Вплив комлексу вітамінів-антиоксидантів групи "В" на процеси перекисного окислення ліпідів у зразках пуповинної крові під час кріоконсервування

Размещено на http://allbest.ru

ДУ «Інститут гематології та трансфузіології НАМН України»

Вплив комлексу вітамінів-антиоксидантів групи «В» на процеси перекисного окислення ліпідів у зразках пуповинної крові під час кріоконсервування

М.Ю. Аношина, Т.О. Калиниченко

Київ

Резюме

У статті представлені результати дослідження впливу комплексу вітамінів-антиоксидантів групи «В» на активність перекисного окислення ліпідів у суспензіях ядровмісних клітин пуповинної крові в процесі кріоконсервування.

Ключові слова: перекисне окислення ліпідів, пуповинна кров, вітаміни-антиоксиданти, кріоконсервування, ядровмісні клітини.

Резюме

Влияние комплекса витаминов-антиоксидантов группы «в» на процессы перекисного окисления липидов в образцах пуповинной крови во время криоконсервирования

М.Ю. Аношина, Т.А. Калиниченко

ГУ «Институт гематологии и трансфузиологии НАМН Украины», Киев

В статье представлены результаты исследования влияния комплекса витаминов-антиоксидантов группы «В» на активность перекисного окисления липидов в суспензиях ядросодержащих клеток пуповинной крови в процессе криоконсервирования.

Ключевые слова: перекисное окисление липидов, пуповинная кровь, витамины-антиоксиданты, криоконсервирование, ядросодержащие клетки.

Summary

Complex of the vitamins-antioxidants group «в» effect on the lipid peroxide oxidation processes in cord blood patterns during their cryopreservation

M. Yu. Anoshyna, T.O. Kalynychenko

SI «Institute of Haematology and Transfusiology of NAMS of Ukraine», Kyiv

Research results of the complex of the vitamins- antioxidants group «В» effect on the peroxide oxidation activity of lipids in umbilical cord blood nuclear cells suspensions in the cryopreservation process has been described in this article.

Key words: lipid peroxide oxidation, umbilical cord blood, vitamins- antioxidants, cryopreservation, nuclear cells.

Вступ

Максимальне збереження структури і функції клітин є найголовнішою метою сучасної кріобіології. На сьогоднішній день теорія пошкодження клітин надає важливої ролі активації процесів вільнорадикального окислення (ВРО), перш за все, перекисного окислення ліпідів (ПОЛ). Накопичення проміжних молекулярних продуктів ліпопероксидаціїї спричиняє швидку мембранопошкоджуючу та цитотоксичну дію. Так, поява активних гідрофільних продуктів ПОЛ може зруйнувати безперервність ліпідного бішару мембрани у її гідрофобних ділянках, а також структуру та функції мембранних білків. У результаті можуть відбутися різного ступеня негативні зміни координації і специфічності мембранних процесів аж до незворотних. Захист клітини залежить від здатності антиоксидантної системи (АОС) протидіяти окислювальному стресу. Отже, збереження гомеостазу клітини залежить від підтримки рівноваги у функціонуванні систем ПОЛ-АОС [1]. Дослідженнями, проведеними у 2010-2011 рр. [2-5], переконливо доведено, що при кріоконсервуванні суспензії ядровмісних клітин (ЯВК) пуповинної крові (ПК) (на етапі підготовки до заморожування і при розморожуванні) на фоні пригнічення АОС відбувається активація процесів ПОЛ. У даній роботі розглядається можливість корекції зазначених порушень за допомогою комплексу вітамінів-антиоксидантів групи «В». Важливість таких досліджень викликана необхідністю підвищення якості розморожених трансплантатів гемопоетичної тканини ПК для використання при лікуванні хворих із супресіями імуногемопоезу [6].

Мета роботи - вивчити вплив вітамінів-антиоксидантів групи «В» на активність процесів ПОЛ у зразках ЯВК ПК у процесі кріоконсервування для подальшого клінічного застосування.

Матеріали і методи дослідження

Зразки ПК отримували методом «замкненої» системи. Як стабілізатор рідкого стану крові використовували консервант ЦФДА-1. Кріоконсервування ПК проводили за способом ДУ «ІГТ НАМН» [7] під захистом кріоконсервуючого середовища з кріопротектором диметилсульфоксид (ДМСО) в кінцевій концентрації 5% без додавання антиоксидантів (І група зразків) та в їхній присутності (ІІ група зразків). Як антиоксиданти використовували комбінацію вітамінів-антиоксидантів групи «В» (ВАО) у складі препарату Nerviplex (Janssen Pharmaceutica, Бельгія). ВАО додавали до суспензії ЯВК за допомогою мікропіпетки за 5, 10, 15 та 30 хв до початку експозиції з кріопротектором або після неї. ВАО використовували в концентраціях - N, 2N, 3N та 4N (у розрахунку: N = 0,4 мкл/мл готової до кріоконсервування суспензії ЯВК ПК). Активність процесів перекисного окислення нейтральних ліпідів і фосфоліпідів визначали за спектрофотометричним методом І.А. Волчегорського в нашій модифікації [8] за концентрацією дієнових (ДК), триєнових (ТК), оксодієнових (ОДК) кон'югатів, основ Шифа (ШО), а також субстратів ПОЛ (за вмістом ізольованих подвійних зв'язків - ІПЗ). Усі показники ПОЛ надані у перерахунку на 1-10⁶/мл ЯВК. Статистичну обробку отриманих даних проводили за допомогою методів варіаційної статистики з використанням комп'ютерної програми Microsoft Excel XP (визначення достовірності різниці вибіркових середньоарифметичних значень із використанням т-критерію Стьюдента).

Результати досліджень та їх обговорення

Встановлено, що після розморожування в І групі зразків, які консервували за способом [7] без додавання ВАО, за всіма показниками перекисного окислення як нейтральних ліпідів, так і фосфоліпідів відбувається вірогідне збільшення рівня продуктів ПОЛ. При пероксидації нейтральних ліпідів ІПЗ зростає на (0,205±0,005) E/мл; ДК - на (0,171±0,003) E/мл; ТК - на (0,052±0,002) E/мл; ОДК - на (0,049±0,002) E/мл; ШО - на (0,004±0,001) E/мл. Ця група є контрольною для оцінки ефективності застосування антиоксидантів у всіх подальших дослідженнях. Як свідчать результати дослідження, при додаванні ВАО у концентрації N до суспензії ЯВК ПК (ІІ група зразків) після внесення розчину ДМСО не відбувається активації процесів ПОЛ, що підтверджує вірогідне зниження в зразках після відтаювання концентрації ІПЗ - (0,570±0,009) E/мл; ДК - (0,175±0,006) E/мл; ТК - (0,032±0,002) E/мл; ОДК - (0,028±0,002) E/мл - при пероксидації нейтральних ліпідів та ДК - на (1,190±0,106) E/мл - фосфоліпідів. При збільшенні концентрації ВАО у 2 рази вірогідних розбіжностей у показниках ПОЛ під час проведення повного циклу заморожування - відтаювання не відмічено, що є також позитивним фактом. Порівняно з І групою зразків ПК у присутності ВАО в обох концентраціях знижується вміст ШО, на що вказує достовірна різниця показників до та після заморожування: без ВАО - (0,004±0,001) E/мл та при його додаванні - (0,001 ±0,0004) E/мл. Отримані дані свідчать про позитивний вплив антиоксиданту щодо збільшення стабільності клітинних мембран. У наступній серії дослідів вивчали вплив двох концентрацій ВАО (N і 2N) при чотирьох варіантах терміну експозиції (5, 10, 15 та 30 хв) до моменту введення у суспензію ЯВК ПК розчину кріопротектора. Встановлено позитивний ефект дії антиоксиданту на процеси ПОЛ за всіма досліджуваними параметрами. При цьому найбільшому зниженню активності процесів перекисного окислення як нейтральних ліпідів, так і фосфоліпідів у зразках після розморожування сприяє варіант концентрації 2N з терміном експозиції у 10 хв (табл.).

Таблиця

Вплив комплексу вітамінів-антиоксидантів групи «В» на показники ПОЛ у зразках ЯВК ПК на етапах процесу кріоконсервування (експозиція з антиоксидантом - 10 хв), M+m

Примітки: 1. ? - різниця показників до (a) - і після розморожування (b);

2. p*- вірогідна різниця показників;

3. ІІ-А група - концентрація ВАО дорівнює N;

4. II-В група - концентрація ВАО дорівнює 2N.

У разі підвищення концентрації ВАО до 3N (1,2 мкл/мл) і 4N (1,6 мкл/мл) при пероксидації фосфоліпідів спостерігається статистично достовірне зростання показника ШО відповідно в 1,7 та 2 рази, що свідчить про порушення механізму шифоутворення. Також при концентрації антиоксиданта 4N в розморожених зразках ПК відбувається достовірна активація процесів перекисного окислення нейтральних ліпідів, але рівень її є значно нижчий, ніж у зразках І групи.

Таким чином, результатами дослідження доведено, що найбільше зниження концентрації продуктів перекисного окислення як нейтральних ліпідів, так і фосфоліпідів після розморожування в зразках ПК відбувається при застосуванні ВАО у концентрації 2N за 10 хв до початку експозиції з кріопротектором ДМСО. Це співпадає з результатами вивчення впливу дослідженого антиоксиданту на збереженість ЯВК ПК, у тому числі і клітин-попередників гемопоезу, в процесі кріоконсервування зазначеним способом [9, 10]. Можна припустити, що позитивний вплив ВАО на процеси ПОЛ пов'язаний з тим, що дія речовин з антиоксидантними властивостями спрямована як на ефективну елімінацію первинних АФК, так і на утилізацію жирнокислотних і ліпідних гідроперекисів, у тому числі, через механізм шифоутворення. окислювальний кріоконсервування пуповинний кров

Висновки

1. Встановлено, що найбільшому зниженню показників ПОЛ при проведенні повного циклу заморожування - відтаювання способом ДУ «ІГТ НАМН» сприяє експозиція ЯВК ПК при підготовці до кріоконсервування з комплексом вітамінів - антиоксидантів групи «В» у концентрації 2N (0,8 мкл/мл кінцевого об'єму суспензії клітин) за 10 хв до внесення розчину кріопротектора.

2. Доведено правомірність використання показників ПОЛ як додаткових критеріїв оцінки функціональної повноцінності клітин у процесі кріоконсервування.

Література

1. Горожанская Э.Г. Свободнорадикальное окисление и механизмы антиоксидантной защиты в нормальной клетке и при опухолевых заболеваниях (лекция) / Э.Г. Горожанская // Клиническая лабораторная диагностика. - 2010. - № 6. - С. 28-44.

2. Аношина М.Ю. Характеристика процесів перекисного окислення ліпідів у зразках пуповинної крові на етапах кріоконсервування / М.Ю. Аношина, Т.О. Калиниченко // Гематологія і переливання крові: міжвідомчий збірник. - К.: Атіка-Н, 2010. - Вип. 35. - С. 139-147.

3. Михайлова О.А. Оценка состояния антиоксидантной системы ядросодержащих клеток кордовой крови до и после криоконсервирования / О.А. Михайлова, Бабийчук, В.В. Рязанцев, П.М. Зубов // Актуальні питання гематології та трансфузіології: матеріали науково-практичної конференції за участю міжнародних спеціалістів, присвяченої 75-річчю ДУ «Інститут гематології та трансфузіології НАМН України» (м. Київ, 27-28 жовтня 2011 р.). - К.: Атіка-Н, 2011. - С. 100-101.

4. Зв'язок показників окисно-відновлювального метаболізму та якості ядровмісних клітин пуповинної крові під час кріоконсервування / П.М. Перехрестенко, М.Ю. Аношина, Т.О. Калиниченко [та ін.] // Український журнал гематології та трансфузіології. - 2011. - № 4. - С. 22-55.

5. О возможности использования показателей перекисного окисления липидов для оценки эффективности низкотемпературного хранения пуповинной крови / П.М. Перехрестенко, М.Ю. Аношина, Т.А. Калиниченко [и др.] // Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии: тезисы Всероссийской научно-практической конференции (г. Санкт-Петербург, 5-7 июля 2011 г.). -Трансфузиология. - 2011. - Том 12. - № 2. - С. 92-93.

6. Paulson K. The role of allogeneic stem cell transplantation for adult acute lymphoblastic leukemia / K. Paulson, D. Szwajcer, M.D. Seftel // Transfusion and Apheresis Science. - 2011. - Vol. 44. - № 2. - P. 197-203.

7. Пат. № 56992 UA МПК А0Ш 1/02 A 61K 35/14. Спосіб кріоконсервування ядровмісних клітин пуповинної/плацентарної крові / Перехрестенко П.М., Калиниченко Т.О., Глухенька Г.Т. (UA); заявник і патентовласник ДУ «ІГТ АМНУ» (UA). - № u 201006071, заявл. 19.05.2010; опубл. 10.02.2011, Бюл. № 3.

8. Аношина М.Ю. Оцінка перекисного окислення ліпідів у зразках кріоконсервованої пуповинної крові / Аношина М.Ю., Т.О. Калиниченко, Г.Т. Глухенька // Український журнал гематології та трансфузіології. - 2011. - № 3. - С. 12-15.

9. Вітаміни-антиоксиданти: вплив на функціональну активність клітин попередників гемопоезу кріоконсервованої пуповинної крові в культурі тканини / Т.О. Калиниченко, М.Ю. Аношина, В.В. Балан [та ін.] // Збірник наукових праць співробітників НМАПО імені П.Л. Шупика. - 2011. - Вип. 20, книга 3. - С. 617-621.

10. Антиоксидантний захист кріоконсервованих ядровмісних клітин пуповинної крові / П.М. Перехрестенко, М.Ю.Аношина, Т.О. Калиниченко [та ін.] // Актуальні питання гематології та трансфузіології: матеріали науково-практичної конференції за участю міжнародних спеціалістів, присвяченої 75-річчю ДУ «Інститут гематології та трансфузіології НАМН України» (м. Київ, 27-28 жовтня 2011 р.). - К.: Атіка-Н, 2011. - С.115-117.

Размещено на Allbest.ru