Вивчення особливостей взаємодії іонів перехідних металів з нуклеїновими кислотами, що знаходяться на різних рівнях структурної організації

Размещено на http://www.allbest.ru/

МІНІСТЕРСТВО ОСВІТИ УКРАЇНИ

ХАРКІВСЬКИЙ ДЕРЖАВНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

ВИВЧЕННЯ ОСОБЛИВОСТЕЙ ВЗАЄМОДІЇ ІОНІВ ПЕРЕХІДНИХ МЕТАЛІВ З НУКЛЕЇНОВИМИ КИСЛОТАМИ, ЩО ЗНАХОДЯТЬСЯ НА РІЗНИХ РІВНЯХ СТРУКТУРНОЇ ОРГАНІЗАЦІЇ

03.00.02 - біофізика

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата фізико-математичних наук

Cиса Ірина Василівна

ХАРКІВ - 199

АНОТАЦІЯ

Сиса І.В. Вивчення особливостей взаємодії іонів перехідних металів з нуклеїновими кислотами, що знаходяться на різних рівнях структурної організації. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата фізико-математичних наук за спеціальністю 03.00.02 - біофізика.- Харківський державний університет, Харків, 1999.

Проведено експериментальне дослідження комплексоутворення іонів перехідних металів з рібо- і дезоксирібонуклеотидами усіх канонічних основ і природної ДНК у водних розчинах. Виміряно диференційні УФ-спектри металокомплексів, що дозволило визначити гетероатоми основ, які координують іони, а також розрахувати відповідні константи зв'язування. Встановлено, що відмінності в комплексоутворенні вивчених іонів з ДНК визначаються відмінностями в зв'язуванні, що проявляються вже на мономерному рівні. Різниця у вільній енергії зв'язування іонів перехідних металів з GMP визначається відмінністю їх іонних радіусів. В широкому інтервалі вмісту іонів металу одержано концентраційні залежності зміни температури і інтервалу плавлення ДНК в присутності іонів Ag⁺, що дозволило вперше зареєструвати методом термічної денатурації утворення сріблом двох різних типів комплексів. Запропоновано альтернативну існуючим модель “слабкого” комплексу, яка припускає утворення хугстинівських GC-пар.

Ключові слова: іони перехідних металів, ДНК, нуклеотид, металокомплекс, диференціний УФ-спектр, термічна денатурація.

АННОТАЦИЯ

Сыса И.В. Исследование особенностей взаимодействия ионов переходных металлов с нуклеиновыми кислотами, находящимися на различных уровнях структурной организации.- Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук по специальности 03.00.02 - биофизика.- Харьковский государственный университет, Харьков, 1999.

Проведено экспериментальное исследование комплексообразования ионов переходных металлов с рибо- и дезоксирибонуклеотидами всех канонических оснований и природной ДНК в водных растворах. Измерены дифференциальные УФ-спектры металлокомплексов, что позволило определить гетероатомы оснований, координирующие ионы, а также рассчитать соответствующие константы связывания. Различия в комлексообразовании изученных ионов с ДНК определяются различиями в связывании, проявляющимися уже на мономерном уровне. Различия в свободной энергии связывания ионов переходных металлов с GMP определяются различием их ионных радиусов. В широком интервале содержания ионов металла получены концентрационные зависимости изменения температуры и интервала плавления ДНК в присутствии ионов Ag⁺, что позволило впервые зарегистрировать методом термической денатурации образование серебром двух различных типов комплексов. Предложена альтернативная существующим модель “слабого” комплекса, предполагающая образование хугстиновских GC-пар.

Ключевые слова: ионы переходных металлов, ДНК, нуклеотид, металлокомплекс, диференциальный УФ-спектр, термическая денатурация.

SUMMARY

Sysa I.V. Studies on peculiarities of transition metal ions interaction with nucleic acids of different levels of structural organization. - Manuscript.

Thesis for candidate's degree by specialty 03.00.02 - biophysics. - Kharkov State University, Kharkov, 1999.

The interest in metal complexes of nucleic acids is first of all stimulated by the importance of metal ions to the functions of native polynucleitides. For example these ions influence the synthesis rate and accuracy of the nucleotide sequence in DNA- and RNA-polymerase system, participate in the formation of protein-nucleotide complexes, and cause mutagenesis and carcinogenesis. Molecular mechanisms of metal toxicity affecting living organisms have recently become even more topical in the context of general environmental contamination. Therefore, the basic problem is to model real structure of metal complexes, and thus to find the molecular mechanisms of the biological action of metal ions as well as to assign the heteroatoms of nucleic acid bases which coordinate the ions.

The information on this subject is ample, but in the case of aqueous solutions, it is unambiguous only for complexes, including phosphates, N7 of purines and N3 of cytosine. Weaker interactions are disputable even at monomeric level. Interpretation of the experimental evidence obtained for polynucleotides is naturally even more complex.

The present study is devoted to experimental investigation of transition metal ion complexes formation with ribo- and deoxyribonucleotides of all canonical bases and natural DNA in aqueous solutions. Differential UV spectra were measured, the analysis of the shapes of which allowed us to determine heteroatoms of the bases, coordinating ions, and to calculate corresponding binding constants.

In accordance with known experimental data mainly obtained in systems having lowered water activity, the main atom of purine nucleotide bases, coordinating ions studied, in water solution is N7. Besides, peculiarities in the difference spectra permit to assume ion interaction with carbonilyc oxygens of guanine derivatives which more distinct in the case of Ag⁺, Cu²⁺ and Co²⁺. Differences in the ions complex formation with DNA determined by differences in binding showing already in monomeric level. Differences in the free energy of transition metal ions binding to GMP is caused by differences in their ion radii.

Concentration dependencies of change in temperature and interval of DNA melting in the presence of Ag⁺ were obtained in wide range of the metal ion content. This permitted to register first the formation of two different silver complexes, by the thermal denaturation method. An alternative model of a weak complex is proposed, supporting the formation of Hoogsteen GC-pairs.

Key words: transition metal ions, DNA, nucleotide, differential UV spectra, thermal denaturation.

іон метал дезоксирібонуклеотид

1. ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Однією з найважливіших задач біофізики і фізики біополімерів є з'ясування молекулярних механізмів, що лежать в основі їх функціонування. В зв'язку з цим встановлення фізичної природи особливостей взаємодії іонів металів з нуклеїновими кислотами (НК) становить великий інтерес. Цей інтерес зумовлений, у всякому разі, такими основними біологічними ефектами: участю іонів двовалентних металів в біологічних процесах, які утягують НК (наприклад, переносі генетичної інформації); негативним впливом іонів металів на функціонування живих організмів; антипухлинною активністю деяких сполук металів, що інгібірують синтез ДНК; використанням металів як зондів для координаційної хімії нуклеїнових кислот.

Актуальність вивчення металокомплексів в останній час ще більше зросла у зв'язку з різким погіршенням стану навколишнього середовища, викликаним, зокрема, забрудненням води, грунту, рослин, і, отже, продуктів харчування солями різних металів. Особливо це стосується іонів перехідних металів (ПМ), зокрема, іонів Ni²⁺, Cd²⁺, Ag⁺, які мають великі канцерогенну та мутагенну активності. Незважаючи на те, що існує значна кількість експериментальних та теоретичних робіт, присвячених металокомплексам НК, молекулярні механізми зумовлених іонами біологічних процесів все ще не встановлені, що робить необхідним вивчення взіємодії іонів з НК, які знаходяться на різних рівнях структурної організації.

Зв'язок роботи с науковими програмами, планами, темами. Дисертация виконувалась у відповідності з планом науково-дослідних робіт відділу молекулярної біофізики ФТІНТ НАН України по темі “Дослідження структурних та фізико-хімічних властивостей комплексів нуклеїнових кислот з білками та біологічно активними речовинами” (шифр теми 1.4.10.18.2), а також в рамках виконання проекту Державного фонду фундаментальних досліджень “Кооперативні явища, конформаційні та фазові переходи в низьковимірних макромолекулах біологічного походження” (номер проекту 2.2/159), проектів Міжнародного наукового фонду, грант U 23000-U 23200 “Divalent Metal Ions Interaction with Nucleic Acids. Role of Water and Cooperative Effects” по програмі “Long-Term Research Grants Program”.

Мета і задачі дослідження. Метою даної роботи було встановлення природи відмінностей у зв'язуванні іонів перехідних металів з НК, з'ясування причини різного впливу іонів цих металів на конформаційний стан ДНК, а також виявлення впливу різних рівней структурної організації НК на зв'язування з іонами перехідних металів.

В зв'язку з вказаною вище метою було поставлено такі задачі:

Визначити атоми, які координують іони Cu²⁺, Co²⁺ і Zn²⁺ в GMP, а також іони Ni²⁺, Cd²⁺ і Ag⁺ в рібо- і дезоксирібонуклеотидах усіх канонічних основ (r,dGMP; r,dAMP; r,dCMP; UMP і dTMP) та природної ДНК.

Визначити конформаційні перетворення в природній ДНК, індуктовані цими іонами.

Розрахувати константи зв'язування іонів перехідних металів з активними центрами основ ДНК, а також r- и d-нуклеотидів.

З'ясувати природу відмінностей в зв'язуванні іонів, які мають різну електронну структуру, з нуклеотидами і ДНК.

Наукова новизна одержаних результатів. Визначені гетероатоми основ ДНК і окремих d- і r-нуклеотидів, які координують іони Ni²⁺, Cd²⁺ і Ag⁺, а також Cu²⁺, Co²⁺ і Zn²⁺ (тільки з GMP) у водних розчинах, знайдені раніше, в основному, для систем із зниженою активністю води. Для d-нуклеотидів ця інформація одержана вперше.

Одержані значення констант зв'язування цих іонів з нуклеотидами і ДНК в широкому диапазоні концентрацій іонів металів. Для комплексів ДНК з іонами Ni²⁺ і Cd²⁺ , а також r- и d-нуклеотидів з іонами Ag⁺ ці дані одержані вперше.

Встановлено, що відмінності в комплексоутворенні вивчених іонів з ДНК визначаються відмінностями в зв'язуванні, що проявляються вже на мономерному рівні.

Показано, що відмінності в вільній енергії зв'язування іонів ПМ з GMP визначаються відмінністю їх іонних радіусів.

В більш широкому, ніж раніше, інтервалі вмісту іонів металу одержані концентраційні залежності зміни температури і інтервалу плавлення ДНК в присутності іонів Ag⁺, що дозволило вперше зареєструвати методом термічної денатурації утворення сріблом двох різних типів комплексів.

На основі одержаних даних вперше запропановано альтернативну існуючим модель “слабкого” комплексу, яка припускає утворення хугстинівських GC-пар.

Практичне значення одержаних результатів полягає в тому, що експериментальні дані про місця координації вивчених іонів ПМ на ДНК і її мономерах, закономірності в характері зв'язування цих іонів, структурні переходи, індуктовані ними в ДНК можуть бути використані при з'ясуванні молекулярних механізмів регуляторної ролі іонів у функціонуванні (або його порушенні) генетичного апарату у про- і еукаріотів.

Одержані результати становлять інтерес для вирішення задач, пов'язаних з прогнозуванням екологічних наслідків зараження навколишнього середовища солями металів. Зокрема, виявлене велике значення констант зв'язування іонів ПМ з основами ДНК показує, що модифікуюча дія іонів на ДНК може здійснюватися ними при концентраціях, відповідних сучасному рівню забруднення навколишнього середовища.

Виміряні в цій роботі диференційні УФ-спектри (ДУФС) металокомплексів різного нуклеотидного складу можуть бути використані для визначення центрів зв'язування інших, ще не вивчених металів.

Особистий внесок здобувача. В опублікованих з співавторами наукових роботах особистий внесок здобувача полягає:

в роботах [1,2,4] - в участі у постановці задачі експерименту, одержанні експериментальних ДУФС ДНК, r- и d-нуклеотидів в присутності іонів Ni²⁺, Cd²⁺ і Ag⁺, їх обробці і аналізі, розрахунку констант зв'язування, а також інтерпретації одержаних даних;

в роботах [3,5,6,7] - в підборі, обробці і аналізі літературних даних, а також проведенні спектрофотометричних вимірювань. Автору належить весь об'єм робіт, пов'язаний з числовою обробкою даних і аналізом одержаних результатів.

Апробація результатів дисертації. Матеріали роботи по темі дисертації доповідались і обговорювались на:

3rd European Conference on Bio-Inorganic Chemistry, Noordwijkerhout, The Netherlands, August 4-10, 1996.

XXIII European Congress on Molecular Spectroscopy, Balatonfured, Hungary, August 25-30, 1996.

VII European Conference on Spectroscopy of Biological Molecules, San Lorenzo de El Escorial, Madrid, Spain, September 7-12, 1997.

7th Intern. Symp. on Macromolecule-Metal Complexes, Nordwijkerhout, The Netherlands, October 6-10, 1997.

II з'їзді Українського биофізичного товариства, Харків, 29 червня-3 липня 1998.

XXXIII International Conference on Coordination Chemistry, Florence, Italy, 1998.

XII Round Table “Nucleosides, Nucleotides and their Biological Application”, Montpellier, France, September 6-10, 1998.

Публікації. Результати дисертації опубліковано в 7 наукових роботах, в тому числі в 3 статтях у наукових журналах і в 3 тезах та 1 трудах конференцій.

Структура й обсяг дисертації. Дисертація складається із вступу, чотирьох розділів, висновків, додатку і списку використаних літературних джерел (155 найменувань). Повний обсяг дисертації складає 164 сторінки, з них додаток займає 4 стор., список використаних літературних джерел - 17 стор., ілюстрації - 13 стор.

2. ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

У вступі обгрунтовано актуальність обраної теми, сформульовано мету і задачі дослідження, наведено загальну характеристику дисертації.

Розділ 1 містить огляд літератури, присвячений сучасному теоретичному і експериментальному дослідженню комплексів іонів ПМ з нуклеїновими кислотами різного рівня структурної організації. Наводяться способи теоретичного опису взаємодії нуклеїнових кислот з низькомолекулярними лігандами, які в подальшому використовувались в роботі при визначенні параметрів зв'язування іонів з ДНК і нуклеотидами, а також підходи, які дозволяють теоретично описувати експериментальні дані з плавлення комплексів ДНК з іонами металів.

Детально проаналізована існуюча інформація про місця координації ионів ПМ в нуклеозидах, нуклеотидах, гомополінуклеотидах і ДНК, про вплив іонов цих металів на її конформаційні зміни, а також дані про термодинамічні характеристики комплексів іонів металів с НК. Показано, що незважаючи на велику кількість експериментальних робіт, відмінність объектів дослідження, методів і, головне, умов вимірювань призвело до того, що навіть в разі нуклеотидів не існує однозначної інформації про місця координації іонів металів, тоді як вона конче необхідна при побудові реальної структури металокомплексів ДНК. Большість наявних даних одержано в кристалах або в системах, які містять сорозчинники, проте у водному розчині ситуація може виявитися іншою і потребує подальшого вивчення.

В Розділі 2 подано загальну характеристику матеріалів та методів дослідження.

Об'єктом дослідження були 2'-дезоксинуклеозид-5'-фосфати (Na_adGMP, Na_adTMP, dAMP, dCMP) та їх рібоаналоги (Na_aGMP, Na_aUMP, Na_aAMP, Na_aCMP), а також ДНК тимуса теляти ([GC]41%) і калієва сіль полі C (“Serva”, Німеччина).

ДНК, нуклеотиди, AgNO₃ і хлориди Cu, Co, Zn, Ni, Cd розчиняли в ацетатному буфері (рН 6, [Na⁺] = 10^-30,1 M). При вимірюванні ДУФС концентрація НК (Р) становила (10,1)10^-4 М; в експериментах по плавленню Р = (6,50,5)10^-5 М. Похибка у визначенні концентрації Р і іонів металів становила 0,3 та 0,5% відповідно.

Експериментальні методи: 1) диференційна ультрафіолетова спектроскопія (ДУФС); 2) термічна денатурація. Метод ДУФС має високу чутливість до зміни поглинання (10^-4 о.е./мм при використанні спектрофотометра Specord M 40, Carl Zeiss Jena (Німеччина)), що дозволяє використовувати розведені розчини, зводячи до мінімуму спотворюючу дію агрегації, а також збільшити діапазон вивчаємих концентрацій іонів. Форма ДУФС залежить не тільки від природи зв'язуючої основи, але й природи зв'язуючих атомів. Метод ідентифікації зв'язуючих центрів засновано на порівнянні форми ДУФС металокомплексів мономерів з формою диференційних спектрів, зумовлених протонуванням (Благой, 1991), оскільки для протонів іонизовані атоми визначені з високим ступенем надійності. Експериментальні ДУФС записували, використовуючи чотирьохкюветну схему вимірювання. Похибка в вимірюванні оптичної густини спектрофотометром становила 0,5%.

Плавлення ДНК здійснювали в герметичних кварцевих кюветах, розміщених в 2 ідентичних мідних блоках, розташованих в камері спектрофотометра Specord UV VIS фірми Carl Zeiss (Німеччина). Нагрів проводився зі швидкістю 1 град/хв. Абсолютна похибка в вимірюванні температури знаходилась в межах 0,5С.

Розділ 3 містить експериментальні ДУФС комплексів іонів ПМ з окремими r- і d-нуклеотидами, а також ДНК. На мал.1 як приклад показано спектри комплексів GMP+Cu²⁺. Хоча інтенсивність ДУФС металокомплексів суттєво менша, ніж ДУФС протонування, їх форма практично однакова у всій області . Ця обставина дозволяє зробити висновок про те, що місцем координації іонів також є N7.

Короткохвильова ізобестична точка на ДУФС, індуктованих іонами вивчених ПМ, зміщена в червону сторону порівняно з її положенням на ДУФС протонування N7 (мал.1, табл.1). Цей зсув є мінімальним для іонів Zn²⁺ і максимальним для іонів Ag⁺ і Cu²⁺. Причиною такого зміщення може бути взаємодія іонів з О6, яка викликає перехід гуаніну з кето- в єнольну форму. Згідно з теоретичними розрахунками (Matsuoka, 1984), кето-єнольний перехід гуанозину приводить до суттєво більшого, ніж протонування N7, батохромного зсуву короткохвильової смуги поглинання.

Мал.1. ДУФС GMP, індуктовані іонами Cu²⁺.

Цифри біля кривих - [Cu²⁺ ] x 10⁵ M. Пунктир - ДУФС, зумовлений протонуванням N7 GMP (Будовський, 1977). Його інтенсивність зменшено в 6 разів.

Таблиця 1

Різниці в положенні короткохвильової ізобестичної точки на ДУФС металокомплексів і протонування N7 GMP.

Аналогічним чином були визначені місця зв'язування іонів з нуклеотидами різної природи. Одержані результати підсумовані в табл. 2, згідно з якою: 1) поряд з сильним зв'язуванням іонів металів з N7 пуринів і N3 піримідинів, яке раніше було зареєстровано для окремих мономерів, в основному, в системах із зниженою активністю води, виявлено слабку взаємодію іонів з карбонільними киснями. В разі іонів Cu²⁺, Ag⁺ і Co²⁺ ця взаємодія виявляеться найбільш виразно (див. табл.1). 2) Іони Ni²⁺ і Cd²⁺ практично не зв'язуються з N3С не тільки окремих мономерів, але й полі С. 3) координуючі іони атоми в випадку r- і d-нуклеотидів однакові.

Таблиця 2

Гетероатоми основ, які координують іони металів в нуклеотидах і ДНК, визначені по даним цієї роботи

Атоми, визначені на основі різниці в ДУФ-спектрах нуклеотидів і протонування, відзначені дужками.

ДУФС, одержані для нуклеотидів, використовувались для аналізу структури комплексів іонів Ni²⁺, Cd²⁺ і Ag⁺ з ДНК. Для прикладу на мал.2 зображений диференційний спектр комплексу ДНК+Ni²⁺. Незважаючи на малу інтенсивність, на ДУФС ДНК+Ni²⁺ в діапазоні 510^-610^-3 М Ni²⁺ спостерігаються особливості, положення яких узгоджується з положенням максимумів на ДУФС іонів Ni²⁺, одержаних для дезоксинуклеотидів. Максимум (а) и плече (в) можуть бути приписані взаємодії Ni²⁺ відповідно з N7 dGMP і N7 dAMP. Оскільки подвійна спіраль в присутності іонів Ni²⁺ (і Cd²⁺) зберігається, можна припустити, що плече (б) зумовлене виникаючим в результаті взаємодії з N7G переносом протону від N1G до N3C в G-C-парах. Подібна форма ДУФС є характерною також для комплексів ДНК з іонами Cd²⁺ в діапазоні 310^-510^-3 М та іонами Ag⁺ (більш розмита) в області r=[Ag⁺]/P0,1 (мал.3), що свідчить про ідентичність структури цих металокомплексів в зазначенному діапазоні концентрацій. При r>0,1 іони Ag⁺ утворюють комплекс другого типу (“слабкий” комплекс), що супроводжується переходом ДНК в нову двохспіральну конформацію. Раніше припускалося, що “слабкий” комплекс являє собою місток типу N1G-Ag⁺-N3C, проте дані мал.3 показують, що більш переважним є комплекс типу N7G-Ag-N3C, який утворюється в результаті переходу гуанозину із анти- в сін-конформацію.

Мал.2. Порівняння ДУФС н-ДНК (1) і нуклеотидів (2,3), индуктованих іонами Ni²⁺. 1 - 210^-4 M Ni²⁺; 2 - dGMP+5,510^-3 M Ni²⁺; 3 - dAMP+2,510^-4 M Ni²⁺; 4 - спектр протонування dCMP. Його інтенсивність зменшено в 20 разів. 1 відноситься до лівої ординати, 2 - 4 -до правої.

Мал.3. ДУФС ДНК, індуктовані іонами Ag⁺.

1 - r = 0,03; 2 - 0,05; 3 - 0,075; 4 - 0,3; 5 - 0,4; 6 - 0,55; 7 - 0,75; а і б - ДУФС являють собою суму вкладів окремих мономерів при утворенні містка N7G-Ag-N3C (хугстинівська пара) і N1G-Ag⁺-N3C (уотсон-криківська пара).

Поворот навколо глікозидного зв'язку може бути характерним і для комплексів ДНК с іонами Ni²⁺ і Cd²⁺, проте утворення “слабкого” комплексу при цьому не відбувається із-за дуже слабкого зв'язування цих іонів з N3 dCMP (див. табл.2).

В цьому розділі подані також результати розрахунку констант зв'язування (К) іонів ПМ з нуклеотидами і ДНК (табл.3). При цьому було використано модель зв'язування Скетчарда:

r/A_f(n-r) = K (1а)

або

r/A_f(n-r) = K exp(-wr) = K(r ) (1б)

де r - відносна концентрація зв'язаних ланок, A_f - концентрація вільних іонів, K - константа зв'язування при r = 0, K(r ) - ефективна константа зв'язування, що характеризує рівновагу при кожному значенні r, w - енергія взаємодії іонів (в одиницях кТ).

Одержані дані дозволили зробити такі висновки 1) константа зв'язування іонів з похідними гуаніну максимальна, 2) при переході від нуклеотидів до двохспіральної ДНК константи зв'язування іонів зростають на 1-2 порядки, що зумовлено, певно, суперпозицією силових полів в регулярній структурі полімеру. 3) Рівень структурної організації НК впливає не тільки на величину К, але й на характер зв'язування іонів. Якщо взаємодія з окремими нуклеотидами є некооперативною, то зв'язування з ДНК може мати як негативну, так і позитивну кооперативність (мал.4). Перша - зумовлена дальнодією кулонівського відштовхування між іонами, зв'язаними з полімером, та іонами, які адсорбуються ним із розчину. Позитивна кооперативність утворення слабкого комплексу пов'язана з кооперативністю переходу ДНК в НДК, який викликається сріблом.

Таблиця 3

Константи зв'язування іонів металів з атомами основ нуклеотидів (10^-3 М Na⁺; pH 6; 214C) і природної ДНК (10^-2 М Na⁺; pH 6; 262C).

В квадратних дужках подані гетероатоми основ, зв'язування з якими відповідає одержаним значенням К; С - ступінь зв'язування.

Одержані значення констант зв'язування іонів ПМ з GMP відповідають послідовності Ірвінга-Вільямса: Co²⁺<Ni²⁺<Cu²⁺>Zn²⁺, характерній для комплексів іонів ПМ з речовинами різної природи.

З мал.5 видно, що залежності від 1/R є монотонно зростаючими функціями не тільки для іонів перехідних, але й лужно-земельних металів. Причому усередені ряду ці залежності для GMP і IMP в межах похибки є універсальними функціями оберненого радіусу. Це дозволило зробити висновок про те, що різниця в значеннях К іонів металів з цими нуклеотидами всередені кожної групи визначається не стільки електронною структурою іонів, скільки їх розмірами, і, як наслідок, поверхневою густиною заряду. Доводом на користь цього висновку є та обставина, що для переважної більшості металокомплексів при переході від іонів Cu²⁺ до іонів Zn²⁺ (див. табл.3) константа зв'язування зменшується таким чином, що її величина стає близькою до значення К для іонів Со²⁺. Очевидно, що причиною цього є близькість розмірів іонів Со²⁺ і Cu²⁺ (мал.5).

Мал.4. Залежність констант зв'язування іонів Ni²⁺, Cd²⁺ і Ag⁺ з ДНК (1-3) і іонів Ag⁺ з нуклеотидами (4 - dCMP; 5 - dAMP) від ступеню зв'язування (С) .

Мал.5. Залежність вільної енергії зв'язування (G) іонів металів від величини їх кристалографічного радіусу. G₀ -вільна енергія іонів Сu²⁺. , - Sigel et al., 1994; + - Trimm, Patel, 1979.

В розділі 4 викладено результати дослідження переходу спіраль-клубок ДНК в присутності іонів Ag⁺.

Вивчення впливу іонів срібла на параметри плавлення ДНК виконано в інтервалі r =01,5 при іонній силі 10^-2 М Na⁺. Початкове підвищення термостабільності (мал.6) відбувається в інтервалі r = 0-0,08. При подальшому збільшенні концентрації іонів величина T_m майже не змінюється. Починаючи з r = 0,12 відбувається подальше зростання температури плавлення ДНК.

Концентраційна залежність зміни інтервалу плавлення ДНК також виявляє дві суттєво різних ділянки (мал.6). В області малих концентрацій срібла спостерігається його розширення, проходження через максимум і потім зменшення до значення 7-8С, яке зберігається в інтервалі r = 0,1-0,14. При r > 0,14 інтервал плавлення знов починає зростати. Таку поведінку параметрів переходу спіраль-клубок ДНК в присутності іонів Ag⁺ виявлено вперше.

Таким чином, згідно з даними мал.3, одержані результати з термічної денатурації також свідчать про наявність двох типів зв'язування. Суттєво, що “сильний” комплекс має меншу термостабільність, ніж “слабкий”. Наприклад,при r 0,75 и 1,5 двоспіральна структура зберігається, у всякому разі, до 97С (мал.7).

Мал.6. Залежності зміни температури (T_m) і інтервалу (t) плавлення від концентрації іонів Ag⁺.

Одержані експериментальні дані узгоджуються з передбаченнями теорії “скріпок” (Франк-Каменецький, 1968).

Мал. 7. Криві плавлення ДНК в присутності іонів Ag⁺.

1 -r = 0; 2 - 0,015; 3 - 0,031; 4 - 0,061; 5 - 0,1; 6 - 0,16; 7 - 0,315; 8 - 0,417; 9 - 0,75 і 1,5.

Згідно з цією теорією для випадку“сильного” зв'язування (воно є характерним для іонів Ag⁺ при утворенні “сильного” комплексу) зміна інтервалу плавлення в 2 рази перебільшує зміну температури переходу спіраль-клубок. Відповідне відношення t/T_m для перших трьох концентрацій

Ag⁺ (мал.6) дорівнює 2,30,1. Таким чином, поведінка температури і інтервалу плавлення, а також сильна асиметрія кривих плавлення ДНК (мал.7) в області існування “сильного” комплексу (мал.6) зумовлена перерозподілом іонів з розплетених на спіральні ділянки ДНК в процесі переходу спіраль-клубок.

Додатки вміщують основні формули для розрахування констант зв'язування іонів металів з основами НК, а також кривих фазової рівноваги.

ВИСНОВКИ

Згідно з відомими експериментальними даними, одержаними головним чином в системах із зниженою активністю води, основними атомами основ пуринових нуклеотидів, що координують вивчені іони у водних розчинах, є N7. Крім того, на диференційних спектрах виявлено особливості, що дозволяють припустити взаємодію іонів з карбонільними киснями похідних гуаніну, яка найбільш сильно виявляється у іонів Ag⁺ , Cu²⁺ та Со²⁺.

Іони Ag⁺ координують з N3 і, можливо, з О2 похідних цитозину. Навпаки, взаємодія іонів Ni²⁺ і Cd²⁺ з N3C є дуже слабкою або зовсім відсутня не тільки на мономерному рівні, але й у випадку полі С.

Основним зв'язуючим вивчені іони атомом природної ДНК є N7G, взаємодія з яким викликає перенос протону від N1G до N3C в G-C-парах. При утворенні цього (“сильного”) комплексу конформація ДНК суттєво не змінюється. Іони Ag⁺ утворюють також “слабкий” комплекс, в котрому замість містка N1G-Ag-N3C, що припускався раніше, більш переважним є хелат N7G-Ag-N3C, здатний утворюватися в результаті переходу гуанозину із анти- в сін-конформацію. В присутності іонів Ni²⁺ та Cd²⁺ подібний комплекс не утворюється із-за відсутності зв'язування цих іонів з N3C.

Відміна у зв'язуванні іонів Ag⁺, Cd²⁺ і Ni²⁺ з основами різної природи визначається різницею величини модуля молекулярного електростатичного потенціалу (МЕП) на відповідному гетероатомі.

Різниця в вільній енергії зв'язування іонів перехідних металів 3d-групи з GMP в основному визначається різницею іонних радіусів и, як наслідок, поверхневої густини заряду іонів.

Встановлено вплив рівня структурної організації нуклеїнових кислот на характер їх зв'язування з іонами Ni²⁺, Cd²⁺ і Ag⁺:

а) при переході від нуклеотида до двоспіральної ДНК константа зв'язування іонів зростає на 1-2 порядки;

б) на відміну від некооперативної взаємодії іонів з нуклеотидами, їх зв'язування з основами ДНК має негативну або позитивну кооперативність. Перша характерна для іонів Ni²⁺ та Cd²⁺ і зумовлена дальнодією кулонівского відштовхування між іонами, які зв'язані з полімером, та іонами, які адсорбуються ним із розчину. Позитивна кооперативність утворення іонами Ag⁺ “слабкого” комплексу - кооперативністю переходу ДНК в нову двоспіральну конформацію.

Визначені параметри переходу спіраль-клубок ДНК в присутності іонів Ag⁺. Вперше виявлено аномальну форму концентраційної залежності її температури і інтервалу плавлення, яка підтверджує наявність “слабкого” і “сильного” типів зв'язування срібла з ДНК. Утворення останнього описується теорією скріпок. Поведінка параметрів переходу спіраль-клубок ДНК визначається перерозподілом іонів між спіральною та клубкоподібною фазами ДНК в процесі плавлення.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

Sorokin V.A., Valeev V.A., Gladchenko G.O., Sysa I.V., Blagoi Yu.P., Volchok I.V.. Interaction of bivalent Cu²⁺, Ni²⁺, Mn²⁺ ions with native DNA and its monomers // J. Inorg. Biochem. - 1996. - V. 63, N 2. - P. 79-98.

Sorokin V.A., Sysa I.V., Valeev V.A., Gladchenko G.O., Degtyar M.V. and Blagoi Yu.P.. Differential UV-Spectroscopic Studies of Transition Metal Ion Interaction with DNA and Its Monomers // J. of Mol. Struct. - 1996. - N 408-409. - P. 233-236.

Сорокин В.А., Валеев В.А., Гладченко Г.О., Сыса И.В. Изучение взаимодействия ионов двухвалентного кадмия с нуклеотидами и природной ДНК // Биофизика. - 1997. - T. 42, вып. 1. - С. 105-116.

V.A. Sorokin, V.A. Valeev, I.V. Sysa, G.O. Gladchenko, M. Degtyar, Yu.P. Blagoi. Nature of differences in binding of transition metal ions with bases of nucleic acids // Proc. of VII Eur. Conf. on Spectroscopy of Biol. Mol. (ECSBM-7). - Madrid, Spain. - Publ. Kluwer, Ac. Press, Dordrecht, Boston, London. - 1997. - P. 35-36.

Sysa I.V., Sorokin V.A., Valeev V.A., Gladchenko G.O., Degtyar M.V. and Blagoi Yu.P. Cd²⁺ and Ag⁺ ion interaction with nucleotides and natural DNA // Book of Abstr. of 7^th Internat. Symp. On Macromol. Metal Complexes (MMC-7). - Noordwijkerhout, The Netherlands. - 1997. - P100.

Сиса І.В., Сорокін В.О., Валєєв В.О., Гладченко Г.О., Дегтяр М.В., Благой Ю.П. Взаємодія іонів Ag⁺ з природноюДНК і нуклеотидами // Тези доповідей ІІ з'їзду Укр. Біоф. Тов. (УБФТ-98). - Харків, Україна. - 1998. - С. 31.

Sysa I.V., Sorokin V.A., Valeev V.A., Gladchenko G.O., Degtyar M.V., Blagoi Yu.P. Effects of ionic radius on formation of coordination bonds in metal complexes of GMP // Book of Abstr. of XXXIII Internat. Conf. On Coordination Chemistry (ICCC XXXIII). - Florence, Italy. - 1998. - P. 651.

Размещено на Allbest.ru