Метаболізм оксиду азоту в тканинах тонкої кишки щурів за умов хірургічної травми, відтвореної на тлі експериментальної моделі посттравматичного стресового розладу

Размещено на http://www.allbest.ru/

Полтавський державний медичний університет

Метаболізм оксиду азоту в тканинах тонкої кишки щурів за умов хірургічної травми, відтвореної на тлі експериментальної моделі посттравматичного стресового розладу

Рябушко Р.М., Костенко В.О.

Анотація

Досліджено показники системи оксиду азоту у тканинах тонкої кишки щурів за умов хірургічної травми, відтвореної на тлі експериментального посттравматичного стресового розладу (англ. post-traumatic stress disorder, PTSD). Досліди було проведено на 42 білих щурах лінії Вістар масою 210-230 г, розподілених на 6 груп: 1-ша - інтактні тварини, 2-га - після відтворення моделі PTSD - однократного тривалого стресу (англ. single-prolonged stress, SPS), 3-тя - щурам виконували «хибну» операцію, 4-та - тваринам здійснювали лапаротомію, 5-та - щурам після відтворення SPS виконували ««хибну» операцію, 6-та тваринам проводили лапаротомію на тлі модельованого SPS. NO-синтазну активність у гомогенаті тонкої кишки визначали спектрофотометрично. Утворення пероксинітриту оцінювали за вмістом пероксинітритів лужних і лужноземельних металів. Показано, що SPS супроводжується ознаками нітрозативного стресу в тканинах тонкої кишки щурів: підвищується NO-синтазна активність за рахунок активації індуцибельної ізоформи, зменшується активність і спряженість конститутивних N-синтаз, збільшується концентрація пероксинітритів лужних та лужно-земельних металів. На 7-му добу після лапаротомії на тлі відтворення PTSD показники нітрозативного стресу в тканинах тонкої кишки щурів, такі як загальна та індуцибельна NO-синтазна активність та концентрація пероксинітритів лужних та лужно-земельних металів, вірогідно перевищують їх значення після окремого здійснення лапаротомії на тлі модельованого SPS.

Ключові слова: посттравматичний стресовий розлад, однократний тривалий стрес, хірургічна травма, лапаротомія, оксид азоту, NO-синтаза, пероксинітрит, нітрозативний стрес, тонка кишка, щури.

Робота є фрагментом НДР «Високо- та низько інтенсивні фенотипи системної запальної відповіді: молекулярні механізми та нові медичні технології їх профілактики та корекції» 

Summary

NITRIC OXIDE METABOLISM IN RAT SMALL INTESTINE TISSUES FOLLOWING SURGICAL TRAUMA REPRODUCED IN EXPERIMENTAL MODEL OF POSTTRAUMATIC STRESS DISORDER Riabushko R.M., Kostenko V.O.

Key words: posttraumatic stress disorder, single prolonged stress, surgical trauma, laparotomy, nitric oxide, NO synthase, peroxynitrite, nitrosative stress, small intestine, rats.

The article investigates the parameters of the nitric oxide (NO) system in the small intestine tissues of rats subjected to surgical trauma within an experimental model of post-traumatic stress disorder (PTSD). The study involved 42 white Wistar rats weighing 210-230 g, divided into 6 groups: Group 1 comprised intact animals, Group 2 included animals with the PTSD induced through single-prolonged stress (SPS), Group 3 consisted of rats subjected to a sham surgical operation, Group 4 comprised animals undergoing laparotomy, Group 5 involved rats undergoing a sham surgical operation following SPS, and Group 6 included animals undergoing laparotomy under modeled SPS. Nitric oxide synthase (NOS) activity in small intestine homogenates was assessed using spectrophotometric methods; peroxynitrite formation was determined by analyzing the content of peroxynitrite of alkali and alkaline earth metals. The study has demonstrated the SPS results in evident signs of nitrosative stress in the small intestine tissues of rats: it enhances NOS activity by activating the inducible isoform, reduces the constitutive NOS activity and coupling, and elevates the concentration of peroxynitrites of alkali and alkaline-earth metals. On the 7th day following laparotomy under PTSD modelling, nitrosative stress indicators in the small intestine tissues such as total and inducible NOS activity, as well as peroxynitrite concentrations of alkaline and alkaline-earth metals, significantly surpassed their levels following a single laparotomy under simulated single prolonged stress.

Вступ

Посттравматичний стресовий розлад (англ. post-traumatic stress disorder, PTSD) є серйозною мультидисциплінарною проблемою медицини, оскільки призводить не тільки до порушень психічного здоров'я, але і впливає на метаболізм і функції багатьох інших органів і систем, що пов'язують з індукцією за умов PTSD системної запальної відповіді (СЗВ) [1, 2]. Остання також займає центральне місце в патогенезі хірургічної травми [3]. У певних схильних осіб СЗВ може призводити до розвитку синдрому поліорганної недостатності і, зрештою, до смерті. Навіть одноразова лапаротомія здатна спричиняти формування прозапального фенотипу, що характеризується нейроендокринним стресом, активацією імунної системи, метаболічними змінами та коагулопатією [4].

Раніше нами було показано, що відтворення експериментальної моделі PTSD - однократного тривалого стресу (англ. single-prolonged stress, SPS) - супроводжується зростанням концентрації вільного оксипроліну, гексуронових і N- ацетилнейрамінової кислот у гомогенаті тонкої кишки, що свідчить про деполімеризацію компонентів позаклітинного матриксу цього органу - колагену, протеогліканів і сіалоглікопротеїнів. На 7-му добу після лапаротомії на тлі відтворення PTSD вміст продуктів деполімеризації цих біо- полімерів у гомогенаті тонкої кишки вірогідно перевищує відповідні результати за умов окремого здійснення лапаротомії та «хибної» операції на тлі модельованого SPS [5].

Оксид азоту (NO) відіграє важливу роль у захисті слизової оболонки шлунково-кишкового тракту, а також у патогенезі деяких шлунково- кишкових захворювань (наприклад, синдрому подразненого кишечника та запальних захворювань кишечнику) [6]. Потужні цитопротекторні ефекти NO були продемонстровані in vitro та in vivo. Проте висока концентрація або тривала дія цієї молекули, особливо за наявності інших активних форм кисню та азоту, може мати цитотоксичну дію, призводити до збільшення проникності кишкової стінки та розвитку запалення.

Попри те, що низка досліджень була проведена для визначення ролі NO в організмі, більш детальне розуміння його метаболізму в тонкій кишці за умов PTSD і хірургічної травми може розкрити нові молекулярні механізми, важливі для розробки перспективних підходів до лікування та профілактики, спрямованих на безпеку оперативних втручань у осіб з PTSD.

Метою роботи є дослідження показників системи NO у тканинах тонкої кишки щурів за умов хірургічної травми, відтвореної на тлі експериментального PTSD.

Матеріал та методи дослідження

Дослідження були проведені на 42 білих щурах лінії Вістар масою 210-230 г, розподілених на 6 груп: 1-ша - інтактні тварини, 2-га - після відтворення моделі PTSD - SPS, 3-тя - щурам виконували «хибну» операцію, 4-та - тваринам здійснювали лапаротомію, 5-та - щурам після відтворення SPS виконували «хибну» операцію, 6-та тваринам проводили лапаротомію на тлі модельованого SPS.

Евтаназію щурів здійснювали через 7 діб після «хибної» операції або лапаротомії під тіопен- таловим наркозом, дотримуючись положень «Європейської конвенції по захисту хребетних тварин, яких використовують в експериментальних та інших наукових цілях» (Страсбург, 1986).

SPS відтворювали шляхом іммобілізації щурів впродовж 2 годин на металевій пластині, після чого тварин піддавали примусовому плаванню в плексигласовому циліндрі, який був заповнений на 2/3 свіжою водою з температурою 24°C. Після плавання щурів висушували феном та надавали їм 15 хвилин на відновлення перед впливом парів севофлурану (препарат «Сево- ран», AbbVie S.r.l., Італія), доки тварини не втрачали свідомість. Після цього всіх тварин поміщали по дві в клітки і залишали їх в спокої протягом 7-ми діб. Згідно з сучасними літературними джерелами, SPS спричиняє поведінкові та функціональні порушення, подібні до PTSD [8].

Процедура «хибної» операції включала в себе наркоз, епіляцію, фіксацію тварин, стиснення шкіри живота за допомогою затискача Мікуліча одним клацанням без ушкодження тканин.

Хирургічна травма наносилася у вигляді лапаротомії, яку здійснювали за умови внутріш- ньоочеревинного кетамінового наркозу (7 мг/кг на 1 кг маси тіла). Оперативне втручання починали після настання наркотичного сну та досягнення адекватного рівня анестезії. Після гоління операційної ділянки та обробки шкіри антисептичним розчином, виконували лінійний розріз завдовжки 1 см у ділянці гіпогастрію, після чого розсікали м'язи, фасції та очеревину, і через цей розріз виводили петлю тонкої кишки, яку подразнювали масажними рухами вказівного та великого пальців протягом 10 с [9]. Кишку опускали в черевну порожнину, рану ушивали пошарово за допомогою полігліколідної нитки з атравматич- ною голкою (НВО «Біополімер», Україна) з подальшою обробкою антисептиком.

Активність загальної NO-синтази (NOS) та її конститутивної ізоформи (cNOS) [10] у гомогенаті тонкої кишки визначали спектрофотометрично. Активність індуцибельної ізоформи цього ферменту (iNOS) визначали за формулою: активність iNOS = загальна активність nOs - активність cNOS. Утворення пероксинітриту оцінювали за вмістом пероксинітриту лужних і лужноземельних металів [10].

Отримані дані обробляли варіаційно- статистичним методом з використанням критерію Стьюдента.

Результати дослідження

Відтворення SPS суттєво змінювало активність та співвідношення різних ізоформ NOS у гомогенаті тонкої кишки щурів (табл.). За цих умов загальна та індуцибельна активність NO- синтази зростала на 51.2% та 76.1% відповідно (всі при P<0.001) порівняно з контролем. Активність cNOS знижувалася на 50.9% (p<0.001).

Таблиця Активність NO-синтази у гомогенаті тонкої кишки щурів за умов хірургічної травми, відтвореної на тлі посттравматичного стресового розладу (M±m)

Примітка: * - Р<0.05 порівняно з результатами 1-ї групи,

** - Р<0.05 порівняно з результатами 2-ї групи, *** - Р<0.05 порівняно з результатами 3-ї групи,

**** - р<о.о5 порівняно з результатами 4-ї групи, ***** - Р<0.05 порівняно з результатами 5-ї групи.

У «хибнооперованих» тварин активність і співвідношення ізоформ NOS у гомогенаті тонкої кишки не зазнавали достовірних змін порівняно з результатами 1-ї групи. Водночас лапаротомія супроводжувалася підвищенням індукованої активності NOS на 47.5% (P<0,02) при зниженні активності cNOS на 41.9% (P<0.01).

На 7 добу після «хибної» операції у щурів з модельованим SPS активність NOS (як ї, так і її ізоформ) у гомогенаті тонкої кишки достовірно не відрізнялася від значень 2-ї групи. Активність загальної NOS і iNOS на 33.6% (P<0.05) і 49.4% (P<0.01) відповідно перевищувала результати 3- ї групи. При цьому активність сNOS на 57.7% % (P<0.01) була меншою за результати 3-ї групи. кишка хірургічний травма стресовий

На 7-му добу після лапаротомії на тлі змоде- льованого SPS загальна та індуцибельна активність NOS у гомогенаті тонкої кишки зростала в 2.24 та 2.72 раза відповідно (обидві при P<0.001) порівняно з результатами 1-ї групи. Ці показники були на 48.4 і 55.0% вищими (обидва на рівні P<0.001) порівняно зі значеннями 2-ї групи та на % і 85.0% (обидва на рівні P<0.001) порівняно з результатами 4-ї групи. Крім того, активність NOS та iNOS за цих умов перевищувала відповідні значення 5-ї групи на 50.4 і 54.6% (обидва на рівні P<0.001). Активність cNOS у гомогенаті тонкої кишки за цих умов знижувалася на 76.0% (P<0.001) порівняно з результатом 1-ї групи, на 51.2% (P<0.05) - 2-ї групи, на 71.8% (P<0.001) - 3-ї групи, на 58.8% (P<0.01) - 4 групи, але достовірно не відрізнялася від значення 5-ї групи.

За умов моделювання SPS значно зменшувався індекс спряження cNOS у гомогенаті тонкої кишки до 0.026±0.004 (у інтактних тварин - 074±0.005) (рис. 1), тобто на 64.9% (Р<0.001). У «хибнооперованих» тварин значення цього показника становило 0.062±0.009, що не виявляло істотних змін порівняно з результатом 1-ї групи. Виконання лапаротомії супроводжувалося зниженням індексу спряження cNOS до 0.039±0.006 - на 47.3% (Р<0.001).

Рис. 1. Індекс спряження cNOS у гомогенаті тонкої кишки інтактних тварин (1); після відтворення SPS (модель PTSD) (2); «хибнооперованих» щурів (3); після лапаротомії (4); після здійснення «хибної» операції на тлі змодельованого SPS (5); після лапаротомії на тлі змодельованого SPS (6).

Рис. 2. Вміст пероксинітритів лужних та лужно-земельних металів у гомогенаті тонкої кишки інтактних тварин (1);

після відтворення SPS (модель PTSD) (2); «хибнооперованих» щурів (3); після лапаротомії (4); після здійснення «хибної» операції на тлі змодельованого SPS (5); після лапаротомії на тлі змодельованого SPS (6).

На 7-му добу після виконання «хибної» операції на тлі змодельованого SPS індекс спряження cNOS у гомогенаті тонкої кишки зменшувався до 0.018±0.005, тобто на 75.7% (Р<0.001) щодо значення 1-ї групи, але вірогідно не відрізнявся від значення 2-ї групи. Водночас порівняно зі значеннями 3-ї та 4-ї груп спостерігалося зменшення цього показника на 71.0% (р<0.01) та 53.8% (Р<0.02) відповідно.

На 7-му добу після лапаротомії на тлі змоде- льованого SPS індекс спряження cNOS зменшувався до 0.010±0.002, тобто на 86.5% (Р<0.001) щодо контролю. Цей показник був меншим на 61.5% (Р<0.01) порівняно з результатом 2-ї групи, а також на 74.4% (Р<0.001) щодо значення 4- ї групи. Водночас індекс спряження cNOS на 7му добу після лапаротомії на тлі змодельовано- го SPS вірогідно не відрізнявся від результату 5- ї групи.

Відтворення SPS істотно збільшувало концентрацію пероксинітритів лужних та лужноземельних металів у гомогенаті тонкої кишки до 1.72±0.05 мкмоль/г (у інтактних тварин - 1.34±0.04 мкмоль/г) (рис. 2), тобто на 28.4% (Р<0.001). У хибнооперованих тварин значення цього показника зростало до 1.58±0.06 мкмоль/г - на 17.9% (Р<0.01) порівняно з контролем. Виконання лапаротомії супроводжувалося збільшенням вмісту пероксинітритів лужних та лужноземельних металів до 1.67±0.05 мкмоль/г, тобто на 24.6% (Р<0.001) порівняно зі значенням 1-ї групи.

На 7-му добу після виконання «хибної» операції на тлі змодельованого SPS концентрація пероксинітритів лужних та лужно-земельних металів у гомогенаті тонкої кишки зростала до 1.88±0.03 мкмоль/г, тобто на 40.3% (Р<0.001) порівняно з контролем), що перевищувало результати 2-ї та 3-ї груп на 9.3% (Р<0.02) і 19.0% (Р<0.001) відповідно.

На 7-му добу після лапаротомії на тлі змоде- льованого SPS вміст пероксинітритів лужних та лужно-земельних металів у гомогенаті тонкої кишки зростав до 2.24±0.04 мкмоль/г, тобто на 67.2% (Р<0.001) порівняно з контролем. Цей показник перевищував на 30.2% (Р<0.001) результат 2-ї групи, та на 41.8% (Р<0.001) значення 4-ї групи. Водночас концентрація пероксинітритів лужних та лужно-земельних металів на 7-му добу після лапаротомії на тлі змодельованого SPS на 19.1% (Р<0.001) була вищою за результат 5-ї групи.

Обговорення результатів дослідження

Одним із ключових результатів нашого дослідження є збільшення загальної та індуцибельної активності NOS у гомогенаті тонкої кишки після відтворення SPS. Це свідчить про активацію системи NO, яка відома своєю участю в реалізації стресової відповіді та запалення [11]. Збільшення активності iNOS може бути реакцією на стрес і вказувати на активність регуляційних механізмів у тканинах тонкої кишки за умов PTSD. Такі зміни раніше виявлялися при моделюванні SPS у тканинах інших органів [12, 13] та вважаються ознакою СЗВ, що супроводжується активацією редокс-чутливих транскрипційних факторів [14]. Нещодавно було виявлено зв'язок PTSD із про- запальною сигналізацією NF-kB і резистентністю до глюкокортикоїдів у моноцитах [15].

Цікавим фактом є також збільшення концентрації пероксинітриту, високотоксичної активної форми нітрогену, яка може виникати внаслідок взаємодії No з супероксидним аніон-радикалом. Пероксинітрит має негативний вплив на клітини через окисні реакції та ініціацію апоптозу [16]. Його підвищення в тканинах тонкої кишки може свідчити про зміни в оксидативному статусі та викликати стрес-залежне пошкодження клітин.

Незважаючи на збільшення загальної та індуцибельної NO-синтазної активності, ми виявили зменшення активності cNOS та індексу її спряження. Це вказцє на зміни у співвідношенні ізоформ NOS, що діють у тканинах тонкої кишки за умов PTSD.

Враховуючи отримані результати, можна припустити, що розвиток нітрозативного стресу в тканинах тонкої кишки може бути важливим аспектом в патогенезі PTSD та інших стрес- залежних розладів, зокрема, хірургічної травми.

Отримані результати нашого дослідження свідчать про значне збільшення тяжкості нітро- зативного стресу в тканинах тонкої кишки після хірургічної травми (лапаротомії) у щурів, що мали передумови розвитку PTSD. Ці зміни в тканинах тонкої кишки є схожими на ті, які відмічалися в інших моделях запалення та стресу, зокрема при відтворенні ліпополісахарид- індукованої СЗВ [17]. Це вказує на те, що нітро- зативний стрес може бути загальним чинником, що сприяє розвитку різних патологічних станів, включаючи PTSD та СЗВ.

Автори попередніх досліджень вже зазначали, що зміни в балансі між активацією транскрипційних чинників NF-kB і Nrf2 можуть бути важливими у розвитку нітрозативного стресу [14, 17]. Такий дисбаланс може спричинити високий рівень нітрозативного стресу, який ми зафіксували у тканинах тонкої кишки щурів після хірургічної травми на тлі PTSD.

Висновки

Експериментальне моделювання посттравматичного стресового розладу (однократного тривалого стресу) супроводжується ознаками ні- трозативного стресу в тканинах тонкої кишки щурів: підвищує NO-синтазну активність за рахунок активації індуцибельної ізоформи, зменшує активність і спряженість конститутивних N- синтаз, збільшує концентрацію пероксинітритів лужних та лужно-земельних металів.

На 7-му добу після лапаротомії на тлі відтворення посттравматичного стресового розладу показники нітрозативного стресу в тканинах тонкої кишки щурів, такі як загальна та індуци- бельна NO-синтазна активність та концентрація пероксинітритів лужних та лужно-земельних металів, вірогідно перевищують їх значення після окремого здійснення лапаротомії на тлі модельованого однократного тривалого стресу.

References

1. Hori H, Kim Y. Inflammation and post-traumatic stress disorder. Psychiatry Clin Neurosci. 2019 Apr;73(4):143-153.

2. Speer K, Upton D, Semple S, McKune A. Systemic low-grade inflammation in post-traumatic stress disorder: a systematic review. J Inflamm Res. 2018 Mar 22;11:111-121.

3. Smajic J, Tupkovic LR, Husic S, et al. Systemic Inflammatory Response Syndrome in Surgical Patients. Med Arch. 2018;72(2):116-119.

4. Dobson GP, Morris JL, Biros E, et al. Major surgery leads to a proinflammatory phenotype: Differential gene expression following a laparotomy. Ann Med Surg (Lond). 2021 Oct 21 ;71:102970.

5. Ryabushko RM, Kostenko VO. Markery destruktsiyi spoluchnoyi tkanyny tonkoyi kyshky shchuriv za umov khirurhichnoyi travmy, vidtvorenoyi na tli eksperymental'noho posttravmatychnoho stresovoho rozladu [Markers of connective tissue degradation in the small intestine of rats undergoing surgical trauma replicated under experimental post-traumatic stress disorder]. Aktual'ni problemy suchasnoyi medytsyny: Visnyk Ukrayins'koyi medychnoyi stomatolohichnoyi akademiyi. 2023;23(4):244-247. (Ukrainian).

6. Wallace JL. Nitric oxide in the gastrointestinal tract: opportunities for drug development. Br J Pharmacol. 2019 Jan;176(2):147-154.

7. Serova LI, Tillinger A, Alaluf LG, et al. Single intranasal neuropeptide Y infusion attenuates development of PTSD-like symptoms to traumatic stress in rats. Neuroscience. 2013 Apr 16;236:298-312.

8. Souza RR, Noble LJ, McIntyre CK. Using the Single Prolonged Stress Model to Examine the Pathophysiology of PTSD. Front Pharmacol. 2017 Sep 11;8:615.

9. Taran OV, Solovyova NV, Kostenko VO. Vplyv laparatomiyi ta lipopolisakharydindukovanoyi systemnoyi zapal'noyi vidpovidi na metabolichni rozlady v orhanizmi shchuriv [Effect of laparatomy and lipopolysaccharide-induced systemic inflammatory response on metabolic disorders in rats]. Fiziol Zh. 2022; б8(3):35-43. (Ukrainian).

10. Akimov OYe, Kostenko VO. Oksydatyvno-nitrozatyvnyy stres ta metody yoho doslidzhennya [Oxidative-nitrosative stress and methods of its research]. Lviv: Magnolia; 2021.152 p. (Ukrainian).

11. Ignarro LJ, Freeman B (eds). Nitric Oxide: Biology and Pathobiology. 3rd ed. Academic Press; 2017. 434 p.

12. Ryabushko RM, Kostenko VO. Utvorennya aktyvnykh form oksyhenu ta nitrohenu v tkanynakh pechinky shchuriv za umov khirurhichnoyi travmy, vidtvorenoyi na tli eksperymental'noyi modeli posttravmatychnoho stresovoho rozladu [Formation of reactive oxygen and nitrogen species in rat liver tissues under conditions of surgical trauma reproduced on the background of experimental model of post-traumatic stress disorder]. Aktual'ni problemy suchasnoyi medytsyny: Visnyk Ukrayins'koyi medychnoyi stomatolohichnoyi akademiyi. 2023;23(3):137-142. (Ukrainian).

13. Riabushko RM, Boyarska ZO, Kostenko VO. Laparotomy enhances the production of reactive nitrogen species in the heart of rats exposed to a single prolonged stress. Problemy ekolohiyi ta medytsyny. 2023;27(5-6):26-30.

14. Kostenko V, Akimov O, Gutnik O, et al. Modulation of redox- sensitive transcription factors with polyphenols as pathogenetically grounded approach in therapy of systemic inflammatory response. Heliyon. 2023 Apr 16;9(5):e15551.

15. Biltz RG, Sawicki CM, Sheridan JF, Godbout JP. The neuroimmunology of social-stress-induced sensitization. Nat Immunol. 2022 Nov;23(11):1527-1535.

16. Jomova K, Raptova R, Alomar SY, et al. Reactive oxygen species, toxicity, oxidative stress, and antioxidants: chronic diseases and aging. Arch Toxicol. 2023 Oct;97(10):2499-2574.

17. Taran OV, Solovyova NV. Vplyv modulyatoriv transkryptsiynykh chynnykiv NF-kapa B i Nrf2 na pokaznyky oksydatyvno- nitrozatyvnoho stresu v tkanynakh tonkoyi kyshky shchuriv pislya laparatomiyi na tli lipopolisakharyd-indukovanoyi systemnoyi zapal'noyi vidpovidi [Effect of transcription factor modulators on oxidative-nitrosative stress indicators in tissues of the small intestine of rats after laparatomy under lipopolysaccharide-induced systemicinflammatory response]. Aktual'ni problemy suchasnoyi medytsyny: Visnyk Ukrayins'koyi medychnoyi stomatolohichnoyi akademiyi. 2022;22(2): 76-81. (Ukrainian).

Размещено на Allbest.ru