Изменение иммунных и биохимических показателей крови крыс при введении бактериофагов

Размещено на http://www.allbest.ru/

Изменение иммунных и биохимических показателей крови крыс при введении бактериофагов

Бактериофаги, широко применяемые в лечебной практике и не считающиеся патогенными для людей, могут вызывать «болезни микробиоты» и косвенно инициировать развитие воспалительных заболеваний, которые являются следствием повышенной проницаемости кишечника. Целью работы является изучение влияния бактериофагов на иммунные и биохимические показатели крови крыс при пероральном и ректальном способах введения. В крови определяли связанные с развитием воспаления биохимические показатели: концентрацию зонулина, кортизола, сиаловых кислот, малонового диальдегида и каталазы. Реакцию иммунной системы на введение бактериофагов оценивали по изменению содержания лейкоцитов в крови, концентрации циркули-рующих иммунных комплексов и иммуноглобулина G. О наличии эндогенной интоксикации организма судили по сорбционной способности эритроцитов. Пероральное введение бактериофагов в течение 14 суток не вызывало значимого изменения исследуемых показателей в крови крыс. При ректальном введении бакте-риофагов отмечались признаки развития воспалительной реакции в организме: достоверное увеличение общего количества лейкоцитов, концентрации сиаловых кислот, малонового диальдегида, тенденция к повышению концентрации зонулина и увеличению концентрации циркулирующих иммунных комплексов.

Ключевые слова: бактериофаги, воспаление, лейкоциты, иммунные показатели, зонулин, биохимические пока-затели.

иммунный кровь бактериофаг

С начала девяностых годов ХХ столетия говорят о серьезном «кризисе антибактериальной те-рапии» за счет возрастания этиологической роли микроорганизмов, резистентных к большинству ан-тибиотиков [1]. В связи с этим во всем мире отмечается существенный рост интереса к бакте-риофагам, как к профилактическим и лечебным препаратам, который во многом был подкреплен Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ), определившей бактериофаги как «новый метод ле-чения», действие которого основано на инфицировании и разрушении микробной клетки. Кроме того, бактериофаги не обладают негативными свойствами, присущими антибиотикам: токсичностью, спо-собностью вызывать аллергические реакции, выраженным побочным действием на симбиотическую микрофлору организма человека, индукцией антибиотикорезистентности у патогенных и условно-патогенных микроорганизмов [2].

Вместе с тем, использование бактериофагов с целью профилактики и лечения инфекций, несо-мненно, требует критической беспристрастной оценки, основанной на принципах доказательной ме-дицины, поскольку существует ряд принципов и сложностей, связанных с применением бакте-риофагов в отношении бактериальных инфекций, в том числе инфекций, связанных с оказанием ме-дицинской помощи. Так, бактериофаги, широко применяемые для коррекции микрофлоры толстой кишки, при дисбактериозах способны оказывать влияние как на условно-патогенную, так и на сим- бионтную микрофлору кишечника, подавляя рост нормальных симбионтов толстой кишки [3; 4]. Кроме того, результаты исследований, проведенных Tetz G. и соавторами в 2016-2017 гг., свидетель-ствуют о том, что бактериофаги инициируют воспаление за счет повышения концентрации циркули-рующего эндотоксина и провоспалительных цитокинов, которое в конечном итоге может привести к повышенной проницаемости кишечника [5; 6]. В ряде других исследований демонстрируется досто-верное увеличение в слизистой оболочке и подслизистой основе количества лимфоцитов, иммунопо- зитивных к а-синуклеину, а также экспрессия этого белка в нейронах межмышечных и подслизистых нервных сплетений [7]; экспрессия а-синуклеина в клетках Панета [8]; повышение проницаемости гематоэнцефалического барьера и инициация нейровоспаления при введении бактериофагов [9].

Таким образом, бактериофаги, широко применяемые в лечебной практике и не считающиеся патогенными для людей, могут вызывать «болезни микробиоты» и косвенно инициировать развитие патологий, которые являются следствием повышенной проницаемости кишечника, в том числе си- нуклеопатий.

Работа выполнена с целью изучения влияния бактериофагов на иммунные и биохимические показатели крови крыс при различных способах введения.

Материалы и методы исследований

Поскольку бактериофагальное инфицирование кишечной микробиоты способно инициировать синдром «протекающей кишки», предполагается изменение концентрации зонулина - белка, регули-рующего проницаемость кишечного барьера. Повышенная проницаемость кишечника, как правило, сопряжена с развитием воспалительного процесса, маркерами которого являются изменения общего количества лейкоцитов и их отдельных фракций, индекса соотношения лейкоцитов (ИСЛК), а также концентрации циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) и иммуноглобулина G (IgG), концен-трации сиаловых кислот, кортизола. Воспалительный процесс любого генеза способен привести к развитию окислительного стресса [10; 11]. Для оценки активности свободнорадикального окисления определяли уровень малонового диальдегида (МДА) в эритроцитах. Состояние антиоксидантного звена оценивали по активности каталазы. О наличии эндогенной интоксикации организма судили по сорбционной способности эритроцитов.

Проведено два эксперимента по краткосрочному (14 дней) введению бактериофагов различны-ми способами: перорально и ректально. Все экспериментальные животные содержались

в стандартных условиях вивария (12-часовой световой день, свободный доступ к пище и воде). Перед проведением исследования в течение недели проводили хэндлинг животных. Работы с животными проводились в соответствии с положениями Хельсинкской декларации 1975 г. и ее пересмотренного варианта 2000 г.

Эксперимент по пероральному введению бактериофагов проведен на 10 беспородных половоз-релых крысах-самцах массой от 220 до 310 грамм, разделенных на две группы по 5 особей. Живот-ным опытной группы ежедневно перорально вводили по 0,5 мл препарата «Пиобактериофаг ком-плексный» (Microgen, Россия). Препарат представляет собой готовый для применения раствор, со-держащий смесь бактериофагов против Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Enterococcus, Staphylococ-cus, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca и энтеропатогенной Escherichia coli различных серогрупп. Животным контрольной группы вводили по 0,5 мл воды для инъекций.

Во втором эксперименте по ректальному введению бактериофагов было задействовано 15 бес-породных половозрелых крыс-самцов массой от 110 до 250 грамм. Животные были разделены на 3 группы по 5 особей. Крысам опытной группы ежедневно вводили ректально по 0,5 мл раствора смеси бактериофагов «Пиобактериофаг комплексный», контрольной группы - по 0,5 мл стерильного фи-зиологического раствора. Третья группа - интактные животные, не получавшие инъекции, но подвергавшиеся аналогичным ручным манипуляциям, проводимым с животными основной и контрольной групп.

По окончании каждого из экспериментов под эфирным наркозом отбирали кровь из сердца крыс, производили подсчет общего количества лейкоцитов в камере Горяева, готовили мазки для определения лейкоцитарной формулы (лейкограммы) крови, используя стандартные методики. Гепа-ринизированную кровь центрифугировали для получения плазмы и дальнейшего биохимического исследования.

Концентрацию зонулина и кортизола в плазме крови определяли методом иммуноферментного анализа готовыми диагностическими наборами (a-Synuclein ELISA Kit, USA и ДС-Стероид- Кортизол, Россия).

Концентрацию сиаловых кислот в плазме определяли по реакции с резорцином.

Определение концентрации циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) проводили по ме-тоду Гриневича и Алферова (1981), который основан на селективной преципитации комплексов анти-ген-антитело 3,75 %-ным раствором ПЭГ-6000 с последующим фотометрическим определением плотности преципитата при длине волны 450 нм.

Определение концентрации иммуноглобулина G (IgG) осуществили методом радиальной имму-нодиффузии по Манчини.

Осадок эритроцитов отмывали физиологическим раствором и определяли в эритроцитах концен-трацию малонового диальдегида (МДА) по реакции с тиобарбитуровой кислотой, активность каталазы определяли по реакции с молибдатом аммония, сорбционную способность эритроцитов (ССЭ) - по по-глощению метиленового синего.

Статистическую обработку результатов исследования проводили с использованием программ «Statistica 10.0», пакета компьютерных программ «Microsoft Excel» для операционной системы Windows. Достоверность различий между группами крыс выявляли с помощью непараметрического U-критерия Манна-Уитни. Различия выборок считали достоверными при уровне значимости p<0,05.

Результаты и их обсуждение

Показатели крови крыс при пероральном и ректальном введении бактериофагов

Примечание: данные представлены в виде X±s, где Х - среднее групповое значение, s - стандартное от-клонение; *отмечены достоверные отличия от интактной группы (р<0,05), # отмечены достоверные отли-чия от контрольной группы (р<0,05).

При ректальном введении бактериофаги поступают непосредственно в кишечник, поэтому, в отличие от перорального введения, их гибель минимальна. Однако следует учесть, что контрольной группе животных вместо бактериофагов вводился стерильный физиологический раствор, который, предположительно, способен вымывать микробиоту кишечника и, как следствие, также иницииро-вать воспалительный процесс и синдром «протекающей кишки». В связи с этим сравнение результа-тов производилось относительно интактной группы.

Отмечается некоторое увеличение концентрации зонулина, что может свидетельствовать о структурных изменениях слизистой оболочки кишечника, влекущих ее повышенную проницае-мость как при введении бактериофагов, так и при введении физиологического раствора.

В опытной группе животных наблюдается достоверное увеличение общего количества лейко-цитов более чем в 2 раза, обусловленное повышением количества лимфоцитов. При этом отмечается тенденция к снижению индекса сдвига лейкоцитов крови, что говорит об активации лимфоцитов, представляющих эффективное звено иммунного ответа на заключительных этапах воспалительных и инфекционных заболеваний.

Эти изменения лейкограммы сопровождались тенденцией к увеличению концентрации ЦИК (на 64 % относительно интактных животных и на 24 % относительно контрольной группы). При этом изменения содержания в крови иммуноглобулина G не происходило. Образование иммунных ком-плексов является ответом иммунной системы на действие чужеродных антигенов. ЦИК состоят из специфических иммуноглобулинов, компонентов системы комплемента и антигенов, и повышение их уровня в крови происходит в том случае, если поступающие антигены растворимы и циркулируют в кровотоке. Крупные ЦИК выводятся через печень и селезенку, остальные захватываются и перевари-ваются фагоцитами. Повышенный уровень циркулирующих иммунных комплексов может отражать наличие воспалительного процесса на системном уровне, который развивается вследствие транслока-ции бактериальных антигенов из просвета кишечника при участии зонулина.

При ректальном введении бактериофагов выявлен достоверный рост концентрации сиаловых кислот в крови животных опытной группы относительно интактной группы (на 102 %) и контрольной группы, получавшей ректально физиологический раствор (на 88 %). Сиаловые кислоты - это ацили- рованные производные нейраминовой кислоты, находящиеся преимущественно в связанном состоя-нии в составе гликопротеинов, гликолипидов, олигосахаридов на поверхности клеток. Они придают поверхности клеток отрицательный заряд, способствуют формированию вязкости секрета ротовой полости, желудочно-кишечного тракта, половых и дыхательных органов. В кровеносном русле в сво-бодном виде присутствуют в небольшом количестве, участвуя в биохимических процессах. Рост кон-центрации сиаловых кислот говорит о деградации гликолипидов, гликопротеинов и гликанов, что наблюдается при воспалительных реакциях организма. Высвобождаясь в кровоток, сиаловые кислоты деактивируют болезнетворные вирусы и бактерии.

Определение кортизола - основного гомеостатического регулятора при воспалительной реак-ции - выявило достоверное снижение его концентрации на 64 % в опытной группе по сравнению с интактной. В медицинской практике кортикостероиды обычно применяют в высоких дозах для по-давления воспалительной реакции. В литературе, посвященной развитию стресс-реакции организма, описывается повышение концентрации кортикостероидов и их противовоспалительные эффекты по принципу «доза-эффект». Между тем недавние исследования демонстрируют более сложную взаимо-связь между кортикостероидами и иммуноопосредованным воспалением. Регуляция кортизолом вос-паления может быть двойственной (про- и противовоспалительной) и динамичной, развивающейся с течением времени. Так, нормальные суточные концентрации глюкокортикоидов способны стимули-ровать и поддерживать активность защитных механизмов и оказывать провоспалительное воздей-ствие, иметь отсроченные эффекты. Более высокие стресс-индуцированные или фармакологические концентрации действуют остро, подавляя воспаление и предотвращая повреждение тканей в резуль-тате чрезмерной или длительной воспалительной реакции [12].

Сорбционная способность эритроцитов используется для оценки эндогенной интоксикации орга-низма, причинами которой могут быть накопление микробных токсинов, развитие воспалительных и деструктивных процессов в органах и тканях и другие факторы. Отсутствие достоверных изменений ССЭ говорит о том, что введение фагового препарата с установленной дозой в 0,5 мл/сутки вне зависи-мости от способа введения является недостаточным фактором для развития эндогенной интоксикации.

Ректальное введение препарата бактериофагов приводило к достоверному повышению в эритроцитах МДА как по сравнению с интактной группой, так и с контрольной группой животных. МДА относится к конечным продуктам перекисного окисления липидов, образуется при окислении полиненасыщенных жирных кислот. Рост концентрации МДА говорит об интенсификации процессов перекисного окисления липидов и, следовательно, о более активной продукции активных форм кис-лорода в организме. МДА, действуя на свободные NH2-группы в белках, фосфолипидах и гликозами- нах, может образовывать поперечные сшивки внутри одной молекулы, между разными белками,

между белками и фосфолипидами. Из-за этого активность ферментативных белков изменяется, пада-ют возможности структурных белков, каналообразующие мембранные белки деформируются и про-ницаемость мембран возрастает, снижается текучесть мембраны, жизнеспособность и функциониро-вание клетки уменьшаются. Некоторые из продуктов перекисного окисления полиеновых жирных кислот оказывают выраженное цитотоксическое действие.

Интенсификация процессов свободнорадикального окисления сопровождалась достоверным повышением в эритроцитах активности каталазы на 155 % относительно интактной группы и на 56 % относительно контрольной группы. Компенсаторный рост активности каталазы также указывает на активацию свободнорадикальных процессов.

Таким образом, пероральное введение бактериофагов в течение 14 суток не вызывало значимо-го изменения исследуемых показателей в крови крыс. При ректальном введении бактериофагов отме-чались признаки развития воспалительной реакции в организме: достоверное увеличение общего ко-личества лейкоцитов, концентрации сиаловых кислот, малонового диальдегида, тенденция к повы-шению концентрации зонулина и увеличению концентрации циркулирующих иммунных комплексов.

Выводы

2. Ректальное введение бактериофагов в течение 14 суток сопровождалось достоверным повы-шением в плазме крови концентрации сиаловых кислот, снижением кортизола и тенденцией к повы-шению концентрации зонулина. В эритроцитах достоверно повышалась концентрация малонового диальдегида и активность каталазы.

3. При ректальном введении бактериофагов отмечается достоверное увеличение общего коли-чества лейкоцитов, тенденция к снижению ИСЛК и увеличению концентрации циркулирующих им-мунных комплексов.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Лазарева Е.Б., Меньшиков Д.Д. Бактериофаги - история вопроса и современное состояние фаготерапии // Медицинский алфавит. 2014. № 4. С. 43-48.

2. Саперкин Н.В., Квашнина Д.В., Ковалишена О.В., Шольтен Р.Дж.Р.М., Рюзендаль Е. Эффективность фаго-терапии: методологические особенности систематического обзора // Медицинский альманах. 2018. № 4 (55). С. 129-132.

3. Катаева Л.В., Вакарина А.А., Степанова Т.Ф., Степанова К.Б., Бычкова Л.А. Литическая активность бакте-риофагов в отношении возбудителей острых кишечных инфекций // Здоровье населения и среда обитания. 2015. № 3. С. 39.

4. Лавренова Э.С., Юрко Л.П., Славнов Н.Н., Бочков И.А. Влияние лечебных бактериофагов на микрофлору толстой кишки // Инфекционные болезни. 2012. Т. 10, № 2. С. 56-60.

5. Tetz G., Ruggles K.V., Zhou H., Heguy A., Tsirigos A., Tetz V. Bacteriophages as potential new mammalian path-ogens // Sci Rep. 2017. Vol. 7, no. 1. P. 7043

6. Tetz G., Tetz V. Bacteriophage infections of microbiota can lead to leaky gut in an experimental rodent model // Gut Pathog. 2016. Vol. 8. P. 33.

7. Сергеев В.Г., Танаева М.С., Сергеева Т.Н., Чучков В.М. Влияние бактериофагального инфицирования мик-робиоты на экспрессию альфа-синуклеина в стенке кишечника крыс // Журнал анатомии и гистопатологии. 2018. Т. 7, № 4. С. 61-66.

8. Кузнецова Ю.Н. Длительное бактериофагальное инфицирование микробиоты кишечника крыс снижает экс-прессию альфа-синуклеина в клетках Панета // Симбиоз-Россия 2019: материалы XI Всерос. конгр. молодых ученых-биологов с межд. участием (Пермь, 13-15 мая 2019 г.) / Перм. гос. нац. исслед. ун-т. Пермь, 2019. С. 262-263.

9. Сергеева Т.Н., Чучков В.М., Сергеев В.Г. Влияние бактериофагального инфицирования микробиоты кишеч-ника на проницаемость гематоэнцефалического барьера // Сборник тезисов международной конференции «Инновационные исследования в области биомедицины» памяти академика В.Н. Ярыгина. / Под ред. Арча-кова А.И. М.: ФГБОУ ВО РНИМУ им. Н.И. Пирогова, 2019. С. 34-35.

10. Зенков Н.К. Исследование механизмов развития окислительного стресса при воспалении и возможностей его антиоксидантной коррекции: автореф. дис. ... докт. биол. Наук. Новосибирск, 2007. 35 с.

11. Иванишкина Е.В. Оценка показателей окислительного стресса при воспалительных заболеваниях в терапевтической практике, возможности коррекции // Земский врач. 2015. №2 (26). С. 24-27.

12. Yeager М.Р., Pioli P.A., Guyre P.M. Cortisol exerts bi-phasic regulation of inflammation in humans // Dose Re-sponse. 2011. Vol 9 (3). P. 332-347.

N. Yu. Shunaylova, E.A. Madera

CHANGES IN IMMUNE AND BIOCHEMICAL PARAMETERS OF RAT BLOOD AFTER ADMINISTRATION OF BACTERIOPHAGES

Bacteriophages, widely used in medical practice and not considered pathogenic to humans, can cause "microbiota dis-eases" and indirectly initiate the development of inflammatory diseases that result from increased intestinal permeabil-ity. The aim of the work is to study the effect of bacteriophages on the immune and biochemical parameters of rat blood during oral and rectal administration. Biochemical parameters associated with the development of inflammation were determined in the blood: the concentration of zonulin, cortisol, sialic acids, malondialdehyde and catalase. The reaction of the immune system to administration of bacteriophages was assessed by changes in the content of leukocytes in the blood, the concentration of circulating immune complexes and immunoglobulin G. The presence of endogenous intoxi-cation of the body was judged by the sorption capacity of erythrocytes. Oral administration of bacteriophages for 14 days did not cause a significant change in the studied parameters in the blood of rats. With rectal administration of bac-teriophages, signs of the development of an inflammatory reaction in the body were noted: a significant increase in the total number of leukocytes, the concentration of sialic acids, malondialdehyde, a tendency to increase the concentration of zonulin and an increase in the concentration of circulating immune complexes.

Keywords: bacteriophages, inflammation, leukocytes, immune parameters, zonulin, biochemical parameters.

REFERENCES

1. Lazareva E.B., Menshikov D.D. [Bacteriophages - the history of investigation and modern state of phagotherapy], in Medicinskij alfavit [Medical alphabet], 2014, no. 4, pp. 43-48 (in Russ.).

2. Saperkin N.V., Kvashnina D.V., Kovalishena O.V., Shol'ten R.Dzh.R.M., Ryuzendal' E. Effektivnost'fagoterapii: metodologicheskie osobennosti sistematicheskogo obzora [Effectiveness of phage therapy: methodological features of a systematic review], in Meditsinskiy al'manakh, 2018, no. 4 (55), pp. 129-132 (in Russ.).

3. Kataeva L.V., Vakarina A.A., Stepanova T.F., Stepanova K.B., Bychkova L.A. [Bacteriophage lytic activity against pathogens of acute intestinal infections], in Zdorov'e naselenia i sreda obitania [Public Health and Life Environ-ment - PH&LE], 2015, no. 3, p. 39 (in Russ.).

4. Lavrenova E.S., Yurko L.P., Slavnov N.N., Bochkov I.A. [The influence of therapeutic bacteriophages on microflo-ra of the large intestine], in Infektsionnye bolezni, 2012, vol. 10, no. 2, pp. 56-60 (in Russ.).

5. Tetz G., Ruggles K.V., Zhou H., Heguy A., Tsirigos A. and Tetz V. Bacteriophages as potential new mammalian pathogens, in Sci Rep, 2017, vol. 7, no. 1, p. 7043.

6. Tetz G., Tetz V. Bacteriophage infections of microbiota can lead to leaky gut in an experimental rodent model, in GutPathog, 2016, vol. 8, p. 33.

7. Sergeev V.G., Tanaeva M.S., Sergeeva T.N., Chuchkov V.M. [Influence of bacteriophage infections of microbiota on the expression of alpha-synuclein in the rat intestinal wall], in Zhurnal anatomii i gistopatologii, 2018, vol. 7, no. 4, pp. 61-66 (in Russ.).

8. Kuznetsova Yu.N. Dlitel'noe bakteriofagal'noe infitsirovanie mikrobioty kishechnika krys snizhaet ekspressiyu al'fa- sinukleina v kletkakh Paneta [Prolonged bacterial infection of the rat gut microbiota reduces the expression of alpha- synuclein in Paneta cells], in Mater. XI Vseros. kongr. molodykh uchenykh-biologov s mezhd. uch. “Simbioz-Rossiya 2019”/ Perm. Gos. Nats. Issled. Univ. Perm', 2019, pp. 262-263 (in Russ.).

9. Sergeeva T.N., Chuchkov V.M., Sergeev V.G. Vliyanie bakteriofagal'nogo infitsirovaniya mikrobioty kishechnika na pronitsaemost' gematoentsefalicheskogo bar'era [The effect of bacteriophage infection of the intestinal microbio-ta on the permeability of the blood-brain barrier], in Sborn. tezisov mezhd. konf “Innovatsionnye issledovaniya v ob- lasti biomeditsiny, Archakov A.I. (ed). Moscow: Ross. Nats. Issled. Med. Univ. im. N.I. Pirogova, 2019, pp. 34-35 (in Russ.).

10. Zenkov N.K. [Investigation of the mechanisms of oxidative stress development in inflammation and the possibilities of its antioxidant correction], Abstract of diss. Dr. Biol. Sci. Novosibirsk, 2007, 35 p. (in Russ.).

11. Ivanishkina E.V. [Estimation of parameters of oxidative stress in inflamation diseases in therapeutics practice and possibility correction], in Zemskiy vrach, 2015, no. 2 (26), pp. 24-27 (in Russ.).

12. Yeager M.P., Pioli P.A. and Guyre P.M. Cortisol exerts bi-phasic regulation of inflammation in humans, in Dose Response, 2011, vol. 9 (3), pp. 332-347.

Размещено на Allbest.ru/