Врахування генетичного чинника задля підвищення ефективності лікування хворих на бронхіальну астму

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Врахування генетичного чинника задля підвищення ефективності лікування хворих на бронхіальну астму

Вступ

Згідно з епідеміологічними даними, бронхіальна астма (БА) є одним із розповсюджених алергічних захворювань, погіршує якість життя хворих та представляє значну соціально-економічну проблему сучасної медицини. Базисний на даний момент підхід до лікування, викладений в основному звіті GINA перегляду 2019 року, матеріалах до нього, а також у багатьох наукових статтях, передбачає використання ГКС, що характеризується беззаперечним протизапальним ефектом інгаляційних та системних ГКС. Проте, не дивлячись на широке застосування цих препаратів в клінічній практиці зберігається значна частина хворих з неповним контролем БА та навіть його відсутністю. Водночас, численні дослідження різних авторів вказують на нуклеотидний поліморфізм гена LTC4S як сильного фактору ризику розвитку бронхіальної астми та непереносимості аспірину, що обумовлює тяжкість перебігу хвороби та впливає на відповідь лікування антагоністами лейкотрієнових рецепторів.

Отже, ідея врахування генетичного чинника задля підвищення ефективності лікування хворих на БА була покладена в основу нашого дослідження.

Виклад основного матеріалу

Результати проведеного аналізу літератури вказують, що поліморфізм гену LTC4S асоційований з непереносимістю аспірину у хворих на БА, яка проявляється респіраторними реакціями на аспірин та інші інгібітори циклооксигенази. Особливу увагу привертає нуклеотидний поліморфізм, розміром 444 пар нуклеотидів, розташований вище від гену, що кодує лейкотрієн-С4-синтетазу (LTC4S-444C, rs730012), як сильний фактор ризику розвитку БА та непереносимості аспірину (Berqhea H. et al., 2015). Варіант С алелі гена LTC4S пов'язаний зі збільшенням цистеінілових лейкотрієнів, зниження ОФВ і, що обумовлює тяжкість перебігу БА та впливає на відповідь лікування антагоністами лейкотрієнових рецепторів (Silverman et al., 1998).

Узагальнення результатів проведеного літературного огляду представимо у табл. 1:

Таблиця 1

Узагальнення літературних даних про частоту генотипів гена LTC4S

У 1979 р. Bengt I. Samuelsson та ін. [3, 4] відкрили нову групу метаболітів арахідонової кислоти, яка утворюється ліпооксигеназним шляхом з лейоцитів. Ці компоненти стали називати лейкотрієнами (ЛТ). ЛТ є важливими ліпідними медіаторами, які залучені у патогенезі БА.

Рис. 1 Схема утворення арахідонової кислоти та лейкотрієнів (згідно з [3, 4])

Порушення співвідношення та активності ЛТ може привести до розвитку патологічних ефектів в організмі, а саме розвитку БА, алергічного риніту, назальних поліпів. Багато факторів, в тому числі віруси, бактерії можуть привести до зниження циклоксігененази та підвищення рівня ЛТ. У хворих на БА, особливо в період загострення, кількість ЛТ в брохоальвеолярній рідині, назальному секреті, сиворотці крові значно підвищується, збільшується їх виділення з сечею.

Наразі виявлено більше за 150 генів-кандидатів у хворих на БА, але з позицій практичної медицини найбільше значення має поліморфізм генів, який з одного боку є діагностичним маркером схильності до певної хвороби та її прогресування, а з іншого - фенотипічна експресія якого доступна фармакологічній корекції. Несприятливий генетичний фон реалізується при взаємозв'язку з факторами середовища та проявляється у формуванні патологічного фенотипу.

Зважаючи на суперечливі дані щодо частоти генотипів та ризику розвитку БА в різних популяціях залежно від -444A/C поліморфізму гена лейкотрієн С4 синтетази, дана проблема залишається актуальною і становить інтерес для подальших наукових досліджень. Доведена асоціація -444A/C поліморфізму гена лейкотрієн С4 синтетази з різними клінічними фенотипами БА, і узагальнені результати літературного огляду з цієї проблеми представлені у табл.2:

Таблиця 2

Узагальнення результатів проведеного літературного огляду з питань впливу ЛТ на розвиток БА та з лікування АЛТП

У відповідності з сучасними погоджувальними документами з діагностики та терапії БА (Global Initiative for Asthma/GINA 2016 р.) ГКС є основними базисними протизапальним препаратами у лікуванні даної патології. Проте, не дивлячись на широке застосування цих препаратів в клінічній практиці зберігається значна частина хворих з неповним контролем БА та навіть його відсутністю.

А оскільки нуклеотидний поліморфізм гена LTC4S (як сильного фактору ризику розвитку бронхіальної астми та непереносимості аспірину) обумовлює тяжкість перебігу хвороби та впливає на відповідь лікування антагоністами лейкотрієнових рецепторів, то у сучасній літературі широко обговорюється питання про можливість застосування медикаментів нової фармакологічної групи - антилекотрієнових препаратів. Зокрема монтелукаст, рекомендований як альтернативна терапія ІГКС при лікуванні легкої персистуючої БА, а також у складі комбінованої протизапальної терапії з ІГКС при лікуванні БА середнього ступеня тяжкості, до того ж - при аспірин- індукованій БА, БА у пацієнтів з ожирінням, БА фізичного зусилля, БА у курців, БА, асоційована з алергічним ринітом.

Отже, використання в практиці лікування БА антилейкотрієнової терапії має базуватися на проведенні генетичного аналізу. І логіка наших пропозицій полягає у наступному (рис.2).

Рис 2. Схема логіки пропозицій автора щодо використання антилейкотрієнової терапії

генетичний лікування бронхіальна астма

Для втілення зазначеної схеми було проведено генетичне дослідження. У ньому брали участь 181 хворих на БА (основна група), які проходили обстеження і лікування в КЗ СОР «Сумська обласна клінічна лікарня» у період 2013 - 2014 рр. Дослідження було схвалено Комісією з питань біоетики медичного інституту Сумського державного університету.

У дослідження включали пацієнтів за умови підписання інформованої згоди з метою та обсягом запланованих обстежень, необхідністю корекції лікування та можливим ризиком виникнення її побічних ефектів.

Критерії включення пацієнтів у дослідження: вік 18 рік і старші; наявність діагнозу персистуючої БА; наявність згоди на участь у дослідженні.

Критерії виключення: наявність у пацієнта тяжких супутніх захворювань: туберкульозу легень, онкопатології, алкогольної та/або наркотичної залежності, СНІДу, а також - декомпенсованої серцевої, печінкової, ниркової та ін. недостатності; період вагітності чи лактації; постійне приймання системних кортикостероїдів; відмова пацієнта від участі у дослідженні; психічні розлади та захворювання нервової системи; системні захворювання сполучної тканини; гострі інфекційні захворювання, загострення хронічних інфекційних хвороб; гострі порушення мозкового кровообігу в анамнезі.

Діагностику та лікування здійснювали на основі рекомендацій GINA (2013) та згідно з Наказами МОЗ України № 128 від 19.03.2007 року та № 868 від 08.10.2013 року на підставі анамнезу, клінічних симптомів, результатів лабораторного та інструментального дослідження (комп'ютерну спірографію, електрокардіографію, рентгенографію органів грудної клітки).

Групу контролю склали 81 практично здорових осіб, які проходили профілактичне обстеження на базі Комунального закладу «Сумська міська клінічна поліклініка № 3». Обстежена група контролю відповідала наступним критеріям: відсутність в анамнезі симптомів БА або іншого легеневого захворювання, симптомів алергії та атопії, гіперчутливості до аспірину, відсутність у близьких родичів БА та атопічних захворювань.

Основну групу (181 пацієнт із БА) та контрольну групу (81 особу) за результатами генетичного дослідження було поділено на три групи в залежності від типу поліморфізму гену LTC4-S - генотипи АА, АС та СС. Визначення алельного поліморфізму гена LTC4 -S - 444C (rs 730012) проводили методом полімеразної ланцюгової реакції з подальшим аналізом довжини рестрикційних фрагментів за Gan -nan Wang et al. із модифікаціями [16].

Венозну кров у хворих БА та практично здорових осіб набирали в стерильних умовах у моновети об'ємом 2,7 мл із калієвою сіллю етилендіамінтетраоцтової кислоти (11,7 мМ) як антикоагулянта (“Sarstedt”, Німеччина), заморожували та зберігали при температурі - 20 °С.

ДНК виділяли з нерозведеної крові з використанням наборів DIAtom DNA Prep 100 («Isogene», Росія). Використаний метод базується на використанні лізувального реагенту із гуанідинізоціонатом, призначеним для лізису клітин, солюбілізації клітинного дебрісу, а також денатурації клітинних нуклеаз. З наявністю лізувального реагенту ДНК активно сорбується на NucleoS™-сорбенті, потім легко відмивається від білків та солей спиртовим розчином. Згодом ДНК екстрагують із сорбенту та переносять у стерильні вільні від ДНК та РНК мікропробірки. Отримана ДНК може безпосередньо використовуватися для проведення полімеразної ланцюгової реакції. Набір дозволяє виділяти із свіжого біологічного матеріалу високомолекулярну ДНК (4050 тисяч пар нуклеотидів високої чистоти (OD260/280 нм ^{1,6 2}, 0). Вихід чистої ДНК з 100 мкл нерозведеної крові становить 3-5 мкг. У процесі виділення ДНК ми додержувалися рекомендацій, наведених у комерційному наборі, та проводили маніпуляції згідно з таким протоколом, що зафіксований у патенті [ 20], де автор даного дослідження є одним із заявників:

1. У пробірку об'ємом 1,5 мл внести 100 мкл нерозведеної венозної крові та додати 400 мкл лізувального розчину. Перемішати вміст пробірок обертанням 10 разів.

2. Термостатування суміші 5 хв - за температури 65 °С.

3. Центрифугування пробірок упродовж 10 с при 5 000 об/хв та додавання ретельно збовтаної на вортексі 20 мкл суспензії сорбенту NucleoS™.

4. Перемішування проб - упродовж 10 хвилин.

5. Центрифугування пробірок упродовж 10 с при 5 000 об/хв та видалення супернатанту за допомогою помпи, не торкаючись осаду сорбенту.

6. Додавання 200 мкл лізувального розчину, ретельне перемішування на вортексі до гомогенного стану.

7. Додавання 1 мл сольового розчину та перемішування пробірок 10 разів.

8. Центрифугування пробірок упродовж 10 с при 5 000 об/хв та видалення супернатанту за допомогою помпи, не торкаючись осаду сорбенту із ДНК.

9. Додавання 1 мл сольового розчину та перемішування пробірок на вортексі до гомогенного стану.

10. Центрифугування пробірок упродовж 10 с при 5 000 об/хв та видалення супернатанту за допомогою помпи, не торкаючись осаду сорбенту із ДНК.

11. Повторне виконання положень 9 та 10 протоколу.

12. Висушування осаду за температури 65 °С упродовж 5 хв.

13. Додавання до пробірок 50 мкл ЕкстраГену™ при постійному перемішуванні останнього розчину.

14. Суспензування вмісту пробірок на вортексі до отримання гомогенної суспензії та термостатування за температури 65 °С упродовж 5 хв.

15. Суспензування вмісту пробірок та центрифугування упродовж 1 хв при 10 000 об/хв.

16. Перенесення супернатанту до мікропробірок та зберігання за температури -20 °С. Поліморфізм rs730012 гена LTC4S визначали методом полімеразної ланцюгової реакції (PCR) з наступним аналізом довжини рестрикційних фрагментів (PCR-RFLP) за Gan-nan Wang et al. із модифікаціями. Для цього ампліфікували ділянку промотора гена LTC4S за допомогою пари специфічних праймерів: прямого - 5' CAGGAACAGCCTGGATGGGT(G^T). AC 3' і зворотного (antisense) - 5' ACTTTCTCCAGGGCCTTGCAG 3'. (“Metabion”, Німеччина). Для ампліфікації брали 50-100 нг ДНК і додавали до суміші, що містила 5 мкл 5-кратного PCR-буферу, 1,5 мМ сульфату магнію, 200 мкМ суміші чотирьох нуклеотидтрифосфатів, по 15 pM кожного з праймерів і 1,0 ОД Taq-полімерази ("Thermo Scientific", США), об'єм доводили до 25 мкл деіонізованою водою. PCR проводили в термоциклері GeneAmp PCR System 2700 ("Applied Biosystems", США). Ампліфікація фрагмента промотора складалася з 35 циклів: денатурація - 94°С (50 с), гібридизація праймерів - 62,5°С (40 с) і елонгація - 72°С (1 хв). 6 мкл продукту ампліфікації інкубували при 37°С протягом 16 годин з 2 ОД рестриктази KpnI ("Thermo Scientific", США) у буфері KpnI такого складу: 10 мМ трис-HCl (pH 7,5), 10 мМ хлориду магнію, 0.02% тритон X-100 і 0,1 мг/мл альбуміну. Якщо в 647 позиції гена LTC4S містився аденін, утворювався ампліфікат, який складався з 112 пар основ. Якщо аденін замінювався на цитозин, то ампліфікат розщеплювався рестриктазою KpnI на два фрагменти - 90 і 22 пари основ. Ампліфікати після рестрикції розділяли в 2,5% агарозному гелі, що містив 10 мкг/мл бромистого етидію. Горизонтальний електрофорез (0,1А; 160V) проводили протягом 25 хв. Візуалізацію ДНК після електрофорезу здійснювали за допомогою трансілюмінатора ("Біоком", Росія).

Результати рестрикційного аналізу A-444C (rs730012) поліморфізму гена LTC4S. M - маркер молекулярної маси (по - пари нуклеїнових основ); доріжки 1,3,5,7,9,11 відповідають A/A-генотипу; доріжки 6,12 - A/C-генотипу; 2,4,8,10 - C/C-генотипу.

Результати

Генетичне дослідження для групи із 181 хворого на БА показало наступні характеристики за поліморфізмом гена LTC4-S -444C: генотип АА - 77 осіб, АС - 73 особи та СС - 31 особа.

У групі хворих на БА частота досліджуваних генотипів А/A, A/C та С/C за LTC4S поліморфізмом склала 42,6%, 40,3% та 17,1% відповідно. У контрольній групі частота генотипів становила 56,8%, 37,0% та 6,2% відповідно (табл.3).

Таблиця 3

Розподіл частот генотипів гена LTC4-S у хворих на БА та в контрольній групі

Розподіл генотипів за досліджуваним поліморфізмом перевіряли на відповідність рівновазі Харді-Вайнберга за допомогою %² критерію (табл.4).

Таблиця 4

Розподіл частот генотипів гена LTC4-S відповідно до рівноваги Харді-Вайнберга та за результатами дослідження

Тобто розподіл генів у популяції за результатами експерименту можна вважати таким, що відповідає нульовій гіпотезі Н0. Аналіз розподілу генотипів поліморфізму -444А/С в гені LTC4S для рівноваги Харді-Вайнберга показав, що статистично значимих відмінностей від розподілу за законом немає (р=0,05).

Надалі маємо для хворих із генотипом СС розглянути ефективність застосування антилейкотриєнової терапії (або у якості альтернативної до ГКС, або у якості комбінованої).

Висновки

Базисне лікування (використання ГКС) не завжди дає відповідь, хворі не мають повного контролю БА та навіть може спостерігатися його відсутність. Тому для хворих, у яких спостерігається недостатній контроль БА, логічно змінити тактику лікування - із використанням антилейкотрієнової терапії. А оскільки в літературі крім суперечливих даних щодо асоціації -444A/C поліморфізму гена лейкотрієн С4 синтетази із розвитком БА, є ще й дані про залучення його в патогенез аспіринової БА, то отримуємо, що сучасна практика лікування БА має базуватися на проведенні генетичного аналізу та використанні в антилейкотрієнової терапії.

У дослідженні було задіяно 181 пацієнт із БА та 81 практично здорових, яких за результатами генетичного дослідження поділено на три групи в залежності від типу поліморфізму - генотипи АА, АС та СС. Визначення алельного поліморфізму гена LTC4 -S -444C (rs 730012) проводили методом полімеразної ланцюгової реакції з подальшим аналізом довжини рестрикційних фрагментів за Gan -nan Wang et al. із модифікаціями.

У групі хворих на БА частота досліджуваних генотипів А/А, А/C та С/C за LTC4S поліморфізмом склала 42,6%, 40,3% та 17,1% відповідно. У контрольній групі частота генотипів становила 56,8%, 37,0% та 6,2% відповідно.

Розподіл генотипів поліморфізму -444А/С в гені LTC4S у популяції за результатами експерименту можна вважати таким, що відповідає рівновазі Харді-Вайнберга (р=0,05).

Напрямок подальших досліджень полягає у обґрунтуванні використання результатів генетичного аналізу при виборі терапії лікування БА в залежності від генотипу та фенотипу хворого.

Список використаних джерел

1. Arriba-Mendez S., Sanz C., Isidoro-Garcia M., Pascual M., et al. Analysis of 927T> C CYSLTR1 and-444A> C LTC4S polymorphisms in children with asthma. Allergologia et immunopathologia. 36 (5), 259-263.

2. Berghea E.C., Popa L. O., Dutescu M. I., Meirosu M., Berghea F. et al. Association of Leukotriene C4 Synthase A-444C Polymorphism with Asthma and Asthma Phenotypes in Romanian Population. Maedica (Bucur). 2015 Jun;10(2):91-96.

3. Borgeat P., Samuelsson B. Transformation of arachidonic acid

by rabbit polymorphonuclear leukocytes: formation of a novel

dihydroxyeicosatetraenoic acid. J Biol Chem. 1979; 254: 2643-2646.

4. Borgeat P., Samuelsson B. Metabolism of arachidonic acid in polymorphonuclear leukocytes. Structural analysis of novel hydroxylated compounds. J Biol Chem. 1979 Aug 25;254(16):7865-9.PMID: 468794.

5. Cai C., Zhou M.-x., Li Y.-p., Chen C.-s. Association of leukotriene gene polymorphisms with response to antileukotriene treatment in patients with asthma Zhonghua Jie He He Hu Xi Za Zhi. 2011 May;34(5):362-6.

6. Global Initiative for asthma. Global Strategy for Asthma Management and Prevention. Interim Guidance About COVID -19 and Asthma, Updated 20 Dec 2020. URL: http://www.ginasthma.com.

7. Kadry H. M., Atta A. H., Sultan M. K., El-Baz N.A. Leukotriene C4 Synthase and Leukotriene Receptor-1 Genes Polymorphism Among Atopic Asthmatic Patients. American Journal of Immunology. 2014, 63-72.

8. Kedda M.-A., Shi J., Duffy D., Phelps S., Yang I., O'Hara K., etc. Characterization of two polymorphisms in the leukotriene C4 synthase gene in an Australian population of subjects with mild, moderate, and severe asthma J Allergy Clin Immunol. 2004 May;113(5):889-95.n doi: 10.1016/j.jaci.2004.02.008.

9. Ledford D. et fl.2015 Ledford D. K., Lockey R. F. Asthma and comorbidities. Curr Opin Allergy Clin Immunol. 2013 Feb;13(1):78- 86. doi: 10.1097/ACI.0b013e32835c16b6.

10. Lima J. J., Zhang S., Grant A., Shao L., Influence of Leukotriene Pathway Polymorphisms on Response to Montelukast in Asthma. Am J Respir Crit Care Med. 2006 Feb 15;173(4):379-85. doi: 10.1164/rccm.200509-1412OC.

11. Mastalerz L., Gawlewicz-Mroczka A., Nizankowska E., Cmiel A., Szczeklik A. et al. (2002) Protection against exercise-induced bronchoconstriction by montelukast in aspirin-sensitive and aspirin-tolerant patients with asthma. Clin Exp Allergy. 2002 Sep; 32(9):1360-5. doi: 10.1046/j.1365-2745.2002.01484.x.

12. Mastalerz L., Kumik J. Антилейкотриеновые препараты в лечении бронхиальной астмы. Ліки України. 2013 р. №7 (103). С.21-24. URL: http://www.health-medix.com/articles/liki_ukr/2012-08-14/lec_ 2.pdf.

13. Sanak M., Pierzchalska M., Bazan-Socha S., Szczeklik A.

Enhanced expression of the leukotriene C(4) synthase due to overactive transcription of an allelic variant associated with aspirin-intolerant asthma Am J Respir Cell Mol Biol. 2000 Sep;23(3):290-6. doi:10.1165/ajrcmb.23.3.4051.

14. Sayers I, Barton S, Rorke S, Beghe B, Hayward B, etc. Allelic association and functional studies of promoter polymorphism in the leukotriene C4 synthase gene (LTC4S) in asthma. Thorax. 2003 May;58(5):417-24. doi: 10.1136/thorax.58.5.417.

15. Shin H.D., Park K.S., Park C.S. Lack of association of GPRA (G protein-coupled receptor for asthma susceptibility) haplotypes with high serum IgE or asthma in a Korean population. J Allergy Clin Immunol. 2004; 114: 1226-1227.

16. Wang G.-n., Zhang J.-s., Cao W.-j., Sun H., Zhang J., Wang

Y., Xiao H. Association of ALOX5, LTA4H and LTC4S gene polymorphisms with ischemic stroke risk in a cohort of Chinese in east China. World J Emerg Med. 2013; 4(1): 32-37. doi:10.5847/wjemj.issn.1920-8642.2013.01.006.

17. Wu Y.-H., Liu C.-T., Wang K., Geng Y.-M. The relevance of leukotriene C(4) synthase gene A (-444) C polymorphism to clinical responsiveness to montelukast in patients with asthma. Zhonghua Jie He He Hu Xi Za Zhi. 2008. Nov;31(11):806-10.

18. Zhang Y., Huang H., Huang J., Xiang Z., Yang M. et al. The - 444A/C polymorphism in the LTC4S gene and the risk of asthma: a meta -

analysis. Arch Med Res. 2012. Aug; 43(6):444-50. doi:10.1016/j.arcmed.2012.08.003.

19. Зайков С.В., Міхей Л.В., Кулик Л.Г., Кириченко Л.М. Особливості клініки, діагностики та лікування аспіринової бронхіальної астми. Новини медицини та фармації: Аллергология и пульмонология. (380) 2011. URL: http://www.mif-ua.com/archive/issue- 21193/.

20. Пат. 119475 U Україна, МПК G01N 33/50 (2006.01).

Спосіб прогнозування неконтрольованого перебігу бронхіальної астми / А.М. Бондаркова, Л.Н. Приступа, В.В. Кмита, Н.А. Чередніченко (Україна); № u201703564; заявл. 12.04.2017; опубл. 25.09.2017, бюл. № 18. URL: https://uapatents.com/6-119475-sposib-prognozuvannya-nekontrolovanogo -perebigu-bronkhialno -astmi.html

Размещено на Allbest.ru