоксикам (відповідно на 56% та 41%). Аналогічна динаміка НПЗЗ була встановлена також при дослідженні ступеню загальної фрагментації ДНК.

Встановлена нами здатність НПЗЗ впливати на процеси метилювання ДНК, деякою мірою підтверджує припущення низки дослідників, щодо наявності у НПЗЗ епігенетичного механізму їх небажаних побічних ефектів.

Метилювання ДНК регулюється сімейством ферментів ДНК-метилтрансфераз (DNMTs), з яких DNMT1 метилює ДНК під час реплікації, DNMT3A і DNMT3B виконують метилювання de novo, а DNMT3L, у свою чергу, відповідає за зв'язування перерахованих метилтрансфераз з донором метильної групи- S-аденозил^-метіонином. Існує 2 основні механізми епігенетичної регуляції транскрипції за допомогою метилювання ДНК: прямий та опосередкований. Прямий механізм дії ґрунтується на стеричній перешкоді метильних груп взаємодії ДНК з транскрипційними факторами. У разі опосередкованого механізму ме- тильовані області взаємодіють з метилзв'язуючими білками (methylbinding proteins, MBPs) MeCP-1 та MeCP-2, які приєднуються до ДНК. MeCP-1 стерич- но блокує зв'язування ДНК із транскрипційним апаратом, що веде до репресії транскрипції [6, 8, 10]. MeCP-2, у свою чергу, рекрутує гістонові деацетилази

(histone deacetylases, HDACs) спільно з транскрипційними корепресорами, що призводить до ущільнення структури хроматину та репресії транскрипції, що призводить до фрагментації ДНК.

Вищеописані молекулярні процеси призводять до порушення експресійної'/білкосинтетичної функції генів, що може призвести до геномної нестабільності, а також порушення процесів проліферації та диференціювання клітин. Низкою досліджень показано, що НПЗЗ здатні викликати онкологічні захворювання шлунково-кишкового тракту при їх тривалому застосуванні. Був встановлений епігенетичний вплив НПЗЗ на гени, що регулюють клітинний цикл шлунка (CDH1, MHL1), а також кишечника (SEPT9, APC). Відомо що, ген SEPT9 кодує синтез білка septin- 9. Ме- тилювання ДНК цього гена припиняє його активну роботу і «вимикає» синтез білка-супресора ракового зростання. Пошкодження експресії гена SEPT9 асоційоване з розвитком колоректального раку (КРР) [8, 10]. Наявність в крові неактивного гена-супресора ракової пухлини свідчить про процеси розвитку пухлини в кишечнику, відображає такі події як проліферація клітин і ангіогенезу в пухлині [11]. Крім того, нашими попередніми дослідженнями був встановлений вірогідний MMP опосередкований механізм побічної дії НПЗЗ, за рахунок зміни експресивної активності генів, що кодують синтез матриксних мета- лопротеїназ, збільшення їх концентрації та їх участі у деградації позаклітинного матриксу.

Висновки

Таким чином, проведеними нами експериментальними дослідженнями була встановлена здатність НПЗЗ при їх тривалому введенні збільшувати повногеномне метилювання ДНК та інтенсифікувати процеси їх фрагментації. Найбільш вираженими ефектами володів індометацин (збільшення MspI/ HpaII на 99%; фрагментації ДНК - на 90% по відношенню до інтакту).

Перспективи подальших досліджень.

Враховуючи встановлені ефекти НПЗЗ щодо їх здатності підвищувати рівень повногеномного метилювання ДНК та їх фргментації, перспективним напрямом є вивчення рівня метилювання генів, що регулюють клітинний цикл шлунка (CDH1, MHL1) та кишечника (SEPT9, APC), а також вивчення їх експре- сивної/білоксинтетуючої функції.

References / Література

1. Ganesan A, Arimondo PB, Rots MG, Jeronimo C, Berdasco M. The timeline of epigenetic drug discovery: from reality to dreams. Clinical Epigenetics. 2019 Dec 2;11(1):174. DOI: 10.1186/s13148-019-0776-0.2.

2. Biswas S, Rao CM. Epigenetic tools and their implications in cancer therapy. Eur J Pharmacol. 2018;837:8-24. DOI: 10.1016/j. ejphar.2018.08.021.

3. Han M, Jia L, Lv W, Wang L, Cui W. Epigenetic enzyme mutations: role in tumorigenesis and molecular inhibitors. Front Oncol. 2019;9:194. DOI: 10.3389/fonc.2019.00194.

4. Mohammad HP, Smitheman KN, Kamat CD, Soong D, Federowicz KE, Van Aller GS, et al. A DNA hypomethylation signature predicts antitumor activity of LSD1 inhibitors in SCLC. Cancer Cell. 2015;28:57-69. DOI: 10.1016/i.ccell.2015.06.002.

5. Ferguson-Smith AC. Genomic imprinting: the emergence of an epigenetic paradigm. Nature Reviews Genetics. 2011;12:565-75. DOI: 10.1038/nrg3032.

6. Achinger-Kawecka J, Valdes-Mora F, Luu PL, Giles KA, Caldon CE, Qu W, et al. Epigenetic reprogramming at estrogen-receptor binding sites alters 3D chromatin landscape in endocrine-resistant breast cancer. Nat Commun. 2020;11:320. DOI: 10.1038/s41467-019-14098-x.

7. Shire A, Lomberk G, Lai JP, Zou H, Tsuchiya N, Aderca I, et al. Restoration of epigenetically silenced SULF1 expression by 5-aza- 2-deoxycytidine sensitizes hepatocellular carcinoma cells to chemotherapy-induced apoptosis. Med Epigenet. 2015;3:1-18. DOI: 10.1159/000375461.

8. Lee JU, Soo Chang H, Kyung Kim M, Park SL, Kim JH, Park JS, et al. Genome-wide DNA methylation profile of peripheral blood lymphocytes from subjects with nonsteroidal anti-inflammatory drug-induced respiratory diseases. Pharmacogenetics and Genomics. 2022;32(6):226-234. DOI: 10.1097/FPC.0000000000000475.

9. Bonetta L. Epigenomics: The new tool in studying complex diseases. Nature Education. 2008;1(1):178. DOI: 10.1038/454795a.

10. Mavioglu RN, Ramo-Fernandez L, Gumpp AM, Kolassa IT, Karabatsiakis A. A history of childhood maltreatment is associated with altered DNA methylation levels of DNA methyltransferase 1 in maternal but not neonatal mononuclear immune cells. Front Psychiatry. 2022;13:945343. DOI: 10.3389/fpsvt.2022.945343.

11. Bhogal B, Weir BA, Crescenzo R, Marien A, Kwon MC, Philippar U, et al. The methyltransferase domain of DNMT1 is an essential domain in acute myeloid leukemia independent of DNMT3A mutation. Commun Biol. 2022;5(1):1174. DOI: 10.1038/s42003-022-04139-5.

Размещено на Allbest.ru