Розподіл поліморфізмів генів IL-10 та TNF-a у хворих на гемофілію А залежно від появи інгібітора

Размещено на http://www.allbest.ru/

ДУ «Інститут патології крові та трансфузійної медицини НАМН України»

ДУ «Інститут спадкової патології НАМН України»

РОЗПОДІЛ ПОЛІМОРФІЗМІВ ГЕНІВ IL-10 ТА TNF-a У ХВОРИХ НА ГЕМОФІЛІЮ А ЗАЛЕЖНО ВІД ПОЯВИ ІНГІБІТОРА

О.В. Стасишин, М.Я. Тиркус,

В.В. Красівська, В.Л. Новак

Львів

Резюме

Представлено результати дослідження взаємозв'язку між генетичними поліморфізмами SNP -1082G>A гена IL-10 та -308 G>A гена TNF-a у 71 хворого на гемофілію А залежно від появи інгібітора ФУШ (45 осіб без інгібітора і 26 з інгібітором ФУШ) віком від 7 до 65 років (медіана віку - 26 років) та осіб контрольної групи, які є вихідцями і проживають на території західних областей України. Виявлено вищу частоту GG генотипу -308 G>A гена TNF-a у хворих на гемофілію з інгібітором порівняно із здоровими особами. Статистично вірогідної різниці у розподілі генотипів поліморфних алелів -1082 G>A гена IL-10 у хворих на гемофілію залежно від наявності інгібітора та контрольною групою не виявлено. Результати дослідження свідчать про те, що в досліджуваній групі переважають інші механізми регуляції імунної відповіді на введений ФУШ. Отримані результати можуть підтверджувати аллоімунний характер інгібітора у хворих на вроджену гемофілію.

Ключові слова: гемофілія, інгібітор, ген, нуклеотидний поліморфізм, IL-10, TNF-a

Резюме

РАСПРЕДЕЛЕНИЕ ПОЛИМОРФИЗМОВ ГЕНОВ IL-10 И TNF-a У БОЛЬНЫХ ГЕМОФИЛИЕЙ А В ЗАВИСИМОСТИ ОТ ПОЯВЛЕНИЯ ИНГИБИТОРА

А.В. Стасишин, М.Я. Тиркус, В.В. Красивська, В.Л. Новак ДУ «Институт патологии крови и трансфузионной медицины НАМН Украины», Львов ДУ «Институт наследственной патологии НАМН Украины», Львов

Представлены результаты исследования взаимосвязи между генетическими полиморфизмами SNP -1082G> A гена IL-10 и -308 G> A гена TNF-a у 71 больного гемофилией А в зависимости от появления ингибитора ФУШ (45 человек без ингибитора и 26 - с ингибитором ФУШ) в возрасте от 7 до 65 лет (медиана возраста - 26 лет) и лиц контрольной группы, выходцами и проживающих на территории западных областей Украины. Выявлено высокую частоту GG генотипа -308 G> A гена TNF-a у больных гемофилией с ингибитором по сравнению со здоровыми лицами. Статистически достоверной разницы в распределении генотипов полиморфных аллелей -1082 G> A гена IL-10 у больных гемофилией в зависимости от наличия ингибитора и контрольной группой не обнаружено. Результаты исследования свидетельствуют о том, что в исследуемой группе преобладают другие механизмы регуляции иммунного ответа на введенный ФУШ. Полученные результаты могут подтверждать аллоимунний характер ингибитора в больных с врожденной гемофилией.

Ключевые слова: гемофилия, ингибитор, ген, нуклеотидный полиморфизм, IL-10, TNF-a

Summary

POLYMORPHISM OF THE IL-10 AND TNF-a GENES IN PATIENTS WITH HEMOPHILIA A, DEPENDING ON THE SEVERITY AND INHIBITOR

O. Stasyshyn, M. Tyrkus, V. Krasivska, V. Novak SI«Institute of blood pathology and transfusion medicine of UNAMS», Lviv institute of Hereditary Pathology of the Ukrainian National Academy of Medical Sciences Ukraine, Lviv

The results of investigation of the relationship between genetic polymorphisms SNP -1082 G>A gene IL-10 and -308 G>A gene TNF-a in 71 patients with hemophilia A, depending of inhibitor FVIII (45 persons without inhibitor and 26 inhibitor of FVIII) aged 7 to 65 years (median age - 26 years) and the control group, who are from and live in the western areas of Ukraine. We find a higher frequency of GG genotype -308 G>A gene TNF-a in hemophilia patients with inhibitors compared with healthy individuals. Statistically significant differences in the distribution of genotypes of polymorphic alleles -1082 G> A gene IL-10 in patients with hemophilia, depending on the presence of an inhibitor and a control group were not found. The results indicate that in the treatment group prevailed over other mechanisms of regulation of the immune response to FVIII. The results can verify the alloimmune nature of inhibitors in patients with congenital hemophilia.

Keywords: hemophilia, inhibitor, gene nucleotide polymorphism, IL-10, TNF-a.

Вступ

Гемофілія A - вроджене захворювання, яке передається як рецесивна ознака, зчеплена з X-хромосомою, зумовлена дефіцитом або молекулярними аномаліями фактора зсідання крові VIII (ФУШ) і характеризується тяжкими кровотечами різної локалізації. Основним методом профілактики та лікування геморагічних проявів є замісна трансфузійна терапія плазмовими та/або рекомбінантними препаратами ФУШ. Доступність концентрованих вірусінактивованих препаратів ФУШ, запровадження ефективних методів профілактики та лікування кровотеч позитивно вплинуло на якість та тривалість життя хворих. Проте, у 10-30%, з'являються інгібіторні антитіла класу IgG до ФУШ, які інактивують введений з лікувальною метою ФУШ, внаслідок чого лікування хворих ускладнюється та стає більш дороговартісним.

На появу інгібіторів впливають різні фактори, які умовно можна розділити на дві групи: генетичні та пов'язані із лікуванням. Найбільш значущим з них є тип генетичної мутації ФУШ. У пацієнтів з тяжкими генетичними дефектами, такими як великі делеції, нонсенс-мутації, інверсії, в результаті чого практично відсутня молекула OVIII в циркулюючій крові, - набагато більше шансів на розвиток антитіл до екзогенного OVIII [1, 2]. Інші фактори, пов'язані з пацієнтом, що впливають на появу інгібіторів, генетично визначають риси імунологічної відповіді [5, 12, 13]. До них відносяться мутації в генах головного комплексу гістосумісності (МНС) І та ІІ, поліморфізми в генах імунної відповіді. Існує невелика кількість досліджень з цього питання. Зокрема, Astermark і співавт. [1-4] вивчали вплив поліморфізмів у генах інтерлейкінів IL-10, TNF-a на появу інгібітора. Зв'язок цих поліморфізмів з формуванням інгібіторів підтверджує, що поряд із втратою аутотолерантності до OVIII, на ризик появи інгібітора у хворих з тяжкою формою гемофілії А впливають індивідуальні відмінності в імунній відповіді на чужорідний антиген. Взаємодія між молекулярним дефектом та генами імунної відповіді зараз дискутуються.

Метою нашої роботи було вивчити розподіл алельних поліморфізмів генів імунної відповіді, зокрема IL-10 та TNF-a, у хворих на гемофілію А та їх зв'язок із появою інгібітора. інгібітор генетичний поліморфізм гемофілія

Матеріали і методи

Матеріалом дослідження слугували зразки крові 71 особи з гемофілією А, з них 45 хворих без інгібітора (І група), 26 осіб з інгібітором (ІІ група), та контрольної групи. Зразки для досліджень були взяті за інформованою згодою пацієнтів. Контрольна група складалась з 50 осіб без обтяженого генетичного анамнезу. Усі обстежені особи (контрольної та дослідних груп) були вихідцями і проживали на території Західної України.

Діагноз гемофілії А, її тяжкість та наявність інгібітора OVIII встановлювали на основі стандартних коагулологічних методик. Легку форму гемофілії А (рівень OVIII > 5%) виявлено у 9 пацієнтів, середнього ступеня тяжкості (рівень OVIII - 1-5%) - у 24, тяжку (рівень OVIII < 1%) - у 38 осіб.

У всіх пацієнтів дослідної та контрольної груп проводили виділення та очищення ДНК з лейкоцитів периферичної крові методом висолювання за допомогою комерційного набору Diatom DNA Prep 200 (ООО «Лаборатория Изоген», Росія).

Ампліфікацію послідовностей ДНК in vitro проводили, використовуючи метод полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР). ПЛР проводили в автоматичному режимі на термоциклері Терцик («ДНК-технология», Росія). Специфічність ПЛР-продуктів визначали за послідовністю специфічних праймерів, температурою відпалу та складом реакційного буферу.

Для детекції однонуклеотидних поліморфізмів SNP 1082G^A гена IL-10 та TNF-a 308G>A застосовували алель-специфічну ПЛР.

Візуалізацію та аналіз продуктів ПЛР проводили шляхом електрофорезу в 2% агарозному гелі, який містив бромистий етидій; електрофореграми сканували на ультрафіолетовому трансілюмінаторі ECX-15.M («Vilber Lourmat», Франція). Результати сканування гелів фотографували цифровою камерою Gel Imager («Helicon», Росія) при довжині хвилі 256 нм.

Перевірку статистичних гіпотез проводили на рівні значущості р<0,05. Оцінювали співвідношення шансів (OR) з 95% довірчими інтервалами (CI) (Schlesselman, 1982). Для порівняння якісних характеристик (таблиці частот) застосовували критерій х² і точний критерій Фішера при малому об'ємі сукупності (<30 випадків) у разі таблиць 2«2. Вірогідність отриманих результатів оцінювали на рівні достовірності не менше 95% (р<0,05).

Результати та обговорення

Поліморфні варіанти генів, що кодують цитокіни та імунорегуляторні фактори, за даними багатьох дослідників, впливають на сприйнятливість до антитіло-опосередкованих аутоімунних хвороб, зокрема, таких як системний червоний вовчак (СКВ) та міастенія (MG).

Точкові однонуклеотидні варіації SNP (від англ. Single Nucleotide Polymorphism) здатні формувати генотипи низької, помірної та високої експресії гена IL-10. На сьогоднішній день в промоторній частині гена IL10 описано більше десяти різноманітних SNP. Найбільш дослідженими вважаються SNP -1082 A^G,-819 T^C та -592 A^C. Важливою властивістю, виявленою при дослідженні SNP промотора гена IL-10, є формування алелів та генотипів схильності до виникнення низки патологічних відхилень, як правило мультифакторної патології [6].

В роботі апробовано методику молекулярно-генетичного дослідження поліморфних варіантів 1082G-A гена IL-10 за допомогою алельспецифічної ПЛР. Для даного дослідження проводили дві ПЛР для алелі G та алелі А. В результаті ПЛР реакції синтезуються фрагменти величиною 161 п.н. (для алелів G або А) та 313 п.н. для контрольного фрагменту. Аналіз продуктів ПЛР проводили шляхом електрофорезу на камері для горизонтального електрофорезу в 2% агарозному гелі. Результати молекулярно-генетичного дослідження поліморфних варіантів 1082G - A гена IL10 представлено на рис. 1.

За результатами генетичного тестування і статистичних розрахунків встановлено розподіл SNP 1082G^A гена IL-10 у пацієнтів з гемофілією залежно від наявності інгібітора (табл. 1). Частота G-алелі у хворих на неускладнену гемофілію А дещо вища (60,0%) порівняно як з хворими на гемофілію з інгібітором, так і з контролем (51,0%), але різниця не істотна.

Рис. 1 Електрофореграма алель-специфічної ПЛР реакції (2% агарозний гель): 1 - маркери молекулярної ваги (Ladder 100 bp); 2,3 - генотип АА; 4,5 - генотип AA; 6,7 - генотип GA

Таблиця 1

Поліморфізм -1082 G>A IL-10 у хворих на гемофілію залежно від наявності інгібітора