Вплив різних концентрацій наночастинок ортованадату гадолінію ітрію на клітинну лінію раку молочної залози МСЕ-7

Размещено на http://www.allbest.ru/

Вплив різних концентрацій наночастинок ортованадату гадолінію ітрію на клітинну лінію раку молочної залози МСЕ-7

О. А. Наконечна¹, В. Ю. ПРОКОПЮК1 ², О. С. СИДОРЕНКО²,

В. С. ГОЙДІНА², Д. О. ЯНКОВСЬКА

Харківський національний медичний університет, Харків, Україна Институт проблем кріобіології та кріомедицини Національної академії наук України, Харків, Україна

Резюме

У статті проаналізовано вплив різних концентрацій розчину наночастинок GdYVO₄:Eu³⁺, які були попередньо активовані ультрафіолетом та неактивованих, на метаболічну активність ракової клітинної культури MCF-7. Встановлено, що ступінь змін стану клітин раку молочної залози залежав від концентрації наночастинок, а саме токсичний ефект спостерігався за умов впливу високих концентрацій.

Ключові слова: наночастинки GdYVO₄:Eu³⁺, клітинна ракова лінія MCF-7, УФ-активація. метаболічна активність ракова клітина

The effect of different concentrations of yttrium gadolinium orthovanadate nanoparticles on breast cancer cell line MCF-7

O. A. NAKONECHNA1, V. Y. PROKOPYUK1 ², О. S. SYDORENKO², V. S. HOIDINA², D. O. YANKOVSKA1

Kharkiv National Medical University, Kharkiv, Ukraine

²Institute of Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the National Academy of Sciences of Ukraine, Kharkiv, Ukraine

Abstract. The article analyzes the effect of different concentrations of GdYVO₄:Eu³⁺ nanoparticles solution, which were pre-activated by ultraviolet light and not activated, on metabolic activity of the MCF-7 cancer cell culture. It was found that the degree of changes in the state of breast cancer cells depended on the concentration of nanoparticles, namely, the toxic effect was observed under conditions of exposure to high concentrations.

Key words: GdYVO₄:Eu³⁺ nanoparticles, MCF-7 cancer cell line, UV activation.

Завдяки сучасному розвитку нанотехнологій можливе створення нано- частинок з унікальними оптичними, магнітними та біологічними властивостями. Останнім часом у науковій літературі з'явилось багато інформації щодо застосування ортованадату гадолінію ітрію, активованого європієм (GdYVO₄:Eu³⁺), у медичній практиці, зокрема в онкотерапії [1]. Найчастіше хіміотерапію поєднують з променевою терапією. За умов використання цитостатиків у пацієнтів з онкозахворюваннями виникають побічні явища. У попередніх дослідженнях ми показали, що УФ-опромінення наночасти- нок (НЧ) виявляє прооксидантні властивості, що може підсилити ефект радіотерапії [2].

Останні сучасні дослідження виявили деякі токсичні ефекти НЧ у високих концентраціях, але механізм цього прояву незрозумілий. Тому основним лімітуючим фактором щодо використання наноматеріалів у сучасній лікувальній практиці є їхня токсичність [3].

У наукових дослідженнях для вивчення токсичності НЧ на організм використовували експериментальну модель на мишах лінії BALB/c, де показана здатність нанокомплексів, які складаються з НЧ ортованадатів рідкісноземельних металів, зокрема GdYVO₄:Eu³⁺, пригнічувати ріст асцит- ної карциноми Ерліха [4]. Однак, біобезпека нанокомплексів залишається нез'ясованою, тому автори провели визначення їхньої гострої та субхро- нічної токсичності на мишах лінії BALB/c. Висновком такої роботи було те, що запропоновані нанокомплекси з НЧ GdYVO₄:Eu³⁺ можна віднести до малотоксичних речовин і використовувати в умовно-терапевтичних дозах в онкологічній практиці для розробки наноструктурованих лікарських препаратів [5].

Інші наукові дослідження було проведено на клітинних лініях завдяки тестуванню на токсичність GdYVO₄:Eu³⁺, що оцінювали за допомогою методу CCK-8 [6]. Також паралельно було проведено дослідження на мишах BALB/c через 0, 3, 7 та 14 днів після внутрішньовенного введення суспензії GdYVO₄:Eu³⁺ у різних концентраціях - від 0 до 10 рМ. Загалом експерименти з фотостабільності показали, що НЧ можуть створювати люмінесцентні зображення або забезпечувати моніторинг клітин in vivo в довгостроковій перспективі. Автори довели, що НЧ можуть збуджуватися в ближньому УФ-опроміненні. Крім того, НЧ мають гарну біосумісність і низьку цито- токсичність, що вказує на їх потенціал для біомедичних застосувань [6].

Щоб знизити токсичний ефект хіміотерапії, виникає питання щодо застосування НЧ, що активовані УФ як прооксиданти в місцевій терапії раку. У попередніх наших дослідженнях було доведено підвищення рівня АФК в еритроцитах і лейкоцитах та виникнення клітинного апоптозу, ерипто- зу, що сприяє перспективності використання GdYVO4:Eu³⁺ в комплексній терапії онкологічних захворювань [7]. Обробка УФ-світлом надає НЧ про- оксидантних властивостей, що підтверджується індукованим GdYVO₄:Eu³⁺ надлишковим утворенням АФК у лейкоцитах. Високі концентрації як активованих, так і неактивованих УФ-світлом НЧ, що вивчалися, змінювали окисно-відновний стан лейкоцитів. УФ-опромінення надає прооксидантних властивостей GdYVO₄:Eu³⁺, що робить їх перспективними радіосенсибілізу- ючими агентами в променевій терапії раку.

Науковці, приділяючи багато уваги та часу вивченню токсичності НЧ, досліджують дію різних речовин на різноманітних культурах клітин, зокрема на ракових лініях MCF-7 (клітини раку молочної залози людини) [8].

Метою дослідження було вивчення впливу різних концентрацій розчину НЧ GdYVO₄:Eu³⁺, які були попередньо активовані ультрафіолетом та неак- тивованих, на метаболічну активність ракової клітинної культури MCF-7.

Матеріали і методи

НЧ GdYVO₄:Eu³⁺ надав Інститут сцинтиляційних матеріалів НАН України (зав. від. наноструктурних матеріалів імені Ю. В. Малюкіна - член. кор. НАН України проф. С. Л. Ефімова).

Для дослідження цитотоксичних властивостей різних концентрацій розчину НЧ GdYVO₄:Eu³⁺ використовували клітинну лінію раку молочної залози MCF-7, надану з колекції кріобанку Інституту проблем кріобіології і кріомедицини НАН України. Після розморожування клітини культивували протягом 3-х діб у культуральних флаконах (SPL, Корея). Культуральне середовище DMEM містило антибіотики (бензилпеніциліну -- 200 Од/мл, стрептоміцину -- 0,4 мг/мл), 5 мкг/мл амфотерицину В та 10 % фетальної телячої сироватки. Культивування проводили в умовах СО₂ інкубатора (Thermo Fisher Scientific, США) при 37°С, 5 % СО₂ до стадії майже стовідсоткової конфлюентності, після чого клітини пересівали.

В експерименті використовували як активовані УФ, так і неактивовані GdYVO₄:Eu³⁺. За допомогою уФ-лампи «Кварц-125» (X = 200 + 400 нм) НЧ опромінювали ультрафіолетом протягом 20 хв у кварцевих кюветах на відстані 20-25 см. УФ-активовані НЧ додавали до середовища вже після процедури опромінення. НЧ додавали до клітин у концентраціях 10, 20, 40, 80 та 160 мкг/мл, дослідження проводили на 24 та 72 години.

Дослідження проводили наступного дня після пересіву, після адгезії та формування моношару, було використано 96-лунковий планшет (SPL, Корея), в який було додано по 10 тис. клітин у кожну лунку. Додавали НЧ у концентраціях 10, 20, 40, 80 та 160 мкг/мл на 1 добу експерименту. Культивували протягом 24 годин у СО₂-інкубаторі (ThermoFisherScientific, США) за 37°С в атмосфері з 5 % CO₂, як контроль використовували клітини без речовини і клітини, вбиті 70 % етанолом. Опісля середовище відбирали, додавали 0,1 мл середовища культивування з 15 мкл МТТ у концентрації 5 мг/мл, інкубували 3 години в СО₂-інкубаторі (ThermoFisherScientific, США) за 37°С в атмосфері з 5 % CO2. Після чого середовище відбирали, додавали по 0,1 мл DMSO з SDS, інкубували 1 годину за 37°С. Адсорбцію вимірювали на планшетному спектрофотометрі «SM600» («Utrao», Китай), за довжини хвилі 570 нм.

Використання МТТ тесту дає змогу оцінити метаболічні параметри культивованих клітин, активність їх мітохондріальних дегідрогеназ, а також визначити цитотоксичність впливу досліджуваних НЧ [9]. В основу методу покладено здатність мітохондріальних ферментів живої клітини перетворювати 3-[4,5-диметилтіазол-2-іл]-2,5-дифенілтетразоліум бромід (МТТ) -- сіль жовтого кольору в кристалічний МТТ-формазан лілового кольору [10]. Переведення формазану в розчин за допомогою диметилсульфоксиду і подальша фотометрія на планшетному спектрофотометрі «SM600» («Utrao», Китай) дозволили точно зіставити зміну оптичної щільності розчину з дією різних концентрацій активованих УФ та неактивованих n4GdYVO₄:Eu³⁺ стосовно контролю зі зміною кількості життєздатних клітин, з метою оцінити цитотоксичність НЧ на ракову лінію клітин MCF-7.

Статистичну обробку отриманих даних проводили за допомогою програми Graph Pad Prism (Graph Pad, США). Показники порівнювали за допомогою непараметричного U-критерію Манна-Уітні. Результати за концентраціями представляли у вигляді медіанного (Ме) діапазону. Відмінності при р < 0,05 вважалися статистично значущими.

Результати та обговорення

Результати досліджень дають змогу оцінити вплив активованих УФ та неактивованих НЧ GdYVO'Eu³ на метаболічну активність мітохондрій ракової клітинної культури MCF-7.

Таблиця 1

Результати МТТ тесту клітинної ракової культури MCF-7 на першу та третю добу експерименту за умов різних концентрацій активованих УФ та неактивованих НЧ GdYVO₄:Eu³⁺, Ме (25,75)

Р₁ -- вірогідність статистичної різниці між контролем та досліджуваними концентраціями GdYVO4:Eu³⁺; Р2 - вірогідність статистичної різниці між однаковими концентраціями активованих УФ та неактиво- ваних НЧ GdYVO₄:Eu³⁺.

Під час аналізу цитотоксичності НЧ при використанні МТТ-тесту було виявлено, що мітохондрії ракових клітин втрачають свою ферментативну активність уже на першу добу при додаванні концентрацій від 10 до 160 мкг/ мл як активованих УФ так і неактивованих НЧ GdYVO₄:Eu³⁺. Найбільш значущі відмінності в оптичній щільності спостерігаються при додаванні НЧ у концентрації 40 мкг/мл та вище. Так, при додаванні вищезазначених НЧ у концентрації 40 мкг/мл оптична щільність зменшувалась на 26,9 %, а при концентрації 160 мкг/мл -- на 62 % порівняно з контролем. Аналізуючи вплив однакових концентрацій активованих УФ та неактивованих НЧ між собою, на першу добу експерименту не виявляли статистичної різниці в оптичній щільності розчину культури клітин.

Отримані результати експериментального дослідження на першу добу вказують на те, що при додаванні різних концентрацій НЧ спостерігається статистично значимий вплив на активність мітохондріальних дегідрогенез у клітинах ракової лінії MCF-7 стосовно контрольної проби. Можна зазначити, що при попередній УФ-активації дія розчинів НЧ GdYVO₄:Eu³⁺ у дозі 160 мкг/мл приводить до більш значимого зниження метаболічної активності мітохондрій у клітинах ракової лінії MCF-7 порівняно з контролем, тоді як неактивовані НЧ GdYVO₄:Eu³⁺ при додаванні у такій самій концентрації мають більшу мітохондріальну активність.

При аналізі отриманих результатів на третю добу експерименту спостерігалося зниження оптичної щільності клітинної ракової культури MCF-7 при додаванні концентрацій НЧ від 10 до 160 мкг/мл. Особливо значущі зміни в оптичній щільності відбувалися при додаванні НЧ у концентраціях від 40 до 160 мкг/мл. При додаванні 40 мкг/мл спостерігалося зниження оптичної щільності на 85,6 %, а при додаванні концентрації у 160 мкг/мл -- зменшення метаболічної ферментативної активності на 90 %. Простежується статистично значуща різниця оптичної щільності між активованими УФ та неактивованими НЧ при додаванні в усіх зазначених концентраціях.

Порівнюючи результати одного дозування активованих УФ та неактиво- ваних НЧ GdYVO₄:Eu³⁺, було виявлено, що найбільш пригнічуючий ефект мають активовані УФ НЧ GdYVO₄:Eu³⁺ (табл. 1). Спостерігається пряма кореляція в зміні активності мітохондріальних дегідрогеназ при дії активованих УФ та неактивованих НЧ GdYVO₄:Eu³ у межах одного дозування. Тобто, активовані УФ НЧ мають більш виражений токсичний ефект на клітини ракової лінії MCF-7.

Висновки

Наночастинки ортованадату гадолінію ітрію, як активовані, так і не активовані УФ-світлом, впливають на життєздатність клітин культури раку молочної залози MCF-7 та основні параметри мітохондріальної активності.

Ступінь змін стану клітин раку молочної залози залежав від концентрації наночастинок. На третю добу експерименту спостерігався більш значний вплив на активність мітохондріальних дегідрогеназ клітинної культури MCF-7.

ПОСИЛАННЯ

1. Чистякова Е.Є., Смолєнко Н.П., Бєлкіна І.О., Коренева Є.М., Карпенко Н.О. Вплив наночастинок гадоліній ортованадату у різних дозах на репродуктивну функцію самців щурів // Вісник проблем біології і медицини. 2017. Вип. 3, Т. 2 (138). С. 127--129.

2. Onishchenko A., Myasoedov V., Yefimova S., Nakonechna О., Prokopyuk V., Butov D., et all. UV Light-Activated GdYVO4:Eu³⁺ Nanoparticles Induce Reactive Oxygen Species Generationin Leukocytes Without Afecting Erythrocytes In Vitro. Biological Trace Element Research, 13 Aug 2021, 200(6): 2777-2792. https://doi.org/10.1007/s12011-021-02867-z.

3. Maksimchuk P.O, Hubenko K.O, Seminko V.V, Karbivskii V.L, Tkachenko A.S, et all. High antioxidant activity of gadolinium--yttrium orthovanadate nanoparticles in cell-free and biological milieu. Nanotechnology. 2021 Nov 8;33(5). doi: 10.1088/1361-6528/ac31e5.

4. Goltsev A., Babenko N., Gaevska Y., Bondarovych M., Dubrava T., Ostankova L., et all. Toxicity of Nanocomplexes Containing Gadolinium Orthovanadate Nanoparticles and Cholesterol. Biol Trace Elem Res. 2022 Oct; 200(10):4339-4354; doi: 10.1007/s12011-021-03019-z. Epub 2022 Jan 13. PMID: 35023046.

5. Kavok N.S, Averchenko K.A, Klochkov V.K, Yefimova S.L, Malyukin Y.V. Mitochondrial potential (AWm) changes in single rat hepatocytes: the effect of orthovanadate nanoparticles doped with rare-earth elements. Eur Phys J E Soft Matter, 2014; 37(12):127; https://doi.org/10.1140/ epje/i2014-14127-9.

6. Zhu G., Chen L., Zeng F., et al. GdVO4:Eu³⁺, Bi³⁺ Nanoparticles as a Contrast Agent for MRI and Luminescence Bioimaging. ACS Omega. 2019; 4(14):15806-15814. Published 2019 Sep 20. doi:10.1021/acsomega.9b00444.

7. Onishchenko A., Myasoedov V., Yefimova S., et all. UV Light-Activated GdYVO4:Eu³⁺ Nanoparticles Induce Reactive Oxygen Species Generation in Leukocytes Without Affecting Erythrocytes In Vitro. Biol Trace Elem Res 200, 2777-2792 (2022); https://doi.org/10.1007/ s12011-021-02867-z.

8. Chen G., Liu W., Yan B. Breast Cancer MCF-7 Cell Spheroid Culture for Drug Discovery and Development. J Cancer Ther. 2022 Mar;13(3):117-130. doi: 10.4236/jct.2022.133009. Epub 2022 Mar 9. PMID: 36311820; PMCID: PMC9611733.

9. Kumar P., Nagarajan A., Uchil P.D. Analysis of Cell Viability by the MTT Assay. Cold Spring Harb Protoc. 2018 Jun 1; 2018(6); doi: 10.1101/pdb.prot095505; PMID: 29858338.

10. Методичні рекомендації до спец практикуму «Культура клітин та клонування» (частина II) / упорядник: доктор біологічних наук Л. В. Гарманчук. Київ, 2013. 40 с.

Размещено на Allbest.ru