Лабораторные методы диагностики кокцидиоза

Размещено на http://www.allbest.ru/

Реферат

«ЛАБОРАТОРНЫЕ МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ КОКЦИДИОЗА»

Студентки: Ященко Ирины Денисовны

Специальность: Медико-биологический факультет

Группа: Лд 23-1



Содержание

Введение

1. Кокцидиоз-паразитарная инвазия

1.1 Этиология, патогенез инвазии

1.2 Жизненный цикл кокцидии

1.3 Клиническая картина кокцидиоза

1.4 Профилактика инвазии

1.5 Диагностика кокцидиоза

2. Лабораторная диагностика кокцидиоза

2.1 Паразитологический метод диагностики кокцидиоза

2.1.1 Метод нативного мазка кала и окрашенного раствором Люголя

2.1.2 Консервация простейших

2.1.3 Метод Фюллеборна

Заключение

Список использованных источников



Введение

кокцидиоз возбудитель мазок заражение

Актуальность темы связана с тем, что кокцидиоз является достаточно редким паразитарным заболеванием человека, которое без адекватной терапии приводит к смертельному исходу больного в 5-7% случаев. Особенностью этой паразитарной инвазии является чрезвычайное разнообразие клинических проявлений даже при заражении одним и тем же видом возбудителя - от бессимптомного (субклинического) течения до тяжелейших проявлений. Это объясняется сложным воздействием комплекса разнообразных и многочисленных внешних и внутренних патогенетических факторов, влияние которых закономерно изменяется в зависимости от стадии и длительности болезни [1].

Человека может поражать только кокцидия Isospora belli или Isospora hominis. Изоспоры широко распространены в природе, их насчитывается более 200 видов. Большое значение в заражении человека могут играть домашние животные, при одновременном несоблюдении правил личной гигиены. Человек становится хозяином паразита при заглатывании с продуктами или водой ооцист, которые впоследствии начинают выделяться с испражнениями заболевшего кокцидиозом. На протяжении нескольких суток кокцидия созревает в условиях почвы [4].

При кокцидиозе, вызываемом I. belli, источником возбудителей инвазии является человек. В окружающей среде ооцисты кокцидий могут сохранять жизнеспособность в течение нескольких месяцев. Факторами передачи возбудителей являются пища, вода, руки и предметы обихода, загрязненные фекалиями, содержащими ооцисты кокцидий. Источником инвазии при кокцидиозе, вызванном I. hominis, является крупный рогатый скот. Заражение людей происходит при употреблении плохо проваренного или прожаренного мяса, содержащего цисты кокцидий [2].

Кокцидиоз регистрируется обычно в единичных случаях, однако описаны вспышки в детских яслях, охватившие в течение короткого срока (ок. 2 мес.) св. 30% детей.

Заболевание распространено повсеместно (случаи его регистрировались в 78 странах мира), но несколько чаще встречается в теплых регионах РФ и мира, случаи заражения были зафиксированы в Узбекистане, на Кавказе, в Крыму [5].

Возбудитель Isospora belli Wenyon, 1923, и Isospora hominis (Rivolta, 1878) Dobell, 1919, относится к семейству Eimeriidae класса Sporozoa типа Protozoa. В Южной Африке описаны единичные случаи обнаружения у человека кокцидии Isospora natalensis Elsdon-Dew, 1953, но их патогенность для человека выяснена пока недостаточно.

В РФ единичные случаи заболевания человека кокцидиями, зарегистрированы в Узбекистане, на Кавказе, в Крыму. Заболевание человека вызывают кокцидии Isospora belli и Isospora hominis. Кокцидии локализуются в эпителиальных клетках кишечника и проходят три фазы развития. Этот цикл завершается выделением с фекалиями ооцист, устойчивых к действию неблагоприятных факторов, поэтому они способны длительно сохраняться во внешней среде и заражать новых хозяев, обладая при этом широкой хозяйственной специфичностью.

Заражение происходит при проглатывании с пищей и водой ооцист, выделяющихся с калом больных кокцидиями и в течение 2-5 суток созревающих в почве. Каждая зрелая ооциста содержит 8 спорозоитов. В кишечнике человека спорозоиты выходят из ооцист, внедряются в эпителий, разрушают его, возникает воспаление, изредка образуются язвы. Появляются лихорадка с температурой до 39°С, слабость, понижение аппетита, поносы [1].

Кокцидиоз (coccidiosis) -- инвазионная болезнь, возникающая в результате развития в клетках кишечного эпителия человека паразитических простейших -- кокцидий и характеризующаяся нарушением функций кишечника при нерезко выраженных явлениях интоксикации [4].

Цель работы. Провести анализ лабораторных методов диагностики кокцидиоза.

В соответствии с указанной целью поставлены следующие задачи:

1. Провести анализ литературы по исследуемой теме.

2. Определить методы лабораторной диагностики кокцидиоза.



1. Кокцидиоз-паразитарная инвазия

1.1 Этиология и патогенез инвазии

Кокцидиоз - инвазионная болезнь, возбудителями которой у людей в основном являются Isospora belli и Isospora hominis.

Заболевание у людей протекает с явлениями энтерита или гастроэнтерита. Интоксикация при этом заболевании незначительная. Заболевание распространено повсеместно и может регистрироваться круглый год.

Кокцидии имеют сложный цикл развития, в котором бесполое размножение (шизогония) сменяется половым (спорогония), в результате чего образуется пропагативная стадия кокцидий -- ооциста, выделяемая в окружающую среду с фекалиями. У одних видов кокцидий весь цикл развития происходит в организме одного хозяина, у других видов -- со сменой хозяев.

Развитие ооцист до образования в них спорозоитов протекает у разных видов кокцидий в различные промежутки времени: от нескольких часов до нескольких дней. [6]

Isospora belli паразитируют только у человека в клетках эпителия тонкой кишки, где происходит весь цикл развития паразита (шизогония и спорогония).

Isospora hominis встречается у человека несколько реже, чем I. belli.

Источник заражения - человек, больной острой формой в период выздоровления и больные хроническими формами, выделяющие ооцисты.

Способ передачи возбудителей алиментарный, входные ворота - ротовая полость [5].

Заболевание развивается после попадания жизнеспособных цист в организм вместе с инфицированными пищевыми продуктами ил водой.

Инкубационный период длится до 7 дней. Возбудитель локализуется в кишечнике. [14]

Паразитируя в организме человека, изоспоры живут в тонком кишечнике. Шизогония происходит в слое клеток, расположенных под эпителием. Ооцисты выходят в просвет кишечника и выделяются с фекалиями.

Заболевание может протекать как бессимптомно, так и в форме с явными клиническими признаками [8].

Клинически выраженные формы кокцидиоза у детей развиваются чаще, чем у взрослых.

Приблизительно через неделю после заражения появляется лихорадка, развивается быстрая утомляемость и общая слабость. Регистрируются случаи с выраженной диареей, повышением температуры и истощением. Заболевание может длиться от шести недель до шести месяцев, заканчивается, как правило, выздоровлением. [2]

Хронические формы заболевания наблюдаются чаще всего среди групп населения, проживающих в плохих санитарных условиях, при нарушении санитарных норм питания, т.е. там, где есть реальные условия для продолжительного реинфицирования.

Патогенез. При проникновении спорозоитов в клетки эпителия кишечника возникает катаральное воспаление слизистой оболочки, приводящее к расстройству функций кишечника и обильным выделениям слизи, иногда с примесью крови. [1]

1.2 Жизненный цикл кокцидии

У человека паразитирует один вид кокцидий (от лат. coccus - круглый) - Isosрогd belli [8]. Развитие кокцидии, бесполое и половое, происходит в эпителиальных клетках слизистой оболочки тонкого кишечника. С испражнениями зараженного человека выделяются ооцисты (рис.1) - бесцветные прозрачные образования длиной 20-30 мкм, с двухконтурной оболочкой. Формы ооцист овальная, несколько вытянутая с одним зауженным концом. В свежевыделенных испражнениях ооцисты незрелые и содержат в центре шарообразную зародышевую массу. При комнатной температуре в течение 2-3 дней этот шар делится поперечно, разделившиеся части покрываются оболочкой - образуются две спороцисты длиной 12-14 мкм. В каждой из них образуются 4 спорозоита вытянутой серповидной формы. Ядро в спорозоите имеет вид светлого пузырька. В окружающей среде ооцисты сохраняются несколько месяцев. При заглатывании человеком зрелых ооцист с загрязненными водой, пищей, в кишечнике из них освобождаются спорозоиты, внедряются в клетки стенок кишечника и начинают развиваться [9].

Рис. 1 Ооцисты кокцидии

Цикл развития кокцидий проходит период деления ядра: шизонт вместо одного ядра получает несколько ядер. Их количество может колебаться от восьми штук до шестидесяти. Развивающийся шизонт перерастает клетку эпителия и понемногу переходит в подэпителиальный соединительнотканный слой. Цикл развития шизонта заканчивается размножением бесполым путём. По окружности каждого отдельно взятого ядра определяется цитоплазматическая зона, вследствие чего происходит распад шизонта на одноядерные клеточные структуры веретенообразной формы. Здесь бесполое размножение шизонта подходит к концу: его ещё называют множественным делением или шизогонией. Описанный цикл продолжается примерно 90 часов. Получившиеся в результате веретенообразные клетки именуют термином «мерозоиты» [6].

Мерозоиты снова оказываются в клетках кишечного эпителия и продолжают размножение: так зарождается следующее поколение шизонтов. Этот процесс проходит несколько дольше - примерно 120 часов. Второе поколение, в свою очередь, порождает третье. Те мерозоиты, которые не способны формировать шизонты, способствуют зарождению гамет (половых клеточных структур). Такие клетки имеют четкое разделение на мужские и женские макрогаметы [7].

Оплодотворение - это важнейший этап развития кокцидий. Взаимодействие микро- и макрогамет происходит с образованием внутренней оболочки, при этом зигота оказывается в просвете кишечника. Такая зигота с двухслойной оболочкой называется ооцистой. Далее внутренний этап развития паразита заканчивается, так как ооцисте для жизнедеятельности требуется кислород. Для этого ооциста кокцидии должна покинуть кишечник хозяина [13].

1.3 Клиническая картина кокцидиоза

Кокцидиоз у человека появляется при употреблении заражённой ооцистами воды и продуктов питания. Среди детей и в странах с тёплым климатом уровень заражения заметно выше. Кокцидии являются облигатными паразитами, так что для выживания вне организма носителя необходимо принимать форму ооцисты [16].

Экспериментально установлено, что инкубационный период при Кокцидиозе, вызванном I. belli, длится 6-7 дней. При естественном заражении он, по-видимому, может быть иным [10]. Заболевание протекает разнообразно, без характерных особенностей. Чаще всего оно выражается симптомами энтерита, реже энтероколита, и сопровождается небольшим повышением температуры. Больные жалуются на общую слабость, головную боль, отсутствие аппетита, тошноту, боли в животе. Стул жидкий с примесью слизи, иногда крови, 4-6 и более раз в сутки. Острые проявления кокцидиоза связаны с периодом бесполого размножения кокцидий (шизогония) в эпителии тонкой кишки и обычно продолжаются около 2-х недель С наступлением периода спорогонии острые явления затихают и в фекалиях появляются ооцисты, выделение которых может продолжаться от нескольких дней до 1 месяца и более. При исследовании крови больных кокцидиозом в ряде случаев определяется гипохромная анемия; со стороны лейкоцитарной формулы крови особых изменений не отмечено. Заболевание продолжается примерно около 1 месяца и обычно заканчивается выздоровлением [11].

Описаны случаи тяжелого течения кокцидиоза с внезапным началом, бурным течением, с повышением температуры до 39°, частым (до 20 раз в сутки) жидким стулом с примесью большого количества слизи, гноя и крови, с резко выраженной интоксикацией. В ряде случаев заболевание К. приобретает затяжное течение и выделение ооцист, сопровождаемое расстройством кишечника, может продолжаться несколько месяцев.

Значительная часть случаев кокцидиоза протекает без каких-либо симптомов и определяется лишь обнаружением в фекалиях ооцист кокцидий.

При кокцидиозе, вызванном I. hominis, при котором в кишечнике человека протекает только половой цикл развития кокцидий, клинические, симптомы ограничены лишь незначительным расстройством кишечника [22].

1.4 Профилактика инвазии

Человек может обезопасить себя от заражения кокцидиозом простым соблюдением санитарно-гигиенических норм. Это частое мытье рук, употребление в пищу только мытых или прошедших термообработку овощей и фруктов, поддержание чистоты в жилых и подсобных помещениях [20]. Большое внимание уделяется питанию: пища должна быть свежей и сбалансированной, а питьевая вода - чистой и набранной из известных проверенных источников.

Доказано, что кокцидии от домашних животных не могут передаваться человеку, однако соблюдение элементарных гигиенических правил при содержании животного является обязательным [1].

1.5 Диагностика кокцидиоза

На ранней стадии развития заболевание кокцидиоз по симптоматике часто диагностируют, как бактериальную дизентерию.

Диагноз кокцидиоза устанавливается при обнаружении ооцист кокцидий в нативных мазках кала, а также в мазках, окрашенных раствором Люголя или 1 % раствором двухромовокислого калия. Просмотр препаратов производится при увеличении 10х40 или 7х40. Так как ооцисты почти прозрачные, их легче заметить при опущенном конденсоре и полузакрытой диафрагме. Поскольку паразитов в кале всегда мало и они обнаруживаются с трудом, следует исследовать серию проб фекалий, просматривая в каждой по 8-10 препаратов и не менее 100 полей зрения в каждом из них. Для повышения эффективности диагностики рекомендуется также проводить флотацию исследуемого материала в насыщенном растворе поваренной соли по методу Фюллеборна [19].

В мазках, окрашенных раствором Люголя и железным гематоксилином, ооцисты имеют вид продолговато-эллипсоидных телец, один или два конца которых иногда сужены. Размеры их - 20 - 33 х 1О - 19 (30х12) мкм. Стенка ооцист тонкая, гладкая и бесцветная. В незрелых ооцистах сосредоточенная в центре цитоплазма образует зернистый шар с ядром в виде светлого округлого пятна. В зрелых цистах видны две покрытые собственной оболочкой овальные спороцисты с четырьмя удлиненными, запятовидными спорозоитами и остаточными телами внутри каждой [22].

Диагноз может быть поставлен лишь на основании обнаружения ооцист кокцидий в фекалиях больного. Ооцисты появляются в фекалиях после острого периода заболевания, вследствие чего диагноз всегда запаздывает и ставится уже в период выздоровления больного.

Культуральный и иммунологический методы в диагностике кокцидиоза не применяются [12].

Таким образом, кокцидиоз выявляется довольно редко в виде спорадических случаев, но инфицированность населения при этом в сельских районах может составлять 3-4% от всего населения. Человек может обезопасить себя от заражения кокцидиозом простым соблюдением санитарно-гигиенических норм. Кокцидии от домашних животных не могут передаваться человеку, однако соблюдение элементарных гигиенических правил при содержании животного является обязательным.



2. Лабораторная диагностика кокцидиоза

2.1 Паразитологический метод диагностики кокцидиоза

Паразитологическая диагностика основывается на прямом обнаружении и идентификации возбудителей. В биологическом материале, направляемом на исследовании в лабораторию, паразит бывает в тех стадиях, с помощью которых он передается (непосредственно или через переносчика) от инфицированного больного окружающим лицам. Обычно это яйца или личинки гельминтов, также цисты и вегетативные формы простейших [16].

В общеклинической практике применяется в основном копроовоскопический метод диагностики простейших. Метод приготовления нативного мазка из свежих испражнений или соскобов из анальной области с последующим микроскопированием дешевый, но недостаточно информативный. Выделение цист простейших происходит с определенной периодичностью, они могут быть деформированными, а также вступившие в различные стадии эмбриогенеза. Это усложняет трактовку результатов исследования. Продуктивность работы лаборанта зависит от качества микроскопа, который должен быть бинокулярным, и снабжен микрометром [14].

Эффективность паразитологических исследований не является абсолютной и зависит от ряда условий:

1) правильность взятия пробы и приготовления препарата для микроскопии, бережности транспортировки и хранения,

2) компетентности исследования лаборантом препаратов, приготовленных из проб,

3) своевременности передачи результатов исследования лечащему врачу,

4) грамотной интерпретации этих результатов лечащим врачом и адекватным использованием их для выбора тактики лечения.

При несоблюдении одного из этих условий эффективность паразитологического исследования снижается.

Решающими для диагноза кокцидиоза являются результаты паразитологического исследования. Паразитологический диагноз кокцидиоза ставят при обнаружении в исследуемом материале ооцист кокцидии [5].

Материалом для исследования служат фекалии.

К паразитологическому методу диагностики относятся следующие методы:

1. Микроскопические методы:

Метод прямого мазка - заключается в нанесении фекального материала на предметное стекло, его окрашивании и визуализации под микроскопом. Кокцидии обычно проявляются в виде ооцист, содержащих спорозоиты, которые можно идентифицировать их характерной формой и размерами.
Метод концентрации - основан на применении специальных техник для разделения патогенных организмов от остальных компонентов фекального материала, чтобы повысить их концентрацию перед микроскопическим исследованием. Примерами таких методов являются флотация, седиментация [21].

2. Молекулярные методы:

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) - Принцип метода основан на многократном увеличении числа копий специфичного для данного возбудителя участка ДНК. С помощью ПЦР-анализа можно диагностировать инфекцию в остром периоде и выявлять случаи носительства. Это метод, который позволяет увеличивать количество ДНК в пробе для последующего определения наличия и идентификации кокцидий. Этот метод особенно полезен для определения редких или недостаточно видимых ооцист.
Секвенирование ДНК - позволяет определить генетическую информацию кокцидий и сравнить ее с уже известными данными в базах данных. Это позволяет проводить дальнейшее исследование видового состава и эпидемиологии заболеваний [12].

С первого дня болезни проводят микроскопию нативных мазков из свежевыделенного кала в физиологическом растворе и мазков кала, окрашенных раствором Люголя. При остром и подостром течении заболевания, а так же у реконвалесцентов и бессимптомных носителей - ищут ооцисту кокцидии. Можно готовить также постоянные препараты, окрашенные гематоксилином по Гейденгайну [3].

Для повышения эффективности паразитологических исследований применяют многократное (до 3-6 раз) исследование свежевыделенных фекалий (не позднее 10-15 минут после дефекации) и сбор материала в консервирующие жидкости для длительного хранения препарата, а также используют методы флотации.

В некоторых случаях с испражнениями выделяется незначительное количество кокцидий в мазках их можно обнаружить лишь при повторных многократных анализах.

В нативном мазке можно обнаружить ооцисты кокцидий, длина которых составляет в среднем 25-30 мкм, а ширина - 12-15 мкм. В нативных препаратах видно, что тело кокцидии имеет овальную форму (преимущественно), тонкую двухконтурную оболочку бесцветные, прозрачные.

В постоянных препаратах, окрашенных по Гейденгайну, ооцисты кокцидий, как и в нативных мазках, легко обнаруживаются при малом увеличении микроскопа. Основными признаками для их распознавания являются характерная овальная форма тела с тонкой двухконтурной оболочкой [10].

Подробности строения кокцидии изучаются при большом увеличении микроскопа (10х40). Хорошо видны в незрелых ооцистах сосредоточенная в центре цитоплазма образует зернистый шар с ядром в виде светлого округлого пятна. В зрелых цистах видны две покрытые собственной оболочкой овальные спороцисты с четырьмя удлиненными, запятовидными спорозоитами и остаточными телами внутри каждой. [2]

Так как ооцисты почти прозрачные, их легче заметить при опущенном конденсоре и полузакрытой диафрагме. Поскольку паразитов в кале всегда мало и они обнаруживаются с трудом, следует исследовать серию проб фекалий, просматривая в каждой по 8-10 препаратов и не менее 100 полей зрения в каждом из них. Для повышения эффективности диагностики рекомендуется также проводить флотацию исследуемого материала в насыщенном растворе поваренной соли по методу Фюллеборна [6].

2.1.1 Метод нативного мазка кала и окрашенного раствором Люголя

Материал для исследования: испражнения.

Микроскопический метод

Из исследуемого материала готовят нативные неокрашенные мазки кала и окрашенные раствором Люголя.

Приготовление нативного мазка фекалий

На предметные стекла, отступая от края на 1,5-2см, пипеткой нанести по 1-2капли изотонического раствора в двух местах с промежутком в 4см.

Кончиком деревянной палочки из пробы фекалии выбрать патологические примеси или небольшой кусок и перенести в каплю на предметное стекло, растереть до получения равномерной негустой эмульсии. Той же палочкой набрать вторую порцию фекалий из другого участка пробы и приготовить препарат из второй капли на предметном стекле. Палочку оставить в банке с пробой фекалий. Пользоваться стеклянными палочками не рекомендуется, так как ими не удается набрать слизистые комочки. Жидкие кровянисто-слизистые испражнения без видимой примеси фекальных масс могут быть исследованы без добавления изотонического раствора натрия хлорида.

Полученные препараты (нативные мазки), если они оказались сухими, разбавляют из пипетки одной каплей изотонического раствора, накрывают покровными стеклами. [7]

В правильно приготовленном нативном мазке фекалий покровное стекло должно плотно прилегать к предметному с равномерным распределением жидкости между стеклами без ее выступания за пределы покровного стекла [3].

Если после наложения покровного стекла капля эмульсии выступила из-под покровного стекла и попала на ее верхнюю сторону, то препарат бракуют и готовят новый [11].

Густой мазок малопрозрачен. Если же взять слишком мало фекалий, то мазок получается слишком разведенным и простейших в нем может просто не оказаться. Через правильно приготовленный мазок должен быть виден печатный текст.

Просматривают не менее 5-6 мазков. После ориентировочного просмотра под малым увеличением обязательно применяют среднее увеличение (х10, х40). Освещение не должно быть ярким, иначе можно пропустить прозрачные объекты. Передвигать препарат наиболее удобно препаратоводителем [17].

В нативном мазке наблюдают ооцисты почти прозрачные, их легче заметить при опущенном конденсоре и полузакрытой диафрагме.

Для того чтобы увидеть ооцисты кокцидий, готовят мазок кала, окрашенный раствором Люголя. В мазках, окрашенных раствором Люголя и железным гематоксилином, ооцисты имеют вид продолговато-эллипсоидных телец, один или два конца которых иногда сужены. Размеры их - 20 - 33 х 10- 19 (30х12) мкм. Стенка ооцист тонкая, гладкая и бесцветная. В незрелых ооцистах сосредоточенная в центре цитоплазма образует зернистый шар с ядром в виде светлого округлого пятна. В зрелых цистах видны две покрытые собственной оболочкой овальные спороцисты с четырьмя удлиненными, запятовидными спорозоитами и остаточными телами внутри каждой [2].

Приготовление мазка, окрашенного раствором Люголя

Метод предназначен для обнаружения и идентификации кокцидий.

Применяется для диагностики кишечных протозоозов: лямблиоза, балантидиаза, амебиаза, кокцидиоза (изоспороза).

На предметное стекло нанести по 1-2 капли раствора Люголя в двух местах. Следующие этапы аналогичны приготовлению нативного мазка.

По окончании работы предметные стекла с мазками поместить в посуду с дезинфицирующим раствором.

Состав раствора Люголя по унифицированной методике: йодид калия - 3 г; кристаллический йод - 1,5 г; вода дистиллированная -- 100 мл. Вначале растворяют йодид калия, затем йод. Раствор стабилен в темной посуде с притертой пробкой при комнатной температуре не более месяца.

Ооцисты окрашиваются в золотисто-коричневый цвет. При окраске раствором Люголя ооцисты имеют вид продолговато-эллипсоидных телец, один или два конца которых иногда сужены [15].

Ооцисты кокцидии в препаратах, окрашенных железным гематоксилином, имеют те же размеры и общий вид, что и при обработке раствором Люголя. В препаратах, окрашенных железным гематоксилином, кокцидии благодаря необычной формы выделяются на фоне эритроцитов, лейкоцитов.

Одним из основных условий при проведении лабораторной диагностики кокцидиоза является исследование свежих испражнений, т.е. не позднее 15-20 мин после получения их от больного. При невозможности немедленного исследования испражнений допускается их консервация [9].

2.1.2 Консервация простейших

Консервация простейших кокцидиоза - это процесс применения методов сохранения и изучения простейших организмов, вызывающих кокцидиоз.

Простейшие фиксируются в каловых массах консервирующим раствором, поэтому морфологические признаки простейших длительное время остаются без изменений.

Простейшие кокцидии являются небольшими паразитическими организмами, которые могут вызывать заболевания у животных и человека [18].

Необходимость в консервации простейших возникает при заборе материала у больных в сельской местности, на дому, при удаленности лаборатории от стационара или невозможности срочного исследования, направления материала на консультацию и т.д.

Консервант можно заранее разлить во флаконы и передать в лечебные учреждения для последующего сбора фекалий. К недостаткам относятся потеря подвижности и определенная деформация простейших, что заметно затрудняет диагностику. Поэтому сбор фекалий в консервант не может заменить исследование нативных препаратов.

* Консервант Барроу: используют тогда, когда материал должен храниться до исследования более 1 мес. Реактивы: а) консервирующий раствор (0,7 мл хлорида натрия, 5 мл концентрированного формалина, 12,5 мл этилового спирта 96 %, 2 г кристаллического фенола, 100 мл дистиллированной воды); б) красящий раствор (0,01 % раствор тионина или азура). Консервант Барроу используют в тех случаях, когда исследование консервированного материала осуществляют на протяжении месяца [17].

* Консервант Сафаралиева (1,65 сульфата цинка, 10 мл консервированного формалина, 2,5 г кристаллического фенола, 5 мл концентрированной уксусной кислоты, 0,2 г метиленового синего, 100 мл дистиллированной воды). Консервант Сафаралиева применяют тогда, когда консервированный материал должен храниться для исследования более месяца.

Методика обнаружения простейших методом консервации

Консервант разливают во флаконы от пенициллина примерно до половины их объема. Исследуемый материал от каждого больного немедленно после взятия переносят во флаконы в количестве, соответствующем примерно 1/3 объема консерванта. С помощью палочки готовят эмульсию кала. Флакон закрывают резиновой пробкой, которую закрепляют липкой лентой. На каждом флаконе должна быть этикетка, содержащая данные об обследуемом [12].

Перед исследованием консервированный материал не перемешивают. Каплю придонного осадка переносят пипеткой на предметное стекло и тщательно размешивают стеклянной или деревянной палочкой до получения эмульсии. Если материал был собран в консервант Барроу, добавляют каплю красителя. После этого препарат накрывают покровным стеклом и просматривают при большом увеличении микроскопа. В отдельных случаях целесообразно использовать масляную иммерсию.

Оценка результатов исследования

Просматривают два-три препарата, отмечая всех обнаруженных простейших. Дифференцировать их следует по тем же признакам, которые были описаны для препарата, окрашенного раствором Люголя. Следует, однако, учитывать, что, в отличие от раствора Люголя, красители, применяемые в консервантах, не окрашивают гликоген, но позволяют выявить хроматиновые тела. Структуры простейших в консервантах окрашиваются красителем в синий цвет [23].

Консервант Турдыева (1966)

водный раствор нитрита натрия (0,2 %) 80 мл

раствор Люголя 8 мл

формалин концентрированный 10 мл

* глицерин 2 мл

* уксусная кислота крепкая 5 капель

Раствор Люголя готовят, растворяя в 250 мл дистиллированной воды 10 г йодида калия и 5 г кристаллического йода.

Консервант отличается от предыдущих тем, что простейшие в нем не окрашиваются и не теряют блеска. Материал из консерванта Турдыева при необходимости можно обработать раствором Люголя по общепринятой методике. Простейшие сохраняются несколько месяцев.

Ход обнаружения простейших. Консервант разливают в пенициллиновые флаконы примерно до половины их объема. Исследуемый материал от каждого больного немедленно после взятия переносят во флакон в количестве, соответствующем примерно 1/3 взятого консерванта. При помощи палочки готовят эмульсию фекалий. Флакон закрывают резиновой пробкой, которую закрепляют липкой лентой. На флаконе надписывают его порядковый номер, а все сведении о больном указывают в направлении, прилагаемом к флакону [12].

Перед исследованием консервированный материал не следует перемешивать. Каплю придонного осадка пипеткой переносят на предметное стекло и тщательно растирают стеклянной или деревянной палочкой до получения равномерной эмульсии. Если материал был собран в консервант Барроу, то добавляют каплю красящего вещества. После этого каплю накрывают покровным стеклом и просматривают под средним увеличением микроскопа. В отдельных случаях целесообразно использовать масляную иммерсию.

Оценка результатов. Просматривают 2-3 препарата, отмечая всех замеченных простейших. Дифференциальный диагноз проводят так же, как в мазке при окраске раствором Люголя. Однако в данном случае красители не окрашивают гликоген и, напротив, позволяют выявить хроматоидные тела. Структуры окрашиваются в синий цвет (за исключением консерванта Турдыева). Внутренняя структура ооцисты кокцидии в консервирующем растворе становится неразличимой, поэтому их определяют по густому слою ресничек по периферии клеток [23].

При отрицательном результате исследования консервированного материала рекомендуют 1-1,5 мл его поместить в центрифужную пробирку, добавить 2/3 объема воды и 1/3 объема эфира и центрифугировать 3 мин при 1500 об/мин. Осадок микроскопируют.

Лаборант должен учитывать особенности изменения морфологии простейших в указанных консервантах в зависимости от сроков хранения материала.

При хранении материала в течение 1 суток вегетативные формы и цисты простейших сохраняются хорошо во всех консервантах. Ооцисты сохраняются достаточно хорошо во всех консервантах.

При хранении материала от 10 дней до 1 года ооцисты простейших сохраняются во всех консервантах. Ооцисты кокцидии лучше сохраняются в консерванте Турдыева.

Таким образом, при кратковременном хранении материала пригодны все консерванты, но несколько предпочтительней консерват Турдыева, особенно для сохранения вегетативной формы простейшего. Для длительного хранения материала рекомендуются консервант Сафаралиева.

При использовании консерванта Сафаралиева цитоплазма кокцидии окрашивается в бледно-синий цвет, хроматин ядра -- в интенсивно-синий. Подкрашивание мазка испражнений значительно облегчает дифференцировку ооцист от других простейших кишечника [18].

Ооцисты кокцидии могут выделяться в периоды ремиссии заболевания или здоровыми выделителями, т. е. они могут быть признаком только носительства. Поэтому при подозрении на возможность заболевания кокцидиозом проводят многократные исследования [17].

При этом исследуют в первую очередь патологические примеси (комочки слизи). Обнаружение в испражнениях эритрофагов указывает на активность процесса или наличие распространенного поражения толстой кишки.

2.1.3 Метод Фюллеборна

Метод Фюллеборна является одним из эффективных способов диагностики кокцидиоза у людей.

В основе метода Фюллеборна (всплывания) лежит разность удельного веса флотационного раствора и ооцист простейших, удельный вес флотационного раствора выше, в результате ооцисты простейших всплывают на поверхность жидкости и обнаруживаются в поверхностной плёнке.

Анализ кала методом Фюллеборна (или методом тройной пробы) - это лабораторное исследование испражнений на наличие глистовых инвазий (гельминтов) и простейших микроорганизмов.

Метод основан на анализе трёх образцов кала, взятых в течение трех последовательных дней и подвергнутых специальной обработке в лаборатории. Как правило, такой анализ назначают в случае подозрения на инвазию гельминтами или другими паразитами кишечника, так как многие инвазии могут протекать без явных симптомов и могут быть выявлены только при лабораторном обследовании [25].

Результаты анализа помогают врачу определить тип паразита, выделить его количество и расположение в кишечнике, установить эффективность проводимого лечения и мониторить его динамику [23].

Ход исследования:

Необходимые реактивы и оборудование: один из флотационных растворов, ареометр, проволочная петля (из нескольких круглых петель диаметром от 0,5 до 1 см), предметные стёкла (обезжиренные), пипетки стеклянные, химические стаканчики ёмкостью 30-50 мл, кюветы эмалированные, чашки Петри, стеклянные или деревянные палочки, спиртовка [24].

Подготовка к работе

Приготовление флотационного раствора по методу Фюллеборна.

Насыщенный раствор хлорида натрия NaCI (поваренной соли) с плотностью 1,18-1.2 (предложенный автором Фюллеборном) готовят из расчёта 400-420 г соли на 1л кипящей воды [11].

Раствор хлорида натрия NaCI растворяют в горячей воде в эмалированной посуде, причём кладут соль в ёмкость с горячей водой порциями при подогревании на плите и постоянном перемешивании до полного растворения [15].

Удельный вес флотационного раствора измеряется ареометром только после остывания раствора при комнатной температуре. Измерение удельного веса флотационного раствора ареометром строго обязательно, т.к. приготовление раствора по прописи не гарантирует получение нужного удельного веса (например, когда используемая соль недостаточно химически чистая).

Фильтровать приготовленный раствор не обязательно. Если раствор приготовлен в большом количестве, то в последующие дни перед исследованием его подогревают с размешиванием осадка и после остывания раствора снова измеряют ареометром удельный вес [13].

Подготовка предметных стёкол: предметные стёкла обязательно обезжирить, например в смеси Никифорова (равные части этилового спирта и эфира). В химический стаканчик объёмом 30-50 мл налить немного флотационного раствора (стаканчик лучше предварительно поставить в чашку Петри). Поместить в стаканчик 2,5 г фекалий (объём с большой "боб").

Тщательно размешать палочкой (индивидуальной для каждого обследуемого). Удалить сразу же после размешивания всплывшие крупные частицы палочкой (или ложечкой с дырочками). Одновременно добавлять постепенно солевой раствор до 50 мл.

При снятии поверхностной плёнки предметным стеклом, стекло должно соприкасаться с жидкостью, поэтому стаканчик накрывается предметным стеклом, а флотационный раствор добавляется пипеткой до полного соприкосновения с предметным стеклом. Оставить взвесь на несколько минут, экспозиция зависит от того какой флотационный раствор применяется: при применении прописи № 1 и 5 - экспозиция 30-60
мин; № 2, 3, 4 -30 мин [12].

После вышеуказанной экспозиции сныть предметное стекло с химического стаканчика, перевернув кверху ту его поверхность, которой оно соприкасалось с жидкостью, и положить сухой поверхностью на стекло большого размера.

Микроскопировать без покровного стекла при увеличении: объектив х 8, х 10, окуляр х 7, х 10, уточнение морфологического строения - окуляр х 40.

При снятии поверхностной плёнки проволочной петлёй (лучше использовать петли с несколькими ячейками) целесообразно исследовать не менее 8 капель. Микроскопировать под покровным стеклом (можно и без покровного стекла, предварительно на предметное стекло нанеся каплю глицерина, в которой размывают каплю с петли). Петли перед и после исследования обжигать на пламени спиртовой горелки [13].

Примечание: целесообразнее использовать для снятия плёнки предметные стёкла, т.к. это наиболее просто в применении и площадь снятия поверхностной плёнки значительно увеличивается.

Эффективность метода. Наиболее эффективны методы флотации для обнаружения ооцист простейших и яиц нематод, цестод.

Культуральный и иммунологический методы в диагностике кокцидиоза не применяются



Заключение

В результате проведенной работы на тему «Лабораторные методы диагностики кокцидиоза» пришли к следующим заключениям:

Кокцидиоз -- болезнь, вызываемая присутствием в тонком кишечнике человека ооцист кокцидий. Кокцидиоз выявляется довольно редко в виде спорадических случаев, но инфицированность населения при этом в сельских районах может составлять 3-4% от всего населения.

Серьёзную опасность кокцидиоз представляет для пациентов со сниженным иммунитетом или поражённых ВИЧ-инфекцией, так как в этих случаях может перетекать в хроническую форму.

Как показывает статистика, уровень его распространенности в развитых странах составляет примерно 1-3%, а в странах с низким уровнем санитарной культуры превышает 5%. В основной группе риска по заражению и в том и в другом случае находятся дети младше 5 лет и иммунокомпрометированные лица.

Человека может поражать только кокцидия двух видов: Isospora belli или Isospora hominis. Большое значение в заражении человека могут играть домашние животные, при одновременном несоблюдении правил личной гигиены. Человек становится хозяином паразита при заглатывании с продуктами или водой ооцист, которые впоследствии начинают выделяться с испражнениями заболевшего кокцидиозом. На протяжении нескольких суток кокцидия созревает в условиях почвы.

В полости кишечника в человеческом организме происходит выход спорозоитов из ооцист. Далее они проникают в эпителиальную ткань с её последующим разрушением. Развивается воспалительный процесс, в некоторых случаях формируются язвенные поверхности. Наблюдается лихорадка с повышением температуры до 39°C, общая слабость, отсутствие аппетита, расстройство стула, апатия, сонливость.

Заболевание (кокцидиоз) может продолжаться несколько недель, либо до 1 месяца. Переболевший кокцидиозом человек ещё на протяжении месяца может выделять с фекалиями ооцисты кокцидии. Повторно человек, перенесший определенный вид кокцидиоза, заболеть не может.

Профилактика такая же, как и при других кишечных инвазиях, например, амебиазе, лямблиозе, и направлена на выявление и лечение больных, а также пресечение путей передачи возбудителей. Специфическая профилактика не разработана.

Человек может обезопасить себя от заражения кокцидиозом простым соблюдением санитарно-гигиенических норм. Кокцидии от домашних животных не могут передаваться человеку, однако соблюдение элементарных гигиенических правил при содержании животного является обязательным.

Методы лабораторной диагностики паразитарных заболеваний применяются: с диагностической целью; для контроля эффективности лечения паразитарных заболеваний; для оценки качества проведения комплекса противопаразитарных мероприятий; с целью выявления источников заражения; для установления уровня пораженности населения [6].

Диагноз кокцидиоз подтверждают следующими методами:

- паразитологический: исследуют кал, гной, забранные с поверхности язв при ректороманоскопии, из патологических очагов другой локализации методом нативного мазка кала;

- мазок кала окрашенным раствором Люголя;

- метод Фюллеборна (флотации);

Иммунологический и культуральный методы в практической работе не применяются [11].

В сложившихся условиях особое значение имеют паразитологические (и шире - копроскопические в целом) методы диагностирования кишечных протозоонозов. Приготовлением препаратов для микроскопии, а также самой копроскопией, занимаются в преобладающем количестве исследований средние медицинские работники КДЛ (в отдельных ЛПУ до 100% исследований).

При копроскопическом исследовании просматривают два-три препарата, отмечая всех обнаруженных простейших. В сомнительных случаях, а также при получении отрицательного результата исследование повторяют -- на протяжении одной-двух недель делают три анализа. Метод позволяет выявить в материале как вегетативные, так и цистные стадии простейших, паразитирующих в кишечнике. Обнаружение у обследуемого ооцист кокцидий позволяет безошибочно поставить диагноз кокцидиоза. При появлении жидкого стула, иногда с примесью небольшого количества слизи, обнаруживаются ооцисты кокцидий в нативных мазках кала, и окрашенных раствором Люголя. Так как ооцисты почти прозрачные, их легче заметить при опущенном конденсоре и полузакрытой диафрагме. Поскольку паразитов в кале всегда мало, и они обнаруживаются с трудом, следует исследовать серию проб фекалий, просматривая в каждой по 8-10препаратов и не менее 100 полей зрения в каждом из них [7].

Для повышения эффективности диагностики рекомендуется также проводить флотацию исследуемого материала в насыщенном растворе поваренной соли по методу Фюллеборна. Большое значение имеет качество приготовления растворов для флотации. Если раствор приготовлен в большом количестве с неправильной концентрацией, то в последующие дни перед исследованием его перемешивают и после раствор измеряют ареометром удельный вес. Уже на этом этапе могут появится методические ошибки, приводящие к неизбежной гиподиагностике. Выход можно найти в использовании седиментационных растворов, состоящих из нескольких ингредиентов, каждый из которых выполняет определенную функцию, замедляет время кристаллизации капли на предметном стекле, удешевляет стоимость проводимого анализа, уменьшает удельную плотность смеси.



Список использованных источников

1. Беляев С.А. Микробиология: Учебное пособие / С.А. Беляев. СПб.: Лань П, 2018. 496 c.

2. Белясова Н.А. Микробиология: Учебник / Н.А. Белясова. Мн.: Вышэйшая шк., 2022. 443 c.

3. Блинов, Л.Н. Микробиология и иммунология: Учебное пособие / Л.Н. Блинов, И.Л. Перфилова и др. СПб.: Лань, 2023. 240 c.

4. Борисов Л.Б. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология / Л.Б. Борисов. М.: МИА, 2021. 736 c.

5. Волина Е.Г. Частная микробиология: Учебное пособие / Е.Г. Волина, Л.Е. Саруханова. М.: РУДН, 2018. 222 c.

6. Госманов Р.Г. Санитарная микробиология: Учебное пособие / Р.Г. Госманов, А.Х. Волков, А.К. Галиуллин, А.И. Ибрагимова. СПб.: Лань, 2018. 260 c.

7. Госманов Р.Г. Микробиология и иммунология: Учебное пособие / Р.Г. Госманов, А.И. Ибрагимова, А.К. Галиуллин. СПб.: Лань, 2021. 240c.

8. Госманов Р.Г. Санитарная микробиология пищевых продуктов: Учебное пособие / Р.Г. Госманов, Н.М. Колычев и др. СПб.: Лань, 2019. 560 c.

9. Госманов Р.Г. Микробиология: Учебное пособие / Р.Г. Госманов, А.К. Галиуллин, А.Х. Волков. СПб.: Лань, 2021. 496 c.

10. Джей Д.М. Современная пищевая микробиология / Д.М. Джей. М.: Бином, 2022. 886 c.

11. Джей Дж. Современная пищевая микробиология. / Дж. Джей, М. Лесснер. М.: Бином. Лаборатория знаний, 2021. 886 c.

12. Донецкая, Э. Г.-А. Клиническая микробиология: руководство для специалистов клинической лабораторной диагностики / Донецкая Э. Г.-А. Москва: ГЭОТАР-Медиа, 2021 - 474 с.

13. Донецкая Э.Г. Клиническая микробиология: Руководство для специалистов клинической лабораторной диангостики / Э.Г. Донецкая. М.: ГЭОТАР-Медиа, 2021. 480 c.

13. Ившина И.Б. Большой практикум. Микробиология: Учебное пособие / И.Б. Ившина. СПб.: Проспект Науки, 2019. 112 c.

14. Кишкун А. А. Клиническая лабораторная диагностика: учебное пособие для студентов высшего проф. образования по дисциплине "Клиническая лабораторная диагностика" / А. А. Кишкун. 2-е изд., перераб. и доп. Москва: ГЭОТАР-Медиа, 2019. 1000 с.

15. Кисленко В.Н. Пищевая микробиология: микробиологическая безопасность сырья и продуктов животного и растительного происхождения: Учебник / В.Н. Кисленко, Т.И. Дячук. М.: Инфра-М, 2021. 81 c.

16. Клическая лабораторная диагностика: методы и трактовка лабораторных исследований / под ред. В. С. Камышникова. М.: МЕДпресс-информ, 2020. 720 с.

17. Королев А.А. Микробиология, физиология питания, санитария и гигиена: В 2 ч. Ч. 1: Учебник / А.А. Королев. М.: Академия, 2018. 288 c.

18. Коротяев А.И. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология: Учебник для медицинских вузов / А.И. Коротяев, С.А. Бабичев. СПб.: СпецЛит, 2019. 760 c.

19. Мартинчик А.Н. Микробиология, физиология питания, санитария: Учебник для студентов сред. проф. учебных заведений / А.Н. Мартинчик, А.А. Королев, Ю.В. Несвижский. М.: ИЦ Академия, 2019. 352 c.

20. Методы клинических лабораторных исследований / под ред. В. С. Камышникова. 8-е изд. М.: МЕДпресс-информ, 2019. 736 с.

22. Нетрусов, А.И. Микробиология / А.И. Нетрусов. М.: Academia, 2020. 192 c.

23. ПЦР в реальном времени / под редакцией доктора биологических наук Д. В. Ребрикова. 9-е изд. М.: Лаборатория знаний, 2021. 224 с.

24. Рубина, Е.А. Микробиология, физиология питания, санитария: Учебное пособие / Е.А. Рубина, В.Ф. Малыгина. М.: Форум, НИЦ Инфра-М, 2013. 240 c.

25. Хиггинс, К. Расшифровка клинических лабораторных анализов / К. Хиггинс; перевод с английского Е. К. Вишневской ; под редакцией профессора В. Л. Эмануэля. 7-е изд. Москва: Лаборатория знаний, 2019. 592 с.9999

Размещено на Allbest.ru

...