Insilico-аналіз молекулярних механізмів фармакологічної дії кверцетину

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Державна установа «Інститут фармакології та токсикології Національної академії медичних наук України»

Insilico-аналіз молекулярних механізмів фармакологічної дії кверцетину

Л.С. Бобкова

Т.А. Бухтіарова

З.С. Суворова

О.Є. Ядловський

м. Київ

Анотація

Сьогодні дослідження механізмів біологічної дії флавоноїдів, таких як кверцетин, рутин, гесперитин, лютеолін та інших, їхніх фармакологічних властивостей є актуальними. У реалізації цього напряму важливе місце має insilicoмолекулярний докінг, який дає можливість теоретичного передбачення механізму та спектра фармакологічної дії як окремої сполуки, так і ряду сполук, визначити мішень-орієнтовані сполуки-хіти, означити пріоритети цільового пошуку мультитаргетних препаратів тощо.

Мета дослідження - огляд insilico-досліджень з молекулярних механізмів фармакологічної дії кверцетину як потенційного мультитаргетного препарату.

В огляді наведено сучасні дані щодо найпоширеніших insilicoдосліджень кверцетину - його міжмолекулярних комплексів з різними білками-мішенями. Означено терапевтичний потенціал кверцетину як протитуберкульозного, протималярійного, протизапального, протипухлинного засобу, а також засобу проти ожиріння та для лікування хвороби Альцгеймера порівняно зі стандартними лікарськими засобами. Представлено результати молекулярного докінгу кверцетину та його аналогів як інгібіторів протеїнів BAX, iNOS, SGK-1, ZnF26, ADM (протипухлинна дія), а також протеїнів COX-2, MSX2, HOXA10, HOXA5, MAPK14 (протизапальна дія). Спрямований пошук потенційних інгібіторів COX-2 в ряду похідних кверцетину є новим напрямом у розробці протизапальних речовин, які важливі при запальних процесах нормальних, а також ракових клітин, здатних модулювати відповідь на хіміотерапію. Фермент iNOSстав новою мішенню в пошуку інгібіторів серед деяких протипухлинних речовин (зокрема, кверцетину та його похідних) через свою важливість у спричиненні пухлинної хвороби. Так, підвищений рівень експресії iNOSбув виявлений у різних злоякісних пухлинах. У результаті докінгу похідних кверцетину (з відомою протипухлинною дією) було виділено три сполуки - хіти, які показали найкращу взаємодію з ензимом iNOSпорівняно з кверцетином. Для кверцетину як мультицільового ліганду були визначені потенційні мішені протипухлинної (SGK-1) та протизапальної дії (MAPK14). У цілому отримані результати вказують, що кверцетин може здійснювати протизапальну та протипухлинну дію шляхом впливу на сигнальний шлях NF-kB.

Ключові слова: кверцетин, фармакологічна дія, молекулярні механізми, докінг-аналіз

Abstract

L.S. Bobkova, T.A. Burhtiarova, Z.S. Suvorova, O.E. Yadlovskyi

In silico analysis of molecular mechanism of pharmacological action of quercetin

The purpose of the study was to review in silico methods of studying the molecular mechanisms of the pharmacological action of quercetin as a potential multitarget drug. The data on the most common in silico studies of quercetin intermolecular complexes with various target proteins are provided in the review.

Therapeutic potential of quercetin for its anti-tuberculosis, anti-malarial, anti-inflammatory, anticancer, anti-obesity properties and for Alzheimer's disease treatment was compared with standard drugs by means of Molecular Docking Simulation analysis. An interactions with mycolic acid cyclopropane synthase (PDB id: 1KPI), plasmepsin II (PDB id: 1SME), cyclooxygenase-1 (PDB id: 2OYE), human estrogen receptor alpha (PDB id: 3ERT), fat mass and obesity associated (FTO) protein (PDB id: 3LFM), and with BACE1 (PDB id: 4IVT) were studied. Quercetin possessed higher scores (-9.00, -6.36, -8.53, -7.28, -7.89, -6.68 kcal/mol) as anti-tuberculosis, anti-malarial, anti-inflammatory, antineoplastic (breast - cancer), anti-obesity and anti-Alzheimer's drugs respectively.

The results of molecular docking of quercetin and its derivatives in anticancer proteins (BAX, iNOS, SGK-1, ZnF26, ADM) and anti-Inflammatory proteins (COX-2, MSX2, HOXA10, HOXA5 MAPK14) are presented. Targeted search for potential inhibitors is a new direction in the development of antiinflammatory substances, which are important in the inflammatory processes of normal cells and cancer cells, capable of modulating the response to chemotherapy.

The intermolecular interactions of COX-2 with flavonoids (12 compounds) were studied using two programs (FlexX, ArgusLab). The binding energy of quercetin with COX-2 were -8,94 kkal/mol, which indicates the energetic benefit of complex formation.

The iNOS enzyme has become a new target for search of inhibitors (in particular, quercetin and its derivatives) because of its involvement in malignant growth. It is important, that increased expression of iNOS has been found in various malignant tumors. As a result of the docking analysis of quercetin derivatives, three hit compounds were isolated, and they showed the best interaction with the iNOS enzyme compared to quercetin.

The intermolecular interactions of the quercetin with MSX2, HOXA10, HOXA5 and MAPK14 (antiinflammatory proteins), SGK-1, BAX, ZnF26 and ADM (anti-cancer proteins) were studied. The binding energies ranged from -7,6 to -9,7 kkal/mol, and from -6,6 to -9,5 kkal/mol, respectively. The results obtained indicate that anti-inflammatory and anti-cancer effects of quercetin may be through its influence on NF-kB signaling pathway.

Key words: quercetin, pharmacological action, molecular mechanism, docking analysis

Основна частина

Останнім часом у світі суттєво зріс інтерес до досліджень потенційного терапевтичного потенціалу фітохімічних речовин, орієнтованих на «молекулярні мішені» [1]. Сьогодні дослідження механізмів біологічної дії фітохімічних речовин, таких як флавоноїди - кверцетин, рутин, гесперитин, лютеолін та інших, їхніх фармакологічних властивостей, досить актуальні [1-11]. У реалізації цього напряму важливе місце має теоретичне передбачення фармакологічних властивостей, а саме insilico-молекулярний докінг [12-15]. Флавоноїди є малотоксичними сполуками, виконують низку функцій у клітинах рослин і здатні регулювати біологічні процеси в організмі людини, зокрема за патологічних станів. Для розробки ефективних, безпечних, мішень - орієнтованих, зокрема мультитаргет - них препаратів увагу науковців привертає флавоноїд кверцетин. Це значною мірою пов'язано з широким спектром його фармакологічної дії (антиоксидантної, протизапальної, протипухлинної, протимікробної, противірусної тощо [16]) та з іншими властивостями, обумовленими структурними особливостями молекули. Важливими є фармакокінетичні/ токсикологічні (ADME/T) характеристики кверцетину, в основі яких є відповідність усім п'яти правилам

Ліпінські та відсутність мутагенних і канцерогенних властивостей. До структурних особливостей молекули кверцетину, що важливі для міжмолекулярної взаємодії з макромолекулою білка-мі - шені, належать полярність молекули (дипольний момент 5.97 D) та шість ротаційних ступенів свободи, які забезпечують молекулі кверцетину певну конформаційну гнучкість, і таким чином сприяють необхідному її розташуванню в сайті зв'язування білка - мішені (поворотні зв'язки в молекулі кверцетину відмічені стрілкою):

Завдяки наявності електронегативних атомів кисню та ароматичної пі-електронної системи в структурі молекули кверцетин має здатність утворювати з амінокислотними залишками білка-мішені міжмолекулярні зв'язки електростатичної взаємодії (водневі, ван-дер-Ваальсові), а також пі-пі зв'язки (п-п bond), пі-сигма (pi-sigmabond) зв'язки тощо. З іншого боку, досліджують взаємодію ліганду з макромолекулою цільового білка на такій його ділянці (сайт зв'язування), де внесок у вільну енергію зв'язування є основним (згідно з концепцією «гарячих точок» [17-19]), і, як наслідок, такий сайт зв'язування є основною мішенню для розробки лікарських засобів.

Мета дослідження - огляд insilico-досліджень з молекулярних механізмів фармакологічної дії кверцетину як потенційного мультитаргетного препарату.

Матеріали та методи. Білки-мішені для фармакологічної дії кверцетину (1). Дослідження вибіркової дії кверцетину на окремі одиничні мішені. Докінг-аналіз взаємодії кверцетину з одиничними мішенями був використаний у пошуку речовин різної спрямованості дії [20-22]. У цих дослідженнях як цільові мішені були обрані регулятор апоптозу (apoptosisregulator) BAXпротеїн (Bcl-2 - associatedX, PDBID: 1F16) [20], інду - цибельна нітрогеноксидсинтаза (ензим iNOS, humaninduciblenitricoxidesynthase, PDBID: 4NOS) [21], циклопропансинтаза міколової кислоти (mycolicacidcyclopropanesynthase, PDBid: 1KPI), плазмепсин II (plasmepsinII, PDBid: 1SME), циклооксигеназа І (COX-1, cyclooxygenase-1, PDBid: 2OYE), пов'язаний з ожирінням протеїн (massandobesity - associated (FTO) protein, PDBid: 3LFM), естрогеновий рецептор альфа (humanestrogenreceptoralpha, PDBid: 3ERT) та низка інших [22]. Для оцінки лікарської здатності кверцетину активні сайти цільових білків були вибрані з використанням сервера PockDrug, а докінг кверцетину в цільові мішені був спрямований на прогнозування найпоширеніших мод зв'язування з білком [22].

Білки-мішені для фармакологічної дії кверцетину (2). Дослідження кверцетину як мультицільового ліганду до взаємопов'язаних мішеней. Потенційні білки-мішені протипухлинної та протизапальної дії кверцетину - (SGK-1) та (MAPK14). Були досліджені білки-мішені протизапальної (білкові молекули MSX2, HOXA10, HOXA5 та MAPK14) та протипухлинної (білкові молекули SGK-1, BAX, ZnF26 та ADM) дії [23]. Також були проведені дослідження лігандів (зокрема й кверцетину) як дуальних COX-2 інгібіторів у контексті впливу на протипухлинну терапію [24]. Низка речовин з протизапальною активністю, включаючи катехін, дигідроміри - цетин, діосметин, були вивчені як дуальні COX - LOXінгібітори [2].

Аналіз комплексу «протеїн - ліганд» та активні сайти зв'язування білків. Алгоритми пошуку та скорингові функції. Загальна стратегія методу молекулярного докінгу призначена генерувати можливі позиції (конформацію й орієнтацію - разом згадується як «поза/позиція») молекул-лігандів у місцях зв'язування макромолеку - лярної мішені, які ранжуються за допомогою скорингових функцій [25]. Програми для молекулярного докінгу вирізняються за алгоритмом пошуку режиму зв'язування (bindingmode) та за скоринговою функцією (SF). При цьому алгоритм пошуку передбачає аналіз і генерацію позиції ліганду в місці зв'язування мішені, враховуючи обертально-трансляційний і внутрішній ступінь свободи ліганду.

Алгоритми. Стратегії пошуку часто класифікують як систематичні, сто - хастичні або детерміновані [25]. Алгоритми систематичного пошуку поступово досліджують ступінь свободи ліганду. Наприклад, FlexXвикористовує підходи на основі фрагментів із систематичними алгоритмами (поступова побудова та добір діаграм). За алгоритмом стохастичного пошуку AutoDockVinaзастосовує випадкові зміни ступенів свободи ліганду, однак такий алгоритм не гарантує збіжності до найкращого рішення (щоб покращити його виконують ітерацій - ний процес).

Скорингові функції. Скорингові функції (scoringfunction, SF) згруповані в три основні типи: силове поле, емпіричні та засновані на знаннях. Функції на основі силового поля складаються з суми енергетичних членів. Емпіричні оцінювальні функції виводяться з кількісних зв'язків структура-активність і передбачають афінність зв'язування з високою точністю, використовуючи відомі експериментальні дані про афінність зв'язування. Функції, які засновані на знаннях, базуються на частоті взаємодій пар атомів, які спостерігаються в експериментально визначених ББ-структурах комплексів ліганд - мішень. Прикладом функції, заснованої на знаннях, є DrugScore (програма FlexX) [25].

Не зважаючи на бурхливий розвиток апаратного та програмного забезпечення досліджень, прогнозування афінності зв'язування рецептора з лігандами все ще є серйозною проблемою для програм стикування, і частина підходів покладається на схеми консенсусної оцінки та звертається до повторної оцінки [26, 27]. Консенсусна оцінка покращує точність молекулярного докінгу, використовуючи стратегії стикування, які поєднують дві або більше SF, зокрема, оцінку реранжування (Rerankscore), оцінку суми загальної енергії зовнішньої та внутрішньої взаємодії ліганду (MolDockscore) [21].

Молекулярний докінг кверцетину в цільові білки-мішені виконано з використанням кількох програм (Moleculardockingsoftware), серед яких є добре відомі, такі як AutoDockVina[20], FlexX[24], MolegroVirtualDocker [21], а також SchrodingerMaestro (v11.1) [22]. Оцінювання міжмолекулярної взаємодії кверцетину та стандартних лікарських засобів з визначеними мішенями здійснено за пакетом програм SchrodingerMaestro (v11.1) [22]. Міжмолекулярну взаємодію COX-2 з природними флавоноїдами (12 сполук) і целекоксибом вивчали за двома програмами FlexX (+LeadIT) та ArgusLab4.0.1. [24], а BAXпротеїну з кількома фенольними сполуками за програмою AutoDockVina[20]. Молекулярний докінг кверцетину в iNOSвиконали з використанням MolegroVirtualDocker, MVD5.0 (Molegro2011) [21]. Основні характеристики використаного авторами програмного забезпечення за алгоритмом пошуку режиму зв'язування (bindingmode) та за скоринговою функцією (SF) наведено в таблиці 1.

Зазвичай розташування сайту зв'язування, на якому зосереджені обчислення стикування, відоме. Однак, якщо інформація про область зв'язування відсутня, то застосовують прогнозовані найімовірніші сайти зв'язування або виконується моделювання «сліпого докінгу» [26]. Дослідження активного сайту зв'язування є невід'ємною частиною докінгових досліджень, тому що воно визначає зв'язування ліганду на рецепторі. Як зазначають M.M. Nasanі співавт., активний сайт зв'язування - це певне місце на поверхні рецептора, де сполуки мають тенденцію зв'язуватися та спричиняють конформаційні зміни, які здатні індукувати фармакологічну дію [22]. Оцінюючи ком - лексоформуючі сили за участю кверцетину та цільового білка-мішені, автори вивчали міжмолекулярні водневі зв'язки та гідрофобні взаємодії, зазначаючи залишок амінокислоти та віддаль між атомами рецептора та ліганду [21, 22, 24].

Результати та їх обговорення. Прогноз молекулярних механізмів фармакологічної дії кверцетину методом insilicoздійснюють за схемою: від «протеїну-мішені» та ліганду через процедуру молекулярного докінгу до «протеїн-лігандового» комплексу та його аналізу.

Зазвичай можна визначити кілька найпоширеніших напрямів досліджень механізму дії сполук, зокрема кверцетину, за методом insilico. Так, вивчають міжмолекулярні взаємодії досліджуваної молекули (однієї молекули або кількох її похідних) з однією мішенню. Такий підхід спрямований на прогнозування можливого механізму дії досліджуваної молекули або визначення сполук-хітів з мішень-орі - єнтованим механізмом дії [20, 21]. Іноді за результатами докінгу досліджувану молекулу порівнюють з молекулами відомих препаратів, що визначає необхідність подальшого дизайну вибраної структури. Крім того, за іншим підходом, вивчають міжмолекулярні взаємодії однієї молекули з кількома мішенями поряд з докінгом кількох молекул (відомих препаратів або нових молекул) з тими самими вибраними мішенями. Це дозволяє дослідникам визначити як спектр фармакологічної дії такої молекули, так і пріоритетні напрями пошуку кандидата в лікарські засоби (ЛЗ) зі заданим молекулярним механізмом фармакологічної дії [22].

Міжмолекулярні комплекси низки фенольних сполук - кверцетину (1), галової кислоти (2), p-кумарової кислоти (3) та 4-гідрокси-3-метокси - коричної кислоти (4), - з BAXпротеїном (TheBcl-2-associatedX, apoptosisregulator, PDBID: 1F16) [20]. Міжмолекулярні комплекси низки фенольних сполук наведено на рисунку 1, де скорочення наступні: TYR - тирозин, HIS - гістидин, GLY - гліцин, ARG - аргінін, ASP - аспарагінова кислота, THR - треонін, SER - серин, ILE - ізо-лейцин, LEU - лейцин, GLU - глутамінова кислота, ALA - аланін, MET - метіонін, GLN - глутамін, VAL - валін, PRO - пролін, TRP - триптофан, PHE - фенілаланін.

Таблиця 1. Алгоритми пошуку позицій ліганду та скорингові функції (SF), що використані для молекулярного докінгу кверцетину

За отриманими результатами кверцетин характеризується кращою міжмолекулярною взаємодією порівняно з іншими досліджуваними молекулами (докінг енергія (-7.8) ккал / моль). Ліганд-протеїнові комплекси всіх чотирьох молекул охарактеризовані відповідним оточенням амінокислотних залишків, водневими та гідрофобними взаємодіями. Три гідроксильні групи кверцетину з Gln190, Asp99, Glu259утворюють три водневі зв'язки з віддалями 2.46 А, 2.30 А та 2.54 А відповідно. Чотири водневі зв'язки галової кислоти сформовані за участю замісників карбоксилу (два водневих зв'язки з Asp98, Asp99з віддалями 2.13 А та 2.61 А відповідно) та мета-, пара-гідроксилів (два водневих зв'язки з Phe64, Thr263з віддалями 3.00 А та 2.21 А відповідно). Два водневих зв'язки 4-гідрокси-3-метокси-

коричної кислоти з Glu259та Ile257з віддалями 2.45 А та 2.50 А відповідно. Гідроксильні групи пара-кумаро - вої кислоти віддалені від Leu62та Pro63на 5.32 А та 5.42 А відповідно (дві гідрофобні взаємодії).

За результатами докінгу всі чотири досліджені сполуки були розміщені всередині однієї й тієї самої кишені BAXпротеїну (сайту зв'язування) (рис. 2). Згідно з даними аналізу докінгових комплексів, в оточенні досліджених лігандів (1-4) є спільні амінокислотні залишки: Phe36, Pro63 (1-4), Asp98, Ile100, Gln256, Ser260, Thr263 (1, 2, 4), Asp99, Gly258 (1, 2), Gln190 (1, 3), які характеризують сайт зв'язування ВАХ протеїну (рис. 1, 2).

У дослідах invitroвивчали життєздатність ракових клітин лінії helaза впливу екстрактів Moringaoleifera, що містять кверцетин (розчинники - н-гексан, хлороформ, етилацетат, бутанол, вода), і виявили її пригнічення до 50%, що демонструє потенційну протиракову активність досліджених фенольних сполук.

Міжмолекулярні комплекси кверцетину та відомих препаратів з білками - мішенями (PDBID: 1KPI, 1SME,

Рис. 1. Міжмолекулярні комплекси низки фенольних сполук

2OYE, 3LFM, 3ERT, 4IVT) для оцінювання лікарської здатності кверцетину [22]. Результати insilicoдослідження міжмолекулярних комплексів лігандів (кверцетину та відомих препаратів) з шістьма різними білка - ми-мішенями показали переваги кверцетину за величиною енергії докінгу [22]:

Рис. 2. Розміщення кверцетину (1), галової кислоти (2), п-кумарової кислоти (3) та 4-гідрокси-3-метоксикоричної кислоти (4) у кишені BAXпротеїну

Крім визначення енергії докінгу (Gscore/SchrodibgerDockingscore, kcal/ mol) автори зверталися до повторної оцінки міжмолекулярних комплексів [27] шляхом MM/GBSAаналізу (MolecularMechanics/GeneralizedBornSurfaceArea - молекулярна механіка/узагальнена площа поверхні Борна), за яким розраховують енергію зв'язування (MM/GBSAdGBindingenergy, kcal/mol) [22]. За величиною енергії зв'язування (MM/ GBSA) комплекси кверцетину з 1KPI, 3LFM, 4IVTє також більш енергетично вигідними при порівнянні їх з відповідними комплексами препаратів (Тіацетазон, Піразинамід, Ізоніазид; Орлістат, Кетилістат, Лоркасе - рин; Галантамін, Доперезил, Ривас - тигмін). Проте комплекси кверцетину і Тафенохіну з 1SMEта кверцетину і Аспірину з 2OYEхарактеризуються енергіями зв'язування (MM/GBSA) -41,73 і -47,00 ккал / моль відповідно, та -19,46 і -30,90 ккал / моль відповідно).Загальну тенденцію переваг за енергією докінгу комплексу кверцетину з 3ERTпорівняно з відповідними комплексами досліджених препаратів також порушують результати MM/GBSAаналізу: -39,03 ккал / моль у Кверцетину порівняно з -40,62, -51,69, -70,34 ккал / моль у Тамоксифе - ну, Тореміфену, Ралоксифену відповідно). Оскільки повторна оцінка фармакологічного потенціалу кверцетину за MM/GBSAаналізом не завжди співпадає з результатами оцінки за первинним докінг-аналізом видається доцільним використання ще одного варіанту оцінки міжмолекулярних комплексів, що порівнюються.

Усі досліджені ліганд-протеїнові комплекси кверцетину охарактеризовані водневими, Ван-дер-Ваальсови - ми та гідрофобними взаємодіями, аналіз яких було виконано за графічними даними за умови їхнього максимального збільшення (зауважимо, що в оригінальній статті таблиця містить деякі невідповідності з рисунком через певний зсув даних). Як визначили автори, довжина водневого зв'язку між протоном кверцетину або препарату порівняння та відповідним гетероатомом амінокислотного залишку від 3,07 А до 6,0 А (проте зазвичай довжина водневого зв'язку в межах 2,5-3,0 А), й у водневих зв'язках беруть участь дві, три або чотири гідроксильні групи кверцетину (табл. 2).

Таблиця 2. Особливості водневого зв'язку в міжмолекулярних комплексах білка-мішені з кверцетином або препаратом порівняння

Отримані результати характеристик докінгових комплексів за оточенням досліджених лігандів (табличні дані скориговані з графічними) дозволяють певною мірою визначити сайт зв'язування відповідного протеїну (табл. 3).

Як стверджують автори дослідження, молекулярний докінг з різними білками-мішенями був застосований для вивчення потенційної фармакологічної активності кверцетину та показав хороші результати міжмолекулярної взаємодії. Результати докінгової оцінки, як зазначають автори, вказують на потужніший інгібуючий потенціал кверцетину щодо окремих захворювань, ніж у стандартних препаратів, доступних на ринку. Таким чином, кверцетин слід розглядати як ефективний кандидат у препарати для лікування деяких зі зазначених захворювань [22].

Результати молекулярного докін - гу кверцетину та його аналогів у ензим iNOS (humaninduciblenitricoxidesynthase) [21]. Через свою важливість у спричиненні пухлинної хвороби, фермент iNOSстав новою мішенню в пошуку протипухлинних агентів. Підвищений рівень експресії iNOSта його активності були виявлені в різних злоякісних пухлинах. Оскільки раніше в деяких експериментах показана протиракова дія кверцетину як інгібітора iNOSі в зв'язку зі застереженнями щодо його біодоступності, важливою була його молекулярна модифікація. У цьому напрямі автори Singhта Konwar[21] вибрали для дослідження флавоноїди з базовим скелетом дифенілпро - пану (С6-С3-С6) - кверцетин та його аналоги (CID: 5281604, 5315126,9818879, 5481966, 5282154, 13964550, 5281691, 11834044, 6477685). Результатидокінгу цих сполук дозволили виділити три сполуки-хіти, які показали найкращу взаємодію з ензимом iNOS (рис. 3, табл. 4).

Використання стратегії докінгу, що поєднує кілька скорингових функцій (зокрема, MolDockscore, Rerankscore, totalinteractionenergy), дозволяє однозначно підтвердити загальну тенденцію переваг міжмолекулярної взаємодії трьох сполук-хітів з ензимом iNOSу відповідному порівнянні з кверцетином.

Результати докінгу сполук-хітів і кверцетину в ензим iNOS, kJ/mol[21]