Вплив комбінації субстанцій у вигляді гелевої композиції на показники імунітету і запалення тканин піднебінних мигдаликів у хворих на катаральний гінгівіт на тлі хронічного тонзиліту

Дослідження фармакотерапевтичної (імуномоделюючої) дії в умовах клітинних культур in vitro на сьогодні вважається доцільним і обґрунтованим для визначення дії лікарських засобів на доклінічно- му рівні. Також важливим є вирішення патогенетичності застосування таких засобів, особливо місцевої дії. В якості досліджуваного препарату був використаний багатокомпонентний гель на основі декаметоксину та гіалуроновоїкислоти для лікування хронічного катарального гінгівіту у хворих на хронічний тонзиліт. Мета роботи - визначення впливу гелевої композиції на основі декаметоксину та гіалуронової кислоти на тканину піднебінних мигдаликів у пацієнтів з хронічним тонз и- літом на тлі хронічного катарального гінгівіту.

Матеріали і методи. При досліджені впливу основних активних компонентів, які входили до складу гелевої композиції, використовували рекомендації І.П. Кайдашева та співавторів при апробації фармакологічних препаратів в культурах in vitro. Тканина піднебінних мигдаликів була отримана від 20-ти пацієнтів з хронічним тонзилітом на тлі хронічного катарального гінгівіту, у яких, за показаннями, була проведена тонзилектомія. Роботу з отриманим матеріалом виконували відповідно до рекомендацій, прийнятих у лабораторії патофізіології та імунології Інституту отоларингології ім. проф. О.С. Коломійченка НАМН України. Тканину мигдаликів заливали середовищем 199 (Serva, Німеччина) з гентаміціном сульфатом (Дарниця, Україна) у концентрації 120 мкг/мл і залишали на 0,5 години при температурі 4-8 С на 20 хвилин. Після цього видаляли геморагічні частини з цілого мигдалика, переносили його в середовище Ігла (Sigma,USA) і промивали ополіскуючи 3-4 рази. Далі, підготовлений таким чином матеріал додавали до стерильних флаконів із збагаченим середовищем Ігла (+ L-глутамін, натрій бікарбонат, 100- кратний концентрат вітамінів, ембріональна сироватка теляти - 5%, 60 мкг/мл гентаміцину). Мигдалики розрізали ножицями і промивали середовищем, вимиваючи клітини. Процедуру повторювали декілька разів (5-7), після цього фільтрували через нейлон. Усі маніпуляції проводили у ламінарній шафі в потоці стерильного повітря. Підраховували кількість клітин за допомогою світлового мікроскопа (Олімпус-23, Японія) та камери Горяєва. Готували клітинну завись із розрахунку 2,5 млн лімфоцитів на 1 мл середовища. При відсотках синіх («мертвих») клітин >10%, клітини вважали непридатними для подальшої роботи. Результати дослідження. При дії основних складників запропонованої гелевої композиції (декаметоксину та гіалуронової кислоти) на in vitro клітини піднебінних мигдаликів пацієнтів з хронічним катаральним гінгівітом на тлі рекурентного тонзиліту, не визначено суттєвих змін у концентрації а і Y-інтерферонів. Під впливом гелевої композиції знижується вміст прозапальних чинників: інтерлейкіну-1в та імунних комплексів. Розпрацьована гелева композиція стимулює продукування клітинами мигдаликів протимікробного чинника - антистрептолі- зіну-О, стимулюючи продукцію антитіл проти антигенів гемолітичного стрептококу. Висновок. Досліджувана гелева композиція на основі декаметоксину та гіалуронової кислоти є ефективним протизапальним та антимікробним засобом, що стимулює продукування клітинами мигдаликів протимікробного чинника - антистрептолізіну-О, таким чином стимулюючи продукцію антитіл проти антигенів гемолітичного стрептококу.

Ключові слова: пародонтальна гелева композиція, декаметоксин, гіалуронова кислота, гінгівіт, хронічний тонзиліт, культура клітин, інтерферони, інтерлейкіни, імунні комплекси, АСЛ-О.

Статтю підготовлено в межах теми науково-дослідної роботи кафедри терапевтичної стоматології, пародонтології та стоматології ФПДО ЛНМУ імені Данила Галицького «Порушення метаболізму та його вплив на розвиток поєднаної стоматологічної та соматичної патології», державний реєстраційний номер: 0120U002131, шифр: ІН.30.000.004.20.

Summary

гелева композиція декаметоксин гіалуронова кислота піднебінні мигдалики

IMPACT OF A GEL COMPOSITION CONTAINING VARIOUS SUBSTANCES ON INDICES OF IMMUNITY AND TISSUE INFLAMMATION IN PALATINE TONSILS OF PATIENTS WITH CATARRHAL GINGIVITIS DURING CHRONIC TONSILLITIS Bezhuk Yu.A., Martovlos (Hodovana) O.I.

Key words: periodontal tissues, gel composition, dekamethoxine, hyaluronic acid, gingivitis, chronic tonsillitis, cell culture, interferons, interleukins, immune complexes, ASL-O.

The study of pharmacotherapeutic (immunomodulating) action in conditions of in vitro cell cultures is currently considered appropriate and justified for determining the action of drugs at the preclinical level. It is also important to address the pathogenetic nature in using such agents, especially fro local application. This study investigated the efficacy of a multicomponent gel containing decamethoxine and hyaluronic acid in treating chronic catarrhal gingivitis among patients with chronic tonsillitis. The purpose of the work is to assess the efficacy of a gel containing decamethoxine and hyaluronic acid on the tissue of the palatine tonsils in the therapy of chronic catarrhal gingivitis in patients with chronic tonsillitis.

Materials and methods. To investigate the effects of the main active components in the gel, we followed the recommendations of I.P. Kaidashev et al. for testing pharmacological preparations in in vitro cultures. Tissue samples from the palatine tonsils were obtained from 20 patients with chronic tonsillitis and chronic catarrhal gingivitis undergoing tonsillectomy. All procedures adhered to the guidelines set by the Laboratory of Pathophysiology and Immunology at Prof. O.S. Kolomiichenko Institute of Otolaryngology, National Academy of Sciences of Ukraine. Palatine tonsil tissue was incubated in 199 medium (Serva, Germany) containing gentamicin sulfate (Darnytsa, Ukraine) at a concentration of 120 ^g/ml for 20 minutes at 4-8°C. After that, the hemorrhagic parts were removed from the whole tonsil and placed into Eagle's medium (Sigma, USA) and rinsed three to four times. Subsequently, the prepared tissue was placed in sterile vials containing enriched Eagle's medium supplemented with L-glutamine, sodium bicarbonate, 100x vitamin concentrate, 5% fetal calf serum, and 60 ^g/mL gentamicin. Tonsil tissue was dissected using scissors and then washed repeatedly (5-7 times) with fresh medium to remove loosely attached cells, then, the resulting cell suspension was filtered. All procedures were conducted within a sterile laminar flow cabinet. Cell viability was assessed using light microscopy (Olympus-23, Japan) and a hemocytometer. A final cell suspension containing 2.5 million lymphocytes per milliliter of medium was prepared. Suspensions with a viability of less than 90% (blue, "dead" cells) were excluded from further experiments.

Results. Treatment of in vitro palatine tonsil cells from patients with chronic catarrhal gingivitis and recurrent tonsillitis with the main components of the developed gel (decamethoxine and hyaluronic acid) did not induce significant changes in the concentration of a and Y-interferons. Our findings suggest that the gel composition reduces the levels of pro-inflammatory factors: interleukin-1 p and immune complexes. Additionally, it appears to stimulate the production of the antimicrobial factor antistreptolysin-O by tonsil cells, potentially leading to increased antibody production against hemolytic streptococcus antigens.

Conclusion. Based on the in vitro findings, the investigated gel composition containing decamethoxine and hyaluronic acid demonstrates potential anti-inflammatory and antimicrobial properties that stimulate the production of the antimicrobial factor antistreptolysin-O by tonsil cells, which might lead to increased antibody production against hemolytic streptococcus antigens.

Вступ

Локальна доставка лікарських засобів (ЛЗ) набуває усе ширшого застосунку за рахунок тривалої медикаментозної дії та більшої концентрації активних компонентів препарату в ділянці ушкодження. Це, у свою чергу, знижує дію можливих побічних ефектів у порівнянні із системним уведенням ЛЗ. Фармацевтична активність ЛЗ при локальній доставці забезпечується значною капілярною сіткою слизової оболонки порожнини рота, оминаючи таким чином шлунково- кишковий тракт, що зумовлює високу біодоступ- ність [1,2]. Стратегія лікування катарального гінгівіту має включати не лише проведення професійної гігієни порожнини рота та зняття над'ясенних зубних відкладень, а також місцеве застосування засобів з антимікробною дією для уникнення подальшого розвитку пародонтиту. Концепція даного лікування може бути використана як у стоматологічній, так і в оторинолярин- гологічній практиці, маючи вплив на піднебінні мигдалики при тонзилогенній патології [3, 4, 5].

ЛЗ, що призначений для місцевого застосування при хронічному катаральному гінгівіті, перебіг якого відбувається на тлі рекурентного тонзиліту має відповідати наступним вимогам: чинити протимікробну активність щодо пародон- топатогенних мікроорганізмів, а також при стрептококовій та стафілококовій інфекції, що потенціює виникнення захворювання піднебінних мигдаликів; мати протизапальну дію; виявляти регенеруючі властивості прискорюючи місцеву репарацію тканин; мати мукоадгезивні властивості, забезпечуючи максимальне зчеплення гелю зі слизовою оболонкою ясен та піднебінних мигдаликів і забезпечувати пролонгований ефект; утворювати захисний бар'єр, тим самим зменшуючи проникність капілярів; не мати побічних ефектів [6, 7]. Разом з тим, комплексна дія ЛЗ забезпечується комбінуванням декількох діючих речовин.

Щоб забезпечити вище описані вимоги, у розпрацюванні нового ЛЗ для місцевого лікування хронічного катарального гінгівіту на тлі рекурентного тонзиліту, нами було обрано два активні фармацевтичні компоненти - декаметоксин та гіалуронова кислота. У виборі лікарської форми надали перевагу гідрогелю, враховуючи гідрофільний характер слизової оболонки порожнини рота.

Таким чином, мета даного дослідження полягала у визначенні впливу гелевої композиції на основі декаметоксину та гіалуронової кислоти на тканину піднебінних мигдаликів у пацієнтів з хронічним тонзилітом на тлі хронічного катарального гінгівіту.

Матеріали і методи

При досліджені впливу основних активних компонентів, які входили до складу гелевої композиції, використовували рекомендації І.П. Кай- дашева та співавторів при апробації фармакологічних препаратів в культурах in vitro [8]. Тканина піднебінних мигдаликів була отримана від 20-ти пацієнтів з хронічним тонзилітом на тлі хронічного катарального гінгівіту, у яких, за показаннями, була проведена тонзилектомія.

Роботу з отриманим матеріалом виконували відповідно до рекомендацій, прийнятих у лабораторії патофізіології та імунології Інституту отоларингології ім. проф. О.С. Коломійченка НАМН України. Тканину мигдаликів заливали середовищем 199 (Serva, Німеччина) з гентаміціном сульфатом (Дарниця, Україна) у концентрації 120 мкг/мл і залишали на 0,5 години при температурі 4-8⁰ С на 20 хвилин. Після цього видаляли геморагічні частини з цілого мигдалика, переносили його в середовище Ігла (Sigma,USA) і промивали ополіскуючи 3-4 рази. Далі, підготовлений таким чином матеріал додавали до стерильних флаконів із збагаченим середовищем Ігла (+ L-глутамін, натрій бікарбонат, 100-кратний концентрат вітамінів, ембріональна сироватка теляти - 5%, 60 мкг/мл гентаміцину). Мигдалики розрізали ножицями і промивали середовищем, вимиваючи клітини. Процедуру повторювали декілька разів (5-7), після цього фільтрували через нейлон. Усі маніпуляції проводили у ламінарній шафі в потоці стерильного повітря. Підраховували кількість клітин за допомогою світлового мікроскопу (Олімпус-23, Японія) та камери Горя- єва. Готували клітинну завись із розрахунку 2,5 млн лімфоцитів на 1 мл середовища. При відсотках синіх («мертвих») клітин >10%, клітини вважали непридатними для подальшої роботи.

Для визначення впливу гелю на продукцію інтерферонів застосовували набори для визначення а- і Y-інтерферонів у культуральній рідині фірми Elabscience (США) та аналізатор Stat Fax 2100 (США). Для визначення впливу гелю на вміст імунних комплексів (ІК) користувались методом осадження білків та поліпептидів поліети- ленгліколем з наступним вимірювання оптичної щільності, дотримуючись рекомендацій Ю.А. Гриневича та А.Н. Алфьорова [9]. Вміст АСЛ-О визначали із застосуванням за допомогою латекс-теста (Гранум, Україна). Контролем слугував медичний гліцерин у тій самій концентрації, що і базовий препарат гелю.

Дозвіл біоетики. Дослідження затверджені протоколом №9 комісії з питань етики наукових досліджень, експериментальних розробок і наукових творів Львівського національного медичного університету імені Данила Галицького від 21.12.2020.

Методи статистичного аналізу. Статистичну обробку виконували за допомогою пакетів прикладних програм для медичної статистики WIN Pepi. [10] Дані параметричних показників подавали як медіану (Me), мінімум - максимум, нижній - верхній квартилі. Порівняння окремих груп проводили за допомогою параметричного критерію різниці (тесту Ст'юдента та однобічного критерію «U» Вілкоксона) [11].

Результати та обговорення

Дані, що репрезентовані на рис 1, отримані у результаті визначення оптимальної концентрації запропонованої гелевої композиції на основі ДКМ® і ГК для in vitro досліджень. До клітинної наважки мигдаликів додавали гель у концентраціях 25, 50 і 100 мкг на пробу, культивували 18 годин в умовах термостату (37⁰С), центрифугували при 110g 10 хв, збирали надосадкову рідину, розливали у пробірки типу Еппендорф по 0,5 мл та зберігали при мінус 20⁰С впродовж 3-х місяців. У результаті оптимальну концентрацію гелю визначали за впливом на продукування ан- тистрептолізину-О (АСЛ-О), яку визначали в реакції нейтралізації. У подальших дослідженнях дотримувались концентрації 50 мкг на пробу.

Результати дослідження вмісту антистрепто- лізіну-О (АСЛ-О) в супернатантах після культивування гелю з клітинами мигдаликів наведено у таблиці 5.

Встановлено, що додавання розпрацьовано- го гелю до клітин піднебінних мигдаликів супроводжувалося підсиленням продукції ними антитіл проти гемолітичного стрептококу майже у три рази (3,5±0,8 проти 1,2±0,2 у контролі).

Рис. 1. Вміст АСЛ-О у культуральніи рідині після контакту клітин® мигдаликів із різними концентраціями гелевоїкомпозиції на основі ДКМ® і ГК.

Таблицяі. міст а-інтерферону в культуральніи рідині до та після дії гелю.