Особливості розподілу і характеристика молочних плям брижі кишківника у щурів в нормі та при спайковій хворобі

Размещено на http://www.allbest.ru/

Особливості розподілу і характеристика молочних плям брижі кишківника у щурів в нормі та при спайковій хворобі

Пайдаркіна А.П., Кущ О.Г., Запорізький національний університет

Вступ. Процес спайкоутворення і, як наслідок, хронічне запалення впливають на лімфоїдні елементи (плями Пейєра, солітарні фолікули), присутні в очеревині та підслизовій оболонці кишечника, викликаючи патологічну імунну відповідь. Проблема візуалізації молочних плям в різних структурах очеревини залишається відкритою. Незважаючи на те, що ще в 1921 році вчені наголошували на наявності молочних плям у в черевній порожнині та їх велике біологічне значення, результатів експериментальних досліджень, пов'язаних з молочними плямами все ще залишається відносно мало. Новизна полягає у дослідженні особливостей розподілу молочних плям у брижі кишківника при спайковій хворобі у щурів у порівнянні з нормою.

Мета: виявити молочні плями, дослідити топографію і їх структуру в брижі кишківника в нормі та при спайковій хворобі. Матеріали і методи: препарування, макроскопічний, мікроскопічний, гістологічний (виготовлення плівкових препаратів), фарбування гематоксиліном і еозином. Висновки. Молочні плями брижі кишківника щурів інтактної групи представлені утвореннями округлої форми, діаметром 1-2 мкм, білого кольору, рівномірно дифузно розташованими по площі брижі тонкого та товстого кишківника. Мікроскопічно характеризуються як скупчення лімфоцитів, плазматичних клітин і макрофагів, що належать до лімфоїдної тканини FALC. Площа молочних плям очеревини в експериментальних групах варіюється в залежності від перебігу процесу спайкоутворення. У тварин ІІ експериментальної групи на 7 добу спостерігалися поодинокі дрібні грануляції білого і сірого кольорів. На 14 добу спостережень у ІІІ групи діаметр молочних плям становив 2-2,5 мм, вони мали вигляд білих зернистих скупчень. На 21 добу у тварин IV групи спостерігали рясне скупчення еліпсоподібних білястих структур діаметр яких складав 3-4 мм поблизу судин, і значно відрізнявся від показників інших груп.

Ключові слова: тонка кишка, очеревина, спайкова хвороба, молочні плями, гістологічні зміни, морфометрія, лімфоцит, щури. Зв'язок з науковими темами.

Summary

Distribution and characteristics of mesenteric milk spots in healthy rats and those with adhesion disease

Paydarkina A.P., Kush O.G.

Introduction. The adhesion process occurs in more than 80% of cases after all abdominal operations. The process of adhesion formation and, as a consequence, chronic inflammation involve the lymphoid elements (Peyer's spots, solitary follicles) present in the peritoneum and submucosa of the intestine, causing a pathological immune response. Fat-associated lymphoid clusters (FALCs), known as mammary structures, are also found in other fat reservoirs, such as the pericardium, mediastinum, and pleural cavity. The problem of visualizing milk spots in various structures of the peritoneum remains open. Relevance. Despite the fact that as early as 1921, scientists emphasized the presence of milk spots in the abdominal cavity and their great biological significance, the results of experimental studies related to milk spots are still relatively few. The novelty consists in investigating the peculiarities of the distribution of milk spots in the mesentery of the intestine with adhesion disease in rats in comparison with the health animals.

Objective of this study is to detect milk spots, to investigate their topography and structure in the mesentery of the intestine in the health and in adhesion disease.

Materials and methods: The experiment involved tissue preparation, macroscopic examination, histological analysis of hematoxylin and eosin-stained film preparations.

Results. Milk spots of the intestinal mesentery in rats from the intact group are represented by round formations, 1-2 ^m in diameter, white in color, uniformly and diffusely located on the area of the mesentery of the small and large intestine. Microscopically, they are characterized as a cluster of lymphocytes, plasma cells, and macrophages belonging to FALC lymphoid tissue. The area of milk spots of the peritoneum in the experimental groups varies depending on the course of the process of adhesion formation. Individual small white and gray granulations were observed in the animals of the II experimental group on the 7th day. On the 14th day of observation in the III group, the diameter of the milk spots reached 2-2.5 mm, they appeared as white granular clusters. On the 21st day, the animals of the IV group demonstrated an abundant accumulation of elliptical whitish structures, 3-4 mm in diameter near the blood vessels that differed significantly from the indicators of the other groups.

Conclusion. The study has expanded knowledge regarding the distribution and composition of milk spots in the normal mesentery compared to those observed in adhesion disease. According to data obtained, milk spots are lymphoid tissue, represented by various types of lymphocytes, macrophages and plasma cells. The question of whether the lymphocytes found in the milk spots belong to different subpopulations, the dynamics of their number during the main stages of adhesion formation, remains an open question requiring further scientific research.

Key words: small intestine, peritoneum, adhesion disease, milk spots, histological changes, morphometry, lymphocyte, rats.

Вступ

Спайкова хвороба на сьогоднішній день вважається поліетіологічним захворюванням. За даними низки досліджень вітчизняних та зарубіжних авторів, причини виникнення спайкового процесу можуть бути ендогенними або екзогенними [1]. Вважається, що більшість спайок черевної порожнини розвиваються внаслідок хірургічних втручань. Подібна захворюваність (60-80% випадків) зумовлена механічним подразненням і, як наслідок, утворенням внутрішньочеревних спайок, що і є основною причиною гострої спайкової тонкокишкової непрохідності в ранньому та віддаленому післяопераційному періоді [2].

Найчастішими причинами виникнення спайок є інтраопераційна травма внаслідок грубого поводження з хірургічними інструментами, пошкодження мезотелію сухою марлею, а також інтраопераційна резекція ділянки очеревини [3].

Процес спайкоутворення і, як наслідок, хронічне запалення впливають на лімфоїдні елементи (молочні плями, солітарні фолікули), присутні в очеревині та підслизовій оболонці кишечника, викликаючи патологічну імунну відповідь [4]. У людей молочні плями варіюють за розміром від 0,5 мм² до 3,5 мм², тоді як у експериментальних тварин зазвичай є меншими (0,1-3 мм²) [5].

Молочні плями представляють собою невеликі тканинні агрегати, присутні в різних структурах, включаючи плевру і перикард, брижу кишківника, а також великий чепець. Вони складають ся з імунних клітин переважно навколо кровоносних капілярів і частково вкриті мезотеліальними клітинами [9].

З моменту вивчення молочні плями ідентифікували як структури зі здатністю фагоцитувати чужорідні речовини в перитонеальній порожнині, пізніше вони були визнані лімфоїдною тканиною, яка бере активну участь в імунних реакціях серозних порожнин [6, 10].

Проблема візуалізації молочних плям в різних структурах очеревини залишається відкритою. Полтавська школа морфологів під керівництвом професора Костиленко Ю.П. займається вивченням молочних плям в структурах великого чепця [10]. Враховуючи результати їх роботи і роботи Havrlentova L. (2017) та Schurink B (2019), які з цією метою занурювали фрагменти чепця в гематоксилін, нами був запропонований ще один шлях візуалізації молочних плям за методом професора Волошина М. А. [8].

Жироасоційовані лімфоїдні скупчення (FALC), відомі як структури, подібні до молочних плям, також зустрічаються в інших жирових резервуарах, таких як перикард, середостіння та плевральна порожнина. Дані елементи характеризуються структурною подібністю, містять однакові популяції лімфоцитарних клітин і виконують схожі функції. Однак молочні плями відрізняються найбільшою кількістю клітинних популяцій на грам тканини порівняно з FALC [8]. На сьогоднішній момент серед морфологів існує дискусія щодо приналежності лімфоїдних кластерів, асоційованих з жировою тканиною, FALC до молочних плям [10, 18].

Помічено, що молочні плями з'являються в середньому ембріональному періоді і зберігаються до кінця життя [9]. У середньому віці вони менш помітні через відкладення жирової тканини [10]. Детальна будова молочних плям і на сьогодні залишається відкритою проблемою морфології. Тому виникає потреба розробити спосіб детальнішої візуалізації молочних плям в структурі жирової тканини.

За даними Schurink B. (2019) залежно від віку та загального стану органів черевної порожнини і організму в цілому клітинний склад плям може варіюватися [11]. Враховуючи існуючі дані про будову молочних плям, Liu Y. (2021) вважає їх ретикулоендотеліальними [12]. Скупчення лімфоїдної тканини в очеревині і її структурах розглядаються як молочна пляма, функція яких тісно пов'язана з лімфатичною системою. Тому Yildirim A. (2010) і Hryn V. (2022) вважають подібні лімфоїдні скупчення імунними фабриками черевної порожнини [9,13]. Незважаючи на те, що ще в 1921 році вчені наголошували на наявності молочних плям у в черевній порожнині та їх велике біологічне значення, результатів експериментальних досліджень, пов'язаних з молочними плямами все ще залишається відносно мало.

На сьогодні існує необхідність у деталізації клітинного складу молочних плям в нормі і під дією чинників різної природи.

Новизна роботи полягає у дослідженні особливостей розподілу молочних плям у брижі кишківника при спайковій хворобі у щурів у порівнянні з нормою.

Мета. Виявити молочні плями, дослідити топографію і їх структуру в брижі кишківника в нормі та при спайковій хворобі.

Матеріали та методи дослідження

Препарування, макроскопічний, мікроскопічний, гістологічний (виготовлення плівкових препаратів), забарвлення гематоксиліном і еозином, математичний.

Дослідження виконувались на самцях білих щурів з масою тіла 190-240 г (n=20). Лабораторні тварини утримувались в стандартних умовах віварію з 12-годинним режимом освітлення при температурі (22±2) °С, відносній вологості повітря (55±5) %. Під час проведення експерименту тварин тримали у віварії з природним циклом світло-темрява, регулювали температуру та вологість навколишнього середовища на стандартному раціоні харчування за умов вільного доступу до корму і питної води.

Експериментальна модель патологічного стану, що досліджується, повинна відповідати вимогам легкої відтворюваності і супроводжуватися низькою летальністю тварин, а також бути адекватною клінічному стану [14]. Всі відомі експериментальні моделі базуються на ініціації запалення мезотеліальної внаслідок її пошкодження. Відмінності між ними полягають у методах або діючих агентах, та їх характері [15].

Застосування суспензії тальку в процесі утворення перитонеальних спайок у тварин в експерименті являється найдоступнішим з точки зору вартості, найзручнішим у виконанні, оптимальним і малоінвазивним способом моделювання спайкової хвороби [16].

Шляхом випадкового відбору тварин розділили на 4 групи. І група (n=5) - інтактні тварини. Внутрішньоочеревинно щурам II (n=5), Ill (n=5) і IV груп вводили 0,5 мл 20% суспензії тальку. Водну суспензію речовин готували на воді для ін'єкцій і вводили шприцем у ділянку малого таза.

Тварин II, Ill і IV груп виводили з експерименту на 7, 14 та 21 добу експерименту шляхом наркозування хлороформом. Розтин і забір матеріалу для подальших досліджень виконувалися в умовах адекватної анестезії з дотриманням нормативів Конвенції з біоетики Ради Європи 1997 року, Європейської конвенції про захист хребетних тварин, які використовуються для експериментальних та інших наукових цілей, загальних етичних принципів експериментів на тваринах, ухвалених Першим національним конгресом України з біоетики (2001 р).

Виявлення та дослідження молочних плям у структурах брижі тонкого кишківника проводили за допомогою пікринової кислоти з подальшим вивченням їх топографії та морфологічних особливостей за допомогою лупи [8]. Їснуючі методи забору та отримання плівкових зразків наразі потребують подальшого розвитку та вдосконалення.

Вивчали нативні препарати брижі тонкого кишківника в нормі та в експерименті з деталізацією розташування молочних плям в препараті та подальшою фотодокументацією. Також виготовляли фіксовані препарати. Зразки плівки брижі тонкої кишки відбирали у щурів усіх груп та переносили на продезінфіковану поверхню з тонкого пінопласту розміром 1х1 см, щоб не допустити викривлення структури, характерної для плівчастого матеріалу [17].

Фіксували в 10% нейтральному формаліні протягом 24 годин з наступним 2-годинним промиванням у проточній воді. Забарвлення гематоксиліном та еозином проводили звичайним способом (2-5 хв у гематоксиліні Ерліха, 0,5-1 хв в 1% розчині еозину з періодичною диференціацією 1% HCL). Підготовлені плівкові зразки занурювали в желатин-гліцерин середовище і вивчали на різних збільшеннях мікроскопа.

Результати дослідження

Морфологічне дослідження черевної порожнини щурів груп дозволило отримати дані про топографію, кількість і морфологію молочних плям у брижі тонкого кишківника. Застосування пікринової кислоти дозволило визначити топографію, розмір і морфологію лімфоїдної тканини (рис. 1).

В нормі молочні плями брижі кишківника щурів інтактної групи представлені утвореннями округлої форми; діаметром 1-2 мкм; білого кольору; рівномірно дифузно розташованими по площі брижі тонкого та товстого кишківника. Підтверджується, що молочні плями мають переважно неправильну еліпсоподібну форму, що нагадує поодиноку білясту зернистість поблизу лімфоїдних вузлів і кровоносних капілярів.

Рис. 1. Брижа тонкого кишківника. Нативнии плівковий препарат: а) візуалізація молочних плям в структурах брижі: 1 - тонкий кишківник, 2 - молочні плями, 3 - кровоносні судини; б) візуалізація молочних плям шляхом підфарбування структур брижі пікриновою кислотою: 1 - тонкий кишківник, 2 - молочні плями, 3 - кровоносні судини.

Результати дослідження показали, що площа молочних плям очеревини в різних експериментальних групах варіюється. Так у тварин ІІ експериментальної групи на 7 добу спостерігалися поодинокі дрібні грануляції білого і сірого кольорів. На 14 добу спостережень у ІІІ групи діаметр молочних плям становив 2-2,5 мм і мали вигляд білих зернистих скупчень. На 21 добу у тварин !V групи спостерігали рясне скупчення еліпсоподібних білястих структур поблизу судин, діаметр яких складав 3-4 мм і значно відрізнявся від показників інших груп.

Виявлено, що молочні плями мають переважно неправильну овальну, частіше витягнуту форму у досліджуваних тварин ІІІ і !V експериментальних груп і локалізуються переважно поблизу судин. Відмічено, що загальна картина топографії молочних плям в експериментальних групах є подібною до їх топографії у тварин інтактної групи, однак впродовж експерименту простежується збільшення їх діаметру і кількість скупчень. У більшості випадків вони локалізуються навколо кровоносних судин.

Експериментально доведено, що при прогресуванні спайкового процесу кількісні показники імунореактивності підвищуються у порівнянні до норми на тлі збільшення кількості лімфоцитів на одиницю площі досліджуваної тканини, що було показано в наших попередніх роботах.

Лімфоцити зазвичай представлені дифузно (I інтактна група) і характеризуються наявністю округлих невеликих клітин діаметром 8-9 мкм з чіткими ядрами. Деякі з них мають широкий край цитоплазми.

В брижі тонкого кишківника у щурів кожної експериментальної групи наявні поодиноко розташовані макрофаги, і кількість їх приблизно в два рази менша, за досліджену кількість лімфоцитів в брижі тонкої кишки.

У тварин І і ІІ експериментальних груп, візуально, простежується незначна кількість плазматичних клітин на досліджувану стандартну площу. Їх кількість проявляє тенденцію до зростання у ІІІ і !V групах залежно від прогресування процесів спайкоутворення.

Обговорення одержаних результатів

Багато дослідників вважають, що молочні плями є спеціалізованими структурами, які відіграють ключову роль в очищенні порожнини під час запального процесу. Мезотеліальні клітини є регуляторами цієї складної взаємодії між очеревиною та імунною системою через продукцію цитокінів, презентацію антигенів та фагоцитарні функції [11, 18].

Молочні плями - це спеціалізовані утворення, що беруть участь у специфічних імунологічних реакціях, а клітини, що входять до складу плям, здійснюють фагоцитоз сторонніх структур, поглинають бактерії, мікрочастинки, а також синтезують антитіла [19]. Завдяки цьому лімфоїдна тканина має здатність до очищення черевної порожнини. Вважається, що плями також беруть участь у резорбції рідини черевної порожнини [3]. Молочні плями мають овоїдну, округлу або неправильну форму, непрозорі, білуваті, блідо-жовтого кольору і дуже схожі на жирові скупчення [10].

B. Schurink (2019) у своїй роботі представив класифікацію молочних плям. Три типи макул молочної залози класифікуються як: 1) прилеглі до сітчасних структур і межують з жировою тканиною; 2) периваскулярні, 3) поверхневі, які лежать власне на часточках жирових скупчень. Перші два типи молочних плям знаходяться в напівпрозорих ділянках капсул з найменшою кількістю жирової тканини. Останній тип має спостерігається в структурах з найбільшою кількістю жирової тканини [11].

За клітинним складом розрізняють наступні види молочних плям: 1) первинні, що присутні у великому чепці плодів, новонароджених та дітей молодшого віку і містять численні недиференційовані мезенхімальні клітини і не містять адипоцитів; 2) пасивні молочні плями містять численні адипоцити, невелику кількість імунокомпетентних клітин та недиференційовані мезенхімальні клітини; 3) активні молочні плями містять численні лімфоцити, недиференційовані мезенхімальні клітини, фібробласти та макрофаги і невелику кількість адипоцитів [20].

Таким чином, за результатами власних досліджень розширилось уявлення про топографію та структуру молочних плям в нормі в брижі кишківника та після формування спайкової хвороби. За нашими даними молочні плями є лімфоїдною тканиною, представленою різними типами лімфоцитів, макрофагів і плазматичних клітин. Відкритим залишається питання щодо приналежності виявлених в молочних плямах лімфоцитів до різних субпопуляцій, динаміки їх кількості протягом основних етапів спайкоутворення, що і стане метою подальших наукових досліджень.

Висновки

1. Молочні плями брижі кишківника щурів інтактної групи представлені утвореннями округлої форми, діаметром 1-2 мкм, білого кольору, рівномірно дифузно розташованими по площі брижі тонкого та товстого кишківника. Мікроскопічно молочні плями можна охарактеризувати як скупчення лімфоцитів, плазматичних клітин і макрофагів, що належать до лімфоїдної тканини FALC.

2. Розміри молочних плям очеревини в експериментальних групах варіюється в залежності від перебігу процесу спайкоутворення. У тварин ІІ експериментальної групи на 7 добу спостерігалися поодинокі дрібні грануляції білого і сірого кольорів. На 14 добу спостережень у ІІІ групи діаметр молочних плям становив 2-2,5 мм, вони мали вигляд білих зернистих скупчень. На 21 добу у тварин !V групи спостерігали рясне скупчення еліпсоподібних білястих структур поблизу лімфоїдних вузлів і кровоносних капілярів, діаметр яких складав 3-4 мм і значно відрізнявся від показників інших груп.

молочна пляма спайковий брижа кишківник

References

1. Yevtushenko D.O. Prohnozuvannya ta profilaktyka retsydyvu utvorennya spayok pislya operatsiyi u patsiyentiv pry spaykoviy khvorobi ocherevyny, uskladnenoyi hostroyu neprokhidnistyu kyshechnyka [ Prediction and prevention of recurrence of adhesions after surgery in patients with peritoneal adhesions complicated by acute intestinal obstruction]. Klinichna khirurhiya. 2015; 1:13-15. (Ukrainian).

2. Delabrousse E., Lubrano J., Jehl J., Morati P., Rouget C., Mantion G.A., Kastler B.A. Small-bowel obstruction from adhesive bands and matted adhesions: CT differentiation. AJR Am J Roentgenol. 2009 Mar;192(3):693-7.

3. Oliynyk A.Y.E. Dynamika morfolohichnykh zmin stinky tonkoyi kyshky pry modelyuvanni hostroyi kyshkovoyi neprokhidnosti. Otsinka protektyvnoyi diyi riznykh antybiotykiv [Dynamics of morphological changes in the wall of the small intestine during modeling of acute intestinal obstruction. Evaluation of the protective effect of various antibiotics]. Visnyk problem biolohiyi ta medytsyny. 2014; 1:299-303. (Ukrainian).

4. Klymans'kyy R.P., Veselyy S.V. Prohnostychni imunni markery, shcho vyznachayut' protyahom pislyaoperatsiynoho periodu u ditey iz vrodzhenoyu kyshkovoyu neprokhidnistyu [Prognostic immune markers determined during the postoperative period in children with congenital intestinal obstruction]. Medychna informatyka ta inzheneriya. 2016; 1:79-80. (Ukrainian).

5. Havrlentova L., Faistova H., Mazur M., Humenanska A., Polak S. Omentum majus a mliecne skvrny ako vyznamna sasf imunitneho systemu [Omentum majus and milky spots as an important part of the immune system]. Rozhl Chir. 2017 Fall;96(9):383-386. (Czech).

6. Di Nicola V. Omentum a powerful biological source in regenerative surgery. Regen Ther. 2019 Aug 8;11:182-191

7. Seifert E. On the biology of the human large network. Arch Clin Chir. 1921;116:510-517.

8. Voloshyn M.A., Chaykovskyy Y.U.B., Kushch O.G. Osnovy imunolohiyi ta imunomorfolohiyi [Fundamentals of immunology and immunomorphology]. Zaporizhzhia; Kyiv: Zaporizhzhia State Medical University; 2010. 170 p. (Ukrainian)

9. Yildirim A., Aktas A., Nergiz Y/, Akkus M. Analysis of human omentum-associated lymphoid tissue components with S-100: an immunohistochemical study. Rom J Morphol Embryol. 2010;51(4):759-64.

10. Ks'onz I.V., Kostylenko Y.U.P., Lyakhovs'kyy V.I., Konoplits'kyy V.S., Maksymovs'kyy V.Y.E. Molochni plyamy velykoho cheptsya [Milk spots of the big cap]. Aktual'ni problemy suchasnoyi medytsyny. 2023;23(82):135-140. (Ukrainian).

11. Schurink B., Cleypool C.G.J., Bleys R.L.A.W. A rapid and simple method for visualizing milky spots in large fixed tissue samples of the human greater omentum. Biotech Histochem. 2019;94(6):429- 34.

12. Liu Y., Hu J-n, Luo N., Zhao J., Liu S-c., Ma T. The Essential Involvement of the Omentum in the Peritoneal Defensive Mechanisms During Intra-Abdominal Sepsis. Front Immunol. 2021;18(12):631609.

13. Hryn V.H., Drabovskiy V.S., Sytnik D.A., Ryabuschko R.M., Riabuschko M.M., Bilash S.M., et al. Peculiarities Of Morphoetiopathogenesis Of Acute Appendicitis And Consequences After Appendectomy. Wiad Lek. 2022;75(6):1492-9.

14. Zaporozhan V.M., Bazhora Y.U.I., Vorokhta Y.U.M. Molekulyarno-henetychni determinanty vynyknennya mul'tyfaktorial'nykh zakhvoryuvan': suchasnyy stan problemy i perspektyvy doslidzhennya [Molecular and genetic determinants of the occurrence of multifactorial diseases: current state of the problem and research prospects]. Intehratyvna Antropolohiya. 2008; 2(12):4-7. (Ukrainian).

15. Skal's'kyy S.V., Shamray H.A., Dolhykh T.I. Eksperymentalna model perytonealnoho spaykoutvorennya [An experimental model of perineal adhesion formation]. Byuleten eksperymentalnoyi biolohiyi ta medytsyny. 2007; 10:473-475. (Ukrainian).

16. Volyans'ka A.H., Syvokonyuk O.V. Porivnyal'nyy analiz vplyvu sul'fatu bariyu i tal'ku na intensyvnist' spaykovoho protsesu u samok bilykh shchuriv [Comparative analysis of the effect of barium sulfate and talc on the intensity of the adhesion process in female white rats]. Intehratyvna Antropolohiya. 2012; 1(19):58-61.(Ukrainian).

17. Paydarkina A.P., Kush O.G. Doslidzhennya morfolohichnykh osoblyvostey ocherevyny bilykh shchuriv y metodyka yiyi zaboru [Study of the morphological features of the peritoneum of white rats and the method of its collection]. Morphologia. 2023; 17(3):163- 168. (Ukrainian).

18. Liu M., Silva-Sanchez A., Randall T.D., Meza-Perez S. Specialized immune responses in the peritoneal cavity and omentum. J. Leukoc. Biol. 2021 ;109(4):717-729.

19. D'Alessio S., Correale C., Tacconi C., et al. VEGF-C-dependent stimulation of lymphatic function ameliorates experimental inflammatory bowel disease. J Clin Invest. 2014;124:3863-78.

20. Hoober J.K., Eggink L.L., Cote R. Stories From the Dendritic Cell Guardhouse. Front Immunol. 2019;11(10):288-300.

Размещено на Allbest.ru