Фізичні властивості рідкокристалічних моделей біомембран

Размещено на http://www.allbest.ru/

Харківський національний університет ім. В.Н.Каразіна

УДК 577.352:544.255

ФІЗИЧНІ ВЛАСТИВОСТІ РІДКОКРИСТАЛІЧНИХ

МОДЕЛЕЙ БІОМЕМБРАН

03.00.02 - біофізика

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата фізико-математичних наук

ВАЩЕНКО Ольга Валеріївна

Харків - 2001



Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті монокристалів НАН України, м. Харків.

Науковий керівник доктор фізико-математичних наук, старший науковий співробітник Лисецький Лонгін Миколайович, Інститут монокристалів НАН України, провідний науковий співробітник.

Офіційні опоненти:

- доктор фізико-математичних наук Горбенко Галина Петрівна, Харківський національний университет ім. В.Н. Каразіна, старший науковий співробітник;

- доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Гордієнко Євген Олександрович, Інститут проблем кріобіологіі і кріомедицини НАН України, завідувач відділу.

Провідна установа Інститут фізики НАН України, відділ фізики біологічних систем, м. Київ

Захист відбудеться “_27 ” ___04____ 2001 р. о __15 00__ годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.051.13 у Харківському національному університеті ім.В.Н.Каразіна за адресою: 61077, м. Харків, пл. Свободи, 4, ауд. 7-4.

З дисертацією можна ознайомитись у Центральній науковій бібліотеці Харківського національного університету ім.В.Н.Каразіна за адресою: 61077, м. Харків, пл.Свободи, 4.

Автореферат розісланий “_23__” ___03____ 2001 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Гаташ С.В.



АННОТАЦИЯ

Ващенко О.В. Физические свойства жидкокристаллических моделей биомембран. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук по специальности 03.00.02 - биофизика. Харьковский национальный университет им. В.Н. Каразина, Харьков, 2001.

Диссертация посвящена выявлению эффектов, связанных с надмолекулярной упорядоченностью липидной компоненты биологических мембран. Исследован ряд модельных биомембран на основе лиотропных и термотропных жидкокристаллических (ЖК) систем, содержащих биомолекулы различных химических классов: пептиды, липиды, стерины и т.д. Путем сопоставления данных спектрофотометрии и калориметрии Для обоих типов систем показано четкое разделение эффектов, обусловленных особенностями фазового состояния и связанных с поглощением на молекулярном уровне. Установлено, что изменение калориметрических параметров фазовых переходов фосфолипидных мультислоев обусловлено химической природой вводимых в них биомолекул, определяющей их преимущественное взаимодействие с полярной либо неполярной частями липидного бислоя. Предложено использование в качестве жидкокристаллической модели биомембрантермотропные ЖК-системы на основе эфиров холестерина. Получены результаты по изменению надмолекулярных структурных параметров холестерических систем, содержащих продукты синтеза витамина D, представляющие практический интерес с точки зрения биоэквивалентной УФ-дозиметрии.

Ключевые слова: модельные биомембраны, жидкие кристаллы, селективное отражение, калориметрия, спектрофотометрия, термогравиметрия, витамин D, фармакологические препараты.



АНОТАЦІЯ

Ващенко О.В. Фізичні властивості рідкокристалічних моделей біомембран. - Рукопис. біомолекула ліпідний ліотропний

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата фізико-математичних наук зі спеціальності 03.00.02 - біофізика. Харківський національний університет ім. В.Н. Каразіна, Харків, 2001.

Дисертацію присвячено висвітленню ефектів, що пов'язані із надмолекулярною впорядкованостю ліпідної компоненті біологічних мембран. Досліджено низку модельних біомембран на основі ліотропних та термотропних рідкокристалічних (РК) систем, що містять біомолекули різних хімічних класів. Для обох типів систем показано чітке розрізнення ефектів, що обумовлені особливостями фазового стану та тих, що пов'язані із поглинанням на молекулярному рівні. Встановлено, що зміну калориметричних параметрів фазових переходів фосфоліпідних мультишарів обумовлено хімічною природою біомолекул, що до них вводяться. Запропоновано використання РК-систем на основі ефірів холестерину як рідкокристалічної моделі біомембран. Отримані результати щодо зміни надмолекулярних структурних параметрів холестеричних систем, що містять продукти синтезу вітаміну D, які мають практичний інтерес з точки зору біоеквівалентної УФ-дозіметрії. В рамках методів термічного аналізу отримано параметри гідратних оболонок ліотропних модельних мембран.

Ключові слова: модельні мембрани, рідкі кристали, селективне відбиівання, калориметрія, спектрофотометрія, термогравіметрія, вітамін D, фармакологічні препарати.



SUMMARY

Vashchenko O.V. Physical properties of liquid crystalline models of biomembranes. - Manuscript.

Thesis for a candidate's degree by speciality 03.00.02 - Biophysics. - V.N. Karazin Kharkiv National University, Kharkiv, 2001.

The work is devoted to clarifying of some effects caused by the phenomena of supramolecular ordering of biomembrane lipid compound. A number of model liquid crystalline (LC) membranes has investigated containing small amounts of one of the following biological molecules: sterols, olygo- and polypeptides, amino-acids, long-chain fatty acids and their ethers, ammonium salts. Two principal types of model systems were used: lyotropic LC membranes (multilamellar phospholipid structures) and thermotropic LC formed by cholesterol ethers, which were first proposed for this purpose. Among experimental techniques used, there were optical spectrophotometry and differential scanning calorimetry (DSC), thermogravimetrical analysis and Langmuir monolayers technique. Sperctrophotometry were used for studying temperature dependencies of UV absorption spectra as well as of selective relflection spectra in cholesteric mesophase. Selective transition techniques is applied, allowing one to get such parameter of cholesteric LC as helical pitch were used for studying supramolecular ordering in model membranes. Thermogravimetry used for studying the structure of hydrated shell in lamellar phase of hydrated phospholipids. Using the Langmuir technique, mixed monolayers were investigated consisted of phospholipids and amphiphilic substanses among studied.

As a result of complex investigation, the similarity of lipid-sterol and lipid-peptide interactions was ascertained for thermotropic cholesteric phase of cholesterol ethers and lyotropic phase of hydrated phospholipids. For the last models, changes in calorimetric parameters of main phase transition (so-called “membrane melting”) in the presence of different biological molecules was investigated. It was discovered that the changes are mainly caused by chemical nature of the biomolecule, which determines their preferred interaction with polar or non-polar lipid bilayer area. Compairing analysis of temperature dependencies of UV spectra in both types of model systems and DSC data has been carried out. A good agreement between temperature dependencies breaks and calorimetric phase transition points was settled. It also becomes possible to differ effects of biomolecule presence caused by molecular absorption and those connected with the features of phase state and supramolecular structure of the system investigated.

For the ammonium antimicrobial agents decamethoxinum and aethonium, decreases the phase transition temperature Tc were observed, which is equivalent to increasing the degree of molecular disordering inside the membrane. It may be one of the factors responsible for their bactericidal properties. The strong disturbing influence of decamethoxinum is confirmed also by the results of Langmuir monolayers investigations. On the base of `area - pressure' isotherms for the monolayers containing egg yolk lecithin and one of amphyphilic biomolecules among investigated (cholesterol, decamethoxinum, stearoyl-L-?-alanine), values of free energy of mixing were established. The data obtained bear whiteness to condensation effect of stearoyl-L-?-alanine and loosen one of decamethoxinum.

Comparatively simple experimental technique was proposed allowing us to obtain some hydratation parameters of model phospholipid membranes, namely to estimate the value of different water fractions and to calculate the average energy of their interaction with lipid molecules. The parameters was obtained for both model membranes and pure compound. It was established that hydratiation degree of lipid multilayers changes under the presence of biomolecules. For tripeptide glutatione introduced in phospholipid structure, it was obtained that the whole amount of water in hydrated shell was increased and distribution of its interaction energy was changed.

Under studying the thermotropic LC systems containing the products of vitamin D photoisomerisation it was shown that their presence led to essential changes in cholesteric pitch which is differ for different isomers. The composition of a cholesteric matrix was selected, which allow obtain selective reflection spectra and electronic absorption spectra. It becomes possible to check the processes occurring both on the level of individual molecules and at the level of supramolecular structure. It was shown that the shifts of selective reflection peaks may be used for monitoring of vitamin D formation under UV irradiation. LC ordering of reactive media have an influence on the photoisomerisation processes, causing to shifts the reaction equilibrium to form one or another products.

Key words: model membranes, liquid crystals, selective reflection, calorimetry, spectrophotometry, thermogravimetry, vitamin D, pharmacological agents.



ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Однiєю з найважливiших задач бiофiзики є застосування фiзичних методiв дослiдження до вивчення живих органiзмiв та бiологiчних тканин. Досить давно вiдома i стала майже загальновизнаною гiпотеза про те, що структурi багатьох бiологiчних тканин притаманнi елементи рiдкокристалiчної впорядкованностi (найбільш яскравий приклад - клітинні мембрани з їх бiшаровою ліпідною структурою). Виходячи з цього, значний інтерес викликає можливість застосування підходів та методів, що були розроблені для дослідження рідкокристалічних систем, до вирішення деяких проблем біофізики мембран, зокрема, пов'язаних з міжмолекулярними взаємодіями їх компонентів та екзогенних молекул. У нинішній час цій проблемі приділяється надзвичайно велика увага у зв'язку з новими уявленнями про роль ліпідного бішару в клітинних процесах. Відомо, що зміна структури клітинних оболонок під впливом зовнішніх чинників (таких, як іонізуюче випромінювання, присутність екзогенних молекул тощо) лежить в основі багатьох патологічних процесів в організмі, що призводять до різноманітних захворювань. У зв'язку з цим одними з найбільш актуальних у цьому напрямку є задачі з'ясування фізичних та фiзик-хiмiчних методів дії лікарських препаратів на клітинному та субклітинному рiвнi, а також створення бiоеквiвалентних матеріалів та сенсорів.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконувалась згідно з планами науково-дослідних робіт Інституту монокристалів НАН України, а саме з темою відомчого замовлення ВФТПМ НАН України: "Теоретичний аналіз та фізико-хімічні дослідження анізотропних міжмолекулярних взаємодій і розробка концепції рідкокристалічних біоеквівалентних матеріалів (№ держреєстрації 0198U004259).

Мета і задачі дослідження. Метою дослідження було з'ясування впливу мембранотропних агентів на рідкокристалічне надмолекулярне впорядкування та структурно-функціональні властивості модельних біомембран.

Об'єкт дослідження - модельні біологічні мембрани на основі ліотропних рідкокристалічних фаз фосфатіділхолінів, а також термотропні рідкокристалічні системи на основі ефірів холестерину, що містять компоненти біомембран та мембранотропні агенти декількох хімічних класів.

Предмет дослідження - макроскопічні прояви особливостей надмолекулярної структури та рідкокристалічного фазового стану модельних мембран.

Методи дослідження: диференційна скануюча калориметрія - для отримання термодинамічних параметрів фазових переходів; спектрофотометрія - для дослідження температурних залежностей УФ-спектрiв пропускання, а також температурних залежностей спектрiв селективного відбивання світла в холестеричнiй мезофазi; термогравiметрiя - для визначення зв'язаних станів води в ламелярнiй фазi гідратованих фосфолiпiдiв; вивчення змішаних ленгмюрiвських моношарiв - дляотримання діаграм “поверхневий тиск-площа”.

Для досягнення мети дисертації були поставлені та вирішені наступні задачі:

1. Підібрати системи, що моделюють рідкокристалічне впорядкування в біологічних мембранах, в яких зміни надмолекулярної структури можуть бути безпосередньо виявлені за допомогою порівняно простих методів інструментального аналізу.

2. Встановити механізм впливу компонентів біологічних мембран та мембранотропних агентів на рідкокристалічне впорядкування фосфоліпідного бішару.

3. З'ясувати можливість застосування спектрів селективного відбівання в холестеричній мезофазі з метою дослідження змін надмолекулярної структури модельних мембран у присутності біомолекул різних хімічних класів.

4. Застосувати методи термічного аналізу для вивчення гідратації модельних мембран.

Наукова новизна одержаних результатів:

1. Вперше запропоновано використання спектрiв селективного відбивання холестеричноi мезофази для дослідження міжмолекулярних взаємодій компонентів біологічних мембран.

2. Вперше проведений порiвняльний аналiз та встановлений зв'язок мiж даними ДСК та температурними залежностями УФ-спектрiв пропускання лiотропних i термотропних рiдкокристалiчних систем, що мiстять модельнi мембранотропнi агенти рiзних хiмiчних класiв.

3. Встановлено, що вплив мембранотропних агентiв на параметри фазових переходiв гель - рiдкий кристал у ламелярнiй структурi гiдратованих фосфолiпiдiв пов'язаний iз переважною взаємодiєю мембранотропних агентiв (МТА) з полярною чи неполярною частиною фосфолiпiдних бiшарiв, що визначає термостабiльнiсть низькотемпературноi L-фази.

4. Показано, що УФ-опромiнення рiдкокристалiчних систем на основi ефiрiв холестерину, що мiстять продукти синтезу вiтамiну D, призводить до змiн кроку холестеричної спiралi, якi можуть бути чiтко зареєстровані методом спектроскопii селективного вiдбивання. Це дозволяє використовувати даний метод для монiторiнгу вiдповiдних хiмiчних реакцiй та бiоеквiвалентноi УФ-дозиметрii.

Практичне значення одержаних результатів. Встановлені закономірності характеру взаємодії біомолекул із фосфоліпідними мембранами можуть бути використані для спрямованого отримання лікарських препаратів, що діють як мембранотропні агенти. Результати досліджень фотоіндукованої ізомерізації провітаміну D в РК-матрицях можуть використовуватися як основа для створення біоеквівалентних детекторів УФ-опромінення. Дослідження зміни надмолекулярної структури та фазового стану модельних біологічних мембран в присутності біомолекул різних хімічних класів важливі для встановлення зв'язку між їх структурою та дією на ліпідний бішар.

Запропонована рідкокристалічна модель мембрани дозволяє безпосередньо досліджувати вплив біомолекул на фазовий стан середовища. Результати дослідження змішаних ленгмюрівських моношарів можуть бути застосовані при вивченні механізмів міжмолекулярних взаємодій компонентів біологічних мембран. Дані, отримані методом термогравіметрії, а також розроблені комп'ютерні засоби їх обробки мають цінність з точки зору вивчення впливу компонентів мембран та екзогенних молекул на зміну параметрів гідратації ліпідного бішару.

Особистий внесок здобувача. В опублікованих із співавторами наукових роботах особистий внесок здобувача полягає: в роботах [1,4-8,10-13,15,18] практично весь обсяг робіт по отриманню та обробці даних, участь в обговоренні результатів; в роботі [2] участь у постановці задачі, опрацюванні експериментальної методики, а також у проведенні експериментів, що відносяться до гідратованих фосфоліпідів, та участь в обговоренні їх результатів; в роботах [3,9] участь у проведенні експерименту, аналізі та обговоренні температурних залежностей УФ-спектрів поглинання; в роботах [14,16,17] участь у проведенні експерименту, аналізі та обговоренні результатів.

Апробація результатів дисертації. Основні результатти роботи доповідалися та обговорювалися на: III та IV Міжнародних конференціях з ліотропних рідких кристалів (Іваново, Росія, 1997, 2000 рр.), Європейській конференції з рідких кристалів (Закопане, Польща, 1997 р.), конференції "Фізика біологічних систем" (Пуща-Водиця, Україна, 1998), конференції "Електронні процеси в органічних матеріалах" (Київ, 1998), ІІ з'їзді Українського біофізичного товариства (Харків, Україна, 1998 р.), Європейській конференції по рідким кристалам (Кріт, Греція, 1999), XIV міжнародній школі-семінарі "Спектроскопія молекул і кристалів" (Одеса, Україна, 1999 р.), Європейській конференції "Fundamental aspects of surface science" (Кастелвеккіо-Пасколі, Італія, 1999 р.), Міжнародному симпозіумі "Smart Sensors" (Київ, 2000 р.), 15 Міжнародній конференції з мас-спектрометрії (Барселона, Іспанія, 2000 р.), 3 Європейському біофізичному конгресі (Мюнхен, Німеччина, 2000 р.).

Публікації. Результати дисертації опубліковано у 18 наукових роботах, в тому числі в 7 статтях у наукових журналах та 11 матеріалах і тезах національних і міжнародних конференцій, симпозіумів і конгресів.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається із вступу, 5 розділів і висновків. Повний обсяг дисертації складає 147 сторінок, містить 44 рисунки (з них 10 займають 8 повних сторінок), 8 таблиць (з них 4 займають 5 повних сторінок). Список використаних літературних джерел (163 найменування) займає 17 сторінок.

основний зміст роботи

У вступі обґрунтовано актуальність обраної теми роботи, сформульовано ціль і задачі дослідження, визначено наукову новизну та практичне значення отриманих результатів, наведено загальну характеристику дисертації.

В розділі 1 представлено огляд літератури за темою дослідження. Викладені основні поняття фізики рідких кристалів (РК), а також сучасні уявлення про структурну організацію біологічних мембран і роль ліпідного бішару в їх функціюванні. Проведено аналіз сучасних даних по ліпід-білковим взаємодіям в модельних мембранах.

Детально розглянуті сучасні результати по впливу на властивості ліпідного бішару компонентів біологічних мембран, а також різних екзогенних молекул - модельних пептидів, фармакологічних препаратів та ін. Встановлено, що при взаємодії з бішаром всі вказані речовини змінюють ті чи інші його параметри, що й обумовило вживання по відношенню до них загального терміну "мембранотропні агенти" (МТА). Відзначено, що вибір мембранотропних агентів для таких досліджень не систематизований і здебільшого визначається інтересом до з'ясування дії того чи іншого агента на клітинному рівні. Внаслідок цього загальні уявлення про закономірності взаємодії молекул різних класів на надмолекулярну структуру ліпідного бішару до цього часу розвинуті досить слабо.

Проведено критичний огляд сучасних модельних підходів до опису та вивчення біомембран. Показано, що існуючі на цей час теоретичні уявлення та експериментальні моделі не дозволяють розглядати з єдиних позицій усе різномаїіття явищ, які відбуваються в ліпідному бішарі біомембран. В той же час, дістають все більше визнання уявлення про його рідкокристалічну природу. У зв'язку з цим обгрунтовано перспективність застосування для досліджень надмолекулярної структури біомембран підходів та методів, які традиційно використовуються в фізиці рідких кристалів. На основі аналізу літературних даних сформульовано основні задачі дослідження.

В розділі 2 наведено характеристику об'єктів та методів дослідження. Для дослідження макроскопічних проявів особливостей надмолекулярної структури та рідкокристалічного фазового стану модельних мембран були використані 7 ліотропних та термотропних рідкокристалічних матриць, до складу яких входили компоненти біомембран і мембранотропні агенти декількох хімічних класів. Термотропні рідкокристалічні матриці представлені композиціями на основі ефірів холестерину, ліотропні - водними дисперсіями фосфатидилхолінів.

Основними експериментальними методами, використаними в роботі, були методи оптичної спектроскопії та диференційної скануючої калориметрії. Як допоміжні методи, були використано термогравіметричний аналіз (ТГА) та дослідження ленгмюрівських моношарів. Температурні залежності УФ-спектрів селективного відбивання в холестеричній мезофазі були отримані за допомогою спектрофотометра "Hitachi-330" (Японія). Для отримання термограм ДСК і ТГА була використана термоаналітична система "Mettler TA 3000" (Швейцарія). Змішані ленгмюрівські моношари фосфатіділхолінів та МТА вивчалися за допомогою ленгмюровської ванни виробництва МПО НІОПІК (Росія).

В розділі 3 досліджено вплив компонентів біологічних мембран та інших мембранотропних агентів на рідкокристалічні характеристики модельних мембранних структур з використанням усіх вищевказаних методів.

За допомогою методу ДСК було досліджено зміни параметрів фазових переходів мультиламелярної водної дисперсії діпальмітоїлфосфатидилхоліну (ДПФХ) у присутності МТА різної хімічної природи.

Параметр кооперативності CN обчислювали як

, (1)

де H та Т - відповідно, ентальпія та напівширота переходу до L-фази; R - універсальна газова константа.

З точки зору фізики рідких кристалів, МТА є немезогенними домішками (тобто, такими, що не утворюють рідкокристалічну фазу), що модифікують властивості мезофази. Аналіз наданих у табл. 2 результатів дозволив встановити певну кореляцію між структурою речовини та індукованими нею змінами. Можна виділити групу МТА, для якої спостерігається зниження ентальпії та кооперативності переходу без суттєвого зсуву його температури Тm. Такі ефекти спостерігаються у випадках, коли МТА переважно взаємодіє з гідрофобною частиною бішару (як, наприклад, холестерин). Якщо МТА розташовується в гідрофільній зоні бішару (аланін, декаметоксин), спостерігається зміна температури перехода без розмивання його піка. В присутності арфіфільних МТА (стеароїлаланін, етоній) спостерігаються як зміна температури перехода, так і розмивання піка.

Моделювання взаємодії ліпід-стерін та пептид-стерін у впорядкованих середовищах здійснювалося за допомогою холестеричної матриці 1, що має надмолекулярне спіральне закручування та зумовлені ним селективні оптичні властивості. Типовий вигляд спектрів селективного відбивання матриці 1, що містить невеликі домішки МТА, наведений на рис. 1. Значення довжини хвилі в максимумі відбивання max~p, де р - шаг холестеричної спіралі. Базуючись на зміні форми та положення піків спектру, можна сказати, що в присутності більшості домішок (глутатіону, яєчного лецитіну, а також тетрагліцину, D,L-?-аланіну, олеїнової та стеарінової кислот, відповідні спектри для яких аналогічні кривим 3 та 4 і тому на даному рисунку не наведені) відбувається характерне для більшості холестеричних систем із немезогенними домішками зменшення ступіні рідкокристалічної впорядкованості та збільшення закручування матриці. Єдиним винятком серед досліджених МТА є поліаланін, для якого зміни спектрів селективного відбивання свідчать про його впорядковуючу дію на матрицю 1, що підтверджується також і відповідними даними ДСК.

Впорядкованість у розташуванні молекул в рідкокристалічних структурах виявляється також і в цілому ряді особливостей їх оптичних властивостей. В загальному випадку, в умовах рівноваги, інтенсивність світла, що падає на досліджуваний об'єкт (Ii), дорівнює сумі інтенсивностей світла, що пройшло крізь цей об'єкт (It), а також поглиненого (Iа) та відбитого їм (Ir), тобто

Ii = It+ Ir+Iа. (2)

Зміна орієнтації та/або щільності упакування молекул в рідкокристалічному об'єкті може призвести до зміни інтенсивності відбитого світла, а отже, згідно з формулою (1), і частки пропущеного світла, що реєструється у вигляді пропускання Т досліджуваного зразку або його оптичної густини D=lg(1/T). Для конденсованих середовищ внесок частки відбитого (розсіяного) світла досить суттєвий та має залежність від температури, зумовлену змінами надмолекулярної структури та фазового стану досліджуваної системи.

Такі ефекти спостерігалися нами в роботі для мультишарів ДПФХ в УФ- та видимій областях (рис. 2). При усіх значеннях довжини хвилі в межах досліджуваного діапазону оптична густина зразка зменшувалася з підвищенням температури (dD/dT<0) як в області власного поглинання молекул ДПФХ, так і за її межами. Співставлення отриманих залежностей із даними ДСК виявило чітку кореляцію між точками фазових переходів та зламами у ході кривих D(T). Характерно, що при уведенні пептидів загальний вигляд кривих змінювався, та в деяких випадках (при уведенні D-валіну) спостерігався зворотній хід температурної залежності (dD/dT>0).

У паралельній серії експериментів в аналогічних умовах було досліджено температурні залежності УФ-спектрів для деяких термотропних рідких кристалів - сумішей на основі ціанобіфенілів та азометинів. За межами області власного поглинання молекул характер залежності D(T) для термотропних РК та мультишарів ДПФХ є аналогічним, а саме: є загальна тенденція до зменшення D з температурою, при чому скоки та злами, що спостерігаються на кривих, відповідають точкам фазових переходів. В області інтенсивного власного поглинання (D=35) спостерігається зворотній характер залежності D(T) при фазовому переході (dD/dT>0). Це може бути пов'язано зі збільшенням поглинання внаслідок розупорядкування діхроїчних хромофорних груп.

З метою уточнення припущеного нами раніше механізму взаємодії МТА з ліпідним бішаром було досліджено змішані ленгмюрівські моношари на основі яєчного лецитіну, що містили амфіфільні домішки з-поміж досліджуваних МТА. Такі дослідження уявлялися досить коректними, оскільки завдяки своїй амфіфільности та співвідношенню полярних та неполярних частин лецитін утворює досить стабільний моношар на межі розподілу вода - повітря. Суттєве обмеження при цьому полягає в тому, що досліджувані МТА повинні бути нерозчинними у воді. Ці обставини зумовили цілеспрямований синтез модельної сполуки - стеароїл-L--аланіну, структура якого повинна була забезпечити розташування амінокіслотного залишка в гідрофільній частині моношару без ризика його переходу у субфазу. Крім цієї сполуки, нами були обрані інші домішки, які були спроможні самостійно утворювати моношари в умовах експерименту, що дозволяло отримувати значення середньої площі на молекулу <А> як в індивідуальних, так і в змішаних моношарах. Для всіх досліджуваних систем були визначені відхилення від адитивності середньої площі січення (<А>0), залежні від поверхневого тиску .

Характер залежностей <А>() пов'язаний із структурними особливостями домішок, обумовлюючих специфіку міжмолекулярних взаємодій у системі. Так, жорстке стероідне ядро холестерину обмежує рухомість сусідніх ліпідних ланцюгів, тому із підвищенням поверхневого тиску між ними зростає стеричне відштовхування. Стеароїлаланін, який має гнучку гідрофобну частину, вірогідно, не спричиняє помітної збурюючої дії на область ліпідних хвостів, проте взаємодія аланілу з ліпідними головками призводить до їх ущільнення, яке виявляється в негативному значенні <A>. Така картина взаємодій повністью узгоджується з даними ДСК.

Хід кривої 3 на рис. 3 відбиває особливості структури молекули декаметоксину, в якій два четвертинних атома азоту утворюють позитивно заряджені ділянки, з'єднані гнучким вуглеводневим ланцюгом. За невеликих значень тиску ланцюг є витягнутим внаслідок відштовхування заряджених ділянок, що призводить до значних позитивних <A>. При збільшенні поверхневого тиску заряджені ділянки зближуються завдяки деформації з'єднувального ланцюга, і <A> зменшується. На основі залежностей <A> від поверхневого тиску визначено вільну енергію змішування вказаних компонентів у моношарі Gmix при заданому значенні поверхневого тиску :



. (3)

де АLD - середня площа на молекулу у суміші фосфоліпід/ МТА; АL та АD - відповідні площі на одну молекулу в індивідуальному моношарі, NL та ND - відповідно, число молекул ліпіда та МТА в моношарі.

Для декаметоксину порівняно високі позитивні значення Gmix (3-5 кДжмоль-1), які суттєво зростають при підвищенні поверхневого тиску, відповідають його сильній "збурюючій" дії на ліпідний бішар за даними ДСК (см. табл. 2). Для холестерину та стеароїл-L--аланіну характерні порівняно невеликі (до 1 кДжмоль-1) значення Gmix, що слабо залежать від зміни поверхневого тиску. При цьому для холестерину, що розташовується у гідрофобній частині бішару вони позитивні (Gmix>0), тоді як для стеароїл-L--аланіну - негативні (Gmix<0), що може бути проявом його ущільнювальної дії на бішар внаслідок взаємодій з його неполярною частиною. В цілому можна сказати, що результати досліджень ізотерм "поверхневий тиск-площа" для змішаних ленгмюрівських моношарів лецитін/МТА узгоджуються із припущеннями про характер взаємодій молекул МТА з ліпідним бішаром, що були висловлені нами раніше, та можуть бути їх непрямим підтвердженням.

В розділі 4 наведено результати досліджень деяких параметрів гідратації модельних мембран та чистих МТА за допомогою методів термічного аналізу. Зважаючи на велику трудомісткість отримання та обробки результатів, експерименти проведено лише для обмеженої кількості систем. Було отримано термогравіграми мультиламелярних дисперсій яєчного лецитину при різних температурах, за допомогою яких було зроблено кількісні оцінки різних фракцій води у зразках (від сильно зв'язаної до вільної води), які добре узгоджуються із літературними даними.

Використання технології приготування зразків, що виключає присутність вільної води в досліджуваних системах, дозволило безпосередньо вивчати тільки воду, структуровану внаслідок взаємодії з біомолекулами. Під час досліджень визначалися такі параметри, як повна кількість води, абсорбованої системою з атмосфери насиченої пари в умовах експерименту, а також утримуваної системою в цих умовах. Порівняння із літературними даними дозволило з'ясувати, що перша із вказаних величин відбиває повну кількість води, структурованої внаслідок взаємодії з біомолекулою або бішаром. Друга величина, вочевидь, відповідає кількості сильно зв'язаної води. Шляхом співставлення даних термогравіметрії та калориметрії було визначено ентальпію десорбції води Нd як функцію кількості води в зразку:

, (4)

де mw (t1), mw (t2) - значения маси води, що залишилася в зразку у відповідні моменти часу; - значення величини теплопотоку .

Було показано, що присутність у ліпідному бішарі таких домішок, як аланін, глутатіон та стеароїлаланін, підвищують ступінь початкової та кінцевої гідратації. У випадку глутатіону, для якого було проведено більш детальні дослідження, при цьому відзначалося підвищення ентальпії десорбції води за високого ступеня гідратації зразка та ії зниження за низької гідратації, що, на наш погляд, свідчить про реорганізацію структури гідратної оболонки в цілому.

Встановлено також, що для переважної більшості досліджених систем значення Нd для граничної гідратації виявляються нижчими, ніж відповідна величина для чистої дистильованої води, отримана в контрольному експерименті, яка становила ~43 кДж/моль. Для досіджуваних систем характерні значення Нd складали 30-38 кДж/моль. Це, вірогідно, відбиває факт часткової деструктурованості води, що входить до гідратних оболонок біомолекул.

В розділі 5 розроблену нами методику, що ґрунтується на високій чутливості спектрів селективного відбивання холестеричної мезофази до присутності МТА, застосовано до досліджень процесів фотоіндукованого синтезу вітаміну D в упорядкованих середовищах. Відповідні дані було отримано для кількох продуктів синтезу вітаміну D та їх похідних (див. табл. 1) в двох холестеричних матрицях: матриці 1 (20% холестерилхлориду + 80% холестерилолеату) та матриці 4, яка містила додатково евтектичну суміш алкілциклогексанкарбонових кислот.

Температурні залежності максимуму довжини хвилі селективного відбивання max матриці 1 в присутності вказаних стеринів наведено на рис. 4. Високотемпературний обрив залежностей відповідає температурі переходу в ізотропну фазу. Незважаючи на хімічну подібність добавок, що вводилися, їх дія на параметри рідкокристалічної матриці істотно розрізнюється: як видно з рис. 4, їх присутність може призводити до зниження або підвищення термостабільності холестеричної мезофази, а також до зміни її спірального закручування в той чи інший бік. Такі ефекти можуть бути пов'язані із відмінностями в конформаційній рухливості молекул. Зокрема, провітамін D2 має жорсткий стероїдний скелет, тоді як для молекули вітаміну D2 при кімнатній температурі енергетичний бар'єр обертання навколо внутрішнього одинарного зв'язка С-С досить низький.

Молекули бензоату холестерину та бензоату провітаміну D3 мають додаткову рухливість завдяки обертанню навколо одинарного зв'язка С-С, яке змінює взаємну орієнтацію стероїдного ядра та бензольного кільця.

Було досліджено також вплив упорядкованості середовища на кінетику процесів фотоізомеризації бензоату провітаміну D3. Встановлено, що рідкокристалічна впорядкованість реакційного середовища впливає на хід процесу фотоізомеризації, зміщуючи рівновагу реакції в бік утворення тих чи інших продуктів. Для вивчення процесів фотоіндукованого синтезу вітаміну D було підібрано склад холестеричної матриці з низькою чутливістю до УФ-випромінювання та пропусканням понад 50% аж до 250 нм (матриця 4). Використання матриці 4 дозволило одночасно реєструвати зміни спектрів селективного пропускання та електронних спектрів поглинання під час процесів фотоізомеризації вітаміну D.

Було встановлено, що під час дії УФ-опромінювання та після його припинення в системі матриця1/бензоат провітаміну D3 відбуваються зміни спірального закручування, що можна побачити з рис. 5. Вірогідно, зменшення max викликано утворенням фотоізомерів введеної речовини. Можна припустити також, що продовження змін max після припинення УФ-опромінювання пов'язано з протіканням вторинних темнових реакцій.

В цілому можна сказати, що зареєстровані зміщення піків селективного відбивання можуть бути використані для моніторингу процесів утворення вітаміну D, а також для розробки біоеквівалентного детектора УФ-випромінювання.



ВИСНОВКИ

В роботі виявлено та проаналізовано низку ефектів у модельних мембранних структурах, що зумовлені їх рідкокристалічним фазовим станом, важливих для розуміння ролі надмолекулярної впорядкованості ліпідного бішару біологічних мембран у функціонуванні живої клітини.

Основні результати роботи можуть бути сформульовані наступним чином:

Запропоновано використання термотропних рідких кристалів на основі ефірів холестерину як системи, що моделює надмолекулярну впорядкованість в біомембранах. Показано подібний характер взаємодій ліпід-стерин та пептид-стерин для досліджених систем в термотропній холестеричній фазі та в ліотропній фазі гідратованих фосфоліпідів.

Встановлено зміну калориметричних параметрів фазових перетворень "гель - рідкий кристал" у ламелярних фосфоліпідних структурах під впливом мембранотропних агентів різних хімічних класів (стерини, оліго- та поліпептиди, амінокислоти, довголанцюгові жирні кислоти та їх ефіри, амонійні солі). Встановлено, що зміна цих параметрів обумовлена насамперед хімічною природою мембранотропних агентів, що визначає їх переважну взаємодію з полярною або неполярною частинами ліпідного бішару.

Порівняльний аналіз температурних залежностей УФ-спектрів пропускання в ліотропних та термотропних РК-системах, а також їх співставлення з даними ДСК дозволили чітко розрізнити ефекти, що пов'язані з поглинанням на молекулярному рівні та обумовлені особливостями фазового стану та надмолекулярної структури системи, що досліджується.

За допомогою методу селективного відбивання світла планарною текстурою холестеричної мезофази, вперше застосованого для дослідження модельних біомембран, показано, що у ряді досліджених систем ступінь впорядкованості надмолекулярної структури переважно визначається геометричною формою та конформаційною рухливістю молекул їх компонентів.

Встановлено, що УФ-опромінення холестеричної матриці, що містить продукти синтезу вітаміну D, призводить до зміни кроку холестеричної спіралі на величину декількох десятків нанометрів, що дозволяє використовувати даний метод для моніторінгу відповідних хімічних реакцій у біоеквівалентній УФ-дозиметрії.

У рамках методів термічного аналізу проведено кількісну оцінку співвідношення фракцій води в системі на основі гідратованих фосфоліпідів, що дає додаткову інформацію про надмолекулярну організацію модельних мембран, таку як ступінь гідрофобності та структура гідратної оболонки.



СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Корзовская О.В., Лисецкий Л.Н., Паникарская В.Д. Межмолекулярные взаимодействия компонентов биомембран в модельных мезоморфных структурах // Известия РАН. - 1998. - Т. 62, № 8. - С. 1695-1697.

2. Вирник К. М., Корзовская О.В., Лисецкий Л.Н., Паникарская В.Д. Термогравиметрический анализ связанных состояний воды в гидратированных системах на основе фосфолипидов и ДНК // Укр. биохім. журн. - 1998. - Т. 70, № 6. - С. 85-90.

3. Пристер Б.С., Лисецкий Л.Н., Корзовская О.В., Паникарская В.Д. Исследование температурных радиационно-индуцированных эффектов в модельных и природных биомембранах методом УФ-спектроскопии // Радиационная биология. Радиоэкология. - 1998. - Т. 38, вып. 4. - С. 516-521.

4. Корзовская О.В., Лисецкий Л.Н., Паникарская В.Д., Антонян Т.П. Исследование межмолекулярных взаимодействий компонентов биомембран с помощью спектров селективного пропускания в холестерической мезофазе. // Журн. физ. химии. - 1998. - Т. 72, № 10. - С. 1896-1898.

5. Корзовская О.В., Лисецкий Л.Н., Паникарская В.Д. УФ-спектроскопия и структурные особенности модельных мембран и жидкокристаллических биоэквивалентных систем. // Вісн. Харк. ун-ту. - 1998. - № 422. Біофізичний вісн. Вип. 2. - С. 85-89.

6. Korzovskaya O.V., Pashinskaya V.A., Kosevich M.V., Lisetski L.N. Interactіon of antimicrobal agents decamethoxinum and aethonium with model membranes. // Вісн. Харк. ун-ту. - 1999. - № 450. Biophysical bulletin. Вип. 2. - С. 35-39.

7. Korzovska O.V., Terenetskaya I.P., Lisetski L.N. On a possibility to monitor the vitamin D formation processes using selective reflection properties of cholesteric liquid crystals // Вісн. Харк. ун-ту. - 2000. - № 488. Biophysical bulletin. Вип. 1. - C. 71-74.

8. Lisetski L.N., Korzovskaya O.V., Panikarskaya V.D., Antonyan T.P. Selective transmission spectroscopy as a tool to study lipid-seroid and protein-steroid interactions in biomembranes // Book of Abstr. IIIrd International Meeting on Lyotropic Liquid Crystals. - Ivanovo (Russia). - 1997. - P. 58.

9. Prister B.S., Borzenko V.N., Lisetski L.N., Shapiro Yu.Ye., Panikarskaya V.D., Korzovskaya O.V. Radiation-induced effect in liquid crystalline phases of biological membranes // Book of Abstr. Eur. Conf. on Liquid Crystals. - Zakopane (Poland). - 1997. - P. 86.

10. Lisetski L.N., Panikarskaya V.D., Korzovskaya O.V., UV-spectroscopy and structural-functional properties of model membranes and liquid crystalline bioequivalent systems // Book of Abstr. Conf. on Physics of Biological Systems. - Pouscha-Vodytsa (Ukraine). - 1998. - P. 107.

11. Korzovskaya O.V., Lisetski L.N., Panikarskaya V.D. Selective transmission spectroscopy as a tool to study lipid-steroid and protein-steroid interactions in biomembranes // Proc. Eur. Conf. on Liq. Cryst. - Crete (Greece). - 1999. - P3-015.

12. Lisetski L.N., Korzovskaya O.V., Panikarskaya V.D. Liquid crystalline phase states in biological objects and the problem of bioequivalent sensors // Proc. Eur. Conf. on Liquid Crystals. - Crete (Greece). - 1999. - P1-072.

13. Korzovska O.V., Lisetski L.N. Liquid crystalline states in ordered films of bioequivalent organic materials // Book of Abstr. Eur. Res. Conf. Fundamental Aspects of Surface Science. - Castelvecchio Pascoli (Italy). - 1999. - P. 51.

14. Lisetski L.N., Panikarskaya V.D., Korzovskaya O.V. Spectrophotometry of liquid crystalline phase states as a tool for biophysical studies // Proc. XIV Int. School-Seminar “Spectroscopy of molecules and crystals”. - Odessa (Ukraine). - 1999. - P. 18.

15. Korzovska O.V., Lisetski L.N., Panikarskaya V.D. Specific interactions of phospholipid membrane components by evidence of DSC phase transitions data // Book of Abstr. 3rd European Biophysics Congress. - Munchen (Germany). - 2000. - P. 292.

16. Lisetski L.N., Korzovska O.V., Tolmachev A.V., Vodolazhskiy K.B., Kosevich M.V., Pashinskaya V.A. Specific interactions in the mixed Langmuir monolayers of amphiphilic membrane components // Book of Abstr. 3rd European Biophysics Congress. - Munchen (Germany). - 2000. - P. 295.

17. Pashinskaya V.A., Kosevich M.V., Shelkovsky V.S., Blagoi Yu.P., Korzovskaya O.V., Lisetski L.N., Gomory A., Vekey K. Investigation of mechanisms of interaction of antimicrobal agents with model membranes // 15th International Mass Spectrometry Confertence. - Barselona (Spain). - 2000. - P. 40.

18. Lisetski L.N., Korzovska O.V., Tolmachev A.V., Vodolazhskiy K.B., Kosevich M.V., Pashinskaya V.A. Specific interactions in the mixed Langmuir monolayers of amphyphilic membrane components // Тез. докл. IV Междунар. конф. по лиотропным жидким кристаллам. - Иваново: ИвГУ. - 2000. P.76.

Размещено на Allbest.ru

...