Ефекти структурно-функціональної організації у нерівноважних макромолекулярних системах

АНОТАЦІЯ

Христофоров Л.М. Ефекти структурно-функціональної організації у нерівноважних макромолекулярних системах. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора фізико-математичних наук за спеціальністю 01.04.02 - теоретична фізика. - Інститут теоретичної фізики ім. М.М. Бого-любова НАН України, м. Киів, 2003.

Проблема взаємозв'язку структури і функції макромолекул вирішується на основі запропонованої та розвинутої у дисертації концепції динамічної молекулярної самоорга-нізації. Сутність її полягає у зворотному зв'язку структурних змін макромолекули та повторюваних актів виконуваної нею реакції. Це уможливлює граничне утворення нових режимів функціонування шляхом нерівноважних фазових переходів. Побудовано відповідну стохастичну теорію, в межах якої описані синергетичні явища у реакціях переносу заряду, сорбції низькомолекулярних лігандів, тощо. Виявлені притаманні запропонованому механізмові гістерезисні, бістабільні та адаптаційні ефекти у реакціях електронного транспорту фотосинтетичного реакційного центра і доведена вирішальна роль його структурних мінли-вості і пам'яті у здатності до саморегуляції своєї головної функції - розділення зарядів. макромолекула електронний фотосинтетичний

Ключові слова: реакції поодиноких молекул, зарядовий транспорт, заряд(субстрат)-конформаційна взаємодія, структурно-функціональний зв'язок, стохастичні процеси, нерівноважні фазові переходи, фотосинтетичний реакційний центр.

АННОТАЦИЯ

Христофоров Л.Н. Эффекты структурно-функциональной организации в неравновесных макромолекулярных системах. - Рукопись.

Диссертация на соискание учёной степени доктора физико-математических наук по специ-альности 01.04.02 - теоретическая физика. - Институт теоретической физики им. Н.Н. Бого-любова НАН Украины, г. Киев, 2003.

Проблема связи структуры и функции макромолекул решается на основе предложенной и развитой концепции динамической молекулярной самооргаизации. Сущность её состоит в обратной связи структурных изменений макромолекулы и повторных актов выполняемой ею реакции. Это приводит к пороговому возникновению новых режимов функционирования пу-тём неравновесных фазовых переходов. Построена соответствующая стохастическая теория, в рамках которой описаны синергетические явления в реакциях переноса заряда, сорбции низкомолекулярных лигандов и т.п. Выявлены присущие предложеннному механизму гистерезисные, бистабильные и адаптационные эффекты в редокс-реакциях фотосинте-тического реакционного центра и доказана решающая роль структурных изменчивости и памяти в его способности к саморегуляции своей главной функции - разделения зарядов.

Ключевые слова: реакции одиночных молекул, зарядовый транспорт, заряд(субстрат)-конформационные взаимодействия, структурно-функциональная взаимосвязь, стохастичес-кие процессы, неравновесные фазовые переходы, фотосинтетический реакционный центр.

summary

Christophorov L.N. The effects of structure-function organization in non-equilibrium macromolecular systems. - Manuscript.

Thesis for a doctor's degree by speciality 01.04.02 - theoretical physics. - Bogolyubov Institute for Theoretical Physics, NAS Ukraine, Kiev, 2003.

A theoretical generalization and a new solution to the problem of structure-function coupling in macromolecules is presented. The consideration highlights a two-fold role of polymeric structure of the macromolecule in reactions it performs. The passive role consists in creating the very channel of the reaction whose rate constants are conditioned by static structural parameters and fast small-amplitude vibrational motion of atoms. In the active role, of prime importance is structural (conformational) changeability of the macromolecule, including slow and large-amplitude movements of its atoms or atomic groups. Under the flow conditions, that is in a series of many consecutive reaction turnovers, there appears the possibility of self-consisted non-linear behaviour of the system (macromolecule + flow of reaction agents), up to dramatic changes in the reaction cycle. The feedback between the slow structural changes and fast repeated reaction acts entails the emergence of new functional regimes by means of non-equilibrium phase transitions. The proof of synergetic phenomena at the level of a single molecule essentially changes and extends the knowledge of the main physical mechanisms of the charge transfer, ligand binding or enzymatic reactions in (bio)macromolecular systems.

Due to the mentioned dual role, the dissertation material is divided into two parts. In the first part the flow conditions are not decisive, and one can often restrict oneself with the consideration of kinetics of a single reaction act. A comprehensive kinetic formalism is constructed that has allowed the author to distinguish and fully classify the physical mechanisms of the charge transfer through weakly populated intermediate states of a structurally rigid macromolecule. The contributions of these mechanisms to the reaction rate constant are determined within a unified scheme. A criterion of applicability of kinetic equations under changing temperature is established and a new method of determination of the kinetic parameters of thermally-activated reactions by fast cooling is developed and practically used. The mobility and other kinematic and dynamical characteristics of the defects of hydrogen bond structure as charge carriers in solitonic models of the proton transfer are computed; the critical value of the proton deficit needed for the emergence of such carriers as ground states in incommensurable structures is found. It is shown that single macromolecules cannot serve as effective primary receptors of the influence of weak microwave emissions upon bioobjects.

In the second part a novel approach to the problem of the charge(substrate)-conformation interactions is developed. Within it, the charge transitions along the reaction coordinate serve as a source of a specific non-additive and non-multiplicative discrete noise acting, apart from the standard thermal noise, upon the continuous structural coordinate. A relevant stochastic theory is constructed and its adiabatic approximation to the case of slow structural movements is evolved. For the dichotomous “excitation-recombination” model the exact solution is obtained, the phase diagram of the system is constructed and non-equilibrium phase transitions controlled by the excitation intensity are described. A Fokker-Planck equation for the distribution function in the structural variable with the effective drift and diffusion parameters is derived. It is shown that the changes in the functional regimes (e.g., in charge transfer or ligand binding capabilities) of the macromolecule can be adequately described with the help of the effective non-equilibrium adiabatic potential and its transformations governed by the intensity of the reaction initiation.

These theoretical statements and results are applied to the primary photochemical reactions of the electron transfer in the pigment-protein complex of the photosynthetic reaction centre (RC). It is shown that the so-called dark and light conformations of the RC do not actually correspond to the conventional standpoint of different fractions of the RC ensemble but reflect the RC protein structure rearrangements co-ordinated with the electron flow. The changes in the latter entail the emergence, co-existence and disappearance of the corresponding conformations. For the redox reactions in the RC the hysteresis, bistability and adaptation effects in their kinetic and steady-state parameters are discovered as hallmarks of self-organization in this object. Also, the effects of structural memory of the RC protein that extends longer than the time of an elementary electron turnover in it are proved as well as their decisive role in the RC capability for self-regulation of its principal function - charge separation. These findings are confirmed by the results of comprehensive computer modelling and collaborative work with several independent experimental laboratories. Taken together, they represent a clear evidence in favour of the proposed and developed concept of dynamical molecular self-organization as one of the principal mechanisms of the functioning of macromolecules.

Key words: single molecule reactions, charge(substrate)-conformation interactions, charge transfer, structure-function coupling, stochastic processes, non-equilibrium phase transitions, photosynthetic reaction centre.

Проблема взаємозв'язку структури і функції є однією з центральних у фізиці макромолекул. Навіть “елементарні” реакції, здійснювані макромолекулами (перенос енергії і заряду, сорбція-десорбція лігандів, тощо) є насправді дуже складними внаслідок очевидного багаточастинкового аспекту задачі. При заданій структурі, що зберігає квазірегулярність (а іноді і квазіодновимірність), застосування методів теорії твердого тіла часто буває досить успішним. Якщо ж реакція супроводжується значними структурними (конформаційними) змінами, виявлення загальних принципів і конкретних фізичних механізмів, що обумовлюють її ефективність, набагато ускладнюється. Удосконалення методів рентгеноструктурного аналізу, ультрачутливої флуоресцентної спектроскопії та ін. дозволило визначити статичні структурні параметри багатьох найважливіших комплексів біополімерів з ангстремною точністю і простежити за інтегральною кінетикою реакцій на рівні окремих макромолекул. Однак прямі розрахункові методи на зразок молекулярної динаміки не виходять за рамки наносекундного діапазону, що дуже далеко від часів реальних реакцій білків, не говорячи вже про повільні адаптаційні процеси, обумовлені конформаційним регулюванням, особливо при повторюваних актах реакції. Для таких процесів мікроскопічні розрахунки ab initio навряд чи коли-небудь виявляться можливими і доцільними взагалі. У цій ситуації зростає необхідність у надійних евристичних методах, здатних виявити основні принципи функціонування макромолекул, зв'язані як з їхньою полімерною будовою, так і особливо зі структурною лабільністю. Остання дозволяє макромолекулам бути не тільки пасивним постачальником каналу реакції, але й його активним регулювальником і перетворювачем.

Квантово-класична природа макромолекул і виражена ієрархія часових масштабів рухів у ній підказують ідею поділу ролей швидких і повільних ядерних зміщень. Швидкі, що мають характер коливальної релаксації (10-¹⁰с і швидше) здебільшого формують вид елементарних констант реакції. Повільні ж структурні моди (від мілісекунд і набагато довше) модифікують ці константи, аж до зміни самого характеру реакції. У випадку багаторазових актів реакції (потоку частинок чи енергії, що оброблюється макромолекулою) між структурою і функцією може виникнути зворотний зв'язок, оскільки повільні структурні зміни, внесені окремими циклами, можуть накопичуватися, змінюючи сам елементарний цикл. Тоді виникають умови для молекулярної саморегуляції і самоорганізації шляхом нерівноважних фазових переходів, із граничним утворенням нових стійких функціональних станів, явищами бістабільності, гістерезису і т.п.

Розвиток такої концепції “молекулярної синергетики” і складає основну ідею дисерта-ції. Виходячи лише з двох основних положень - повільної структурної мінливості макромолекул і потокових умов їхнього функціонування, - будується послідовна стохастична теорія структурної саморегуляції реагуючих макромолекул як явища динамічної самоорганізації, можливої в рамках навіть однієї макромолекули чи її структурно-лабільного фрагмента. На основі загальної теорії формулюється ряд конкретних висновків щодо бістабільної та адаптивної поведінки макромолекул, виявлення ефектів структурної пам'яті в їхніх реакціях. У комплексних дослідженнях, виконаних разом зі співробітниками експериментальних лабораторій в Україні (ІФ НАНУ, відділ фізики біологічних систем) і за рубежем (МДУ; Макс-Планк-ін-т радіаційної хімії, ун-т Каліфорнії) доведена наявність таких ефектів у реакціях електронного транспорту в одній з найважливіших біомолекулярних систем - фотосинтетичному реакційному центрі (РЦ).

Актуальність теми. Необхідність розвитку нових, заснованих на ідеї структурної саморегуляції підходів до дослідження реакцій одиночних макромолекул диктується, з одного боку, потребами молекулярної електроніки і нанотехнологій, спробами створення ефективних “молекулярних приладів” і елементної бази комп'ютерів нових поколінь. З іншого, вона є першочерговою для розуміння принципів роботи біомолекулярних машин. Саме для біомолекул конформаційна рухливість є головним чинником унікальної ефективності їхніх реакцій, граничної та адаптивної поведінки, що визначає їхнє функціонування в істотно нерівноважних умовах, неодмінних для живих систем. Дослідження ж реакцій у базових біофізичних моделях типу фотосинтетичного РЦ, крім важливості для проблеми фотосинтезу як такої, дозволяє переконатися, як складні релаксаційні властивості макромолекул позначаються на конкретних взаємозв'язках структури та функції. Важливість стадії повільних конформаційних змін - наприклад, для імітації кооперативних ефектів навіть у протомерних білках-ферментах (Рабин, 1967), для розвитку механічної концепції “макромолекула-машина” (Блюменфельд, Чернавський, 1973) або ж для регуляції зв'язування лігандів завдяки дифузії уздовж структурної координати, “перпендикулярної” до координаті реакції (Агмон, Хопфілд, 1983) - неодноразово обговорювалася в літературі. Однак внаслідок обмеження або лінійними схемами стандартної хімічної кінетики з невеликим набором фіксованих конформацій, або аналізом лише поодинокого акту реакції, ці моделі не могли відбити головний твірний фактор субстрат-конформаційних взаємодій у нерівноважних умовах: виникнення нових самоорганізованих режимів функціонування.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дослідження, що склали зміст дисертації, проведені відповідно до таких державних науково-дослідних тем Інституту теоретичної фізики ім. М.М. Боголюбова НАН України: “Квантовомеханічні дослідження переносу електронів і іонів у біосистемах” (№ д.р. 80066856); “Дослідження динамічних і кінетичних процесів в іон-провідних мембранах і фотоактивних середовищах” (№ д.р. 01.85.0002693); “Дослідити солітонні та інші механізми транспорту і збереження інформації в молекулярних системах з метою видачі рекомендацій для створення перспективних приладів молекулярної електроніки” (шифр 1.3.1, пост. Президії. АН УРСР №1574 від 04.09.86р.); “Дослідити методами обчислювального експерименту молекулярно-статистичні характеристики фазових переходів в обмежених об'ємах рідин” (шифр 1.3.1.7, № д.р. 01900036962); “Структурні особливості взаємодії кластерів води і молекулярних агрегатів” (№ д.р. 0199U001615); вони були також пов'язані з темами Інституту фізики НАНУ “Експериментальні та теоретичні дослідження фізичних механізмів функціонування макромолекул та їх комплексів в нерівноважних умовах та під дією зовнішніх чинників” (шифр 1.4.1.В/56, № д.р. 0199U000657); “Дослідження структурних особливостей та нелінійної динаміки біологічних макромолекул та утворених ними структур” (шифр 1.4.1.В/81, № д.р. 0102U000596); “Електронні та іонні процеси в біологічних об'єктах та органічних напівпровідниках” (шифр 1.4.1.ВЦ/99, № д.р. 0102U007063) та комплексною програмою МНДЦ “Відгук” (етап 25.1 “Фізичні моделі резонансного впливу електромагнітного випромінювання КВЧ-діапазону на біомолекулярні структури” замовлення-наряду ДКНТ і Президії АН СРСР №278/141 1986р.) й україно-німецьким проектом “Self-regulation phenomena in intra- and inter-molecular electron transfer” (Volkswagenstiftung, grant 1/73491 1997р.).

Мета і задачі дослідження. Основною метою є визначення фізичних механізмів реакцій макромолекул, зв'язаних у загальному випадку з можливістю повільних структурних змін останніх. Це визначило такі основні задачі:

Розробка теоретичних методів, що дозволяють виявити кінетичні механізми реакцій переносу заряджених частинок при заданій структурі макромолекули.

Побудова стохастичної теорії явищ молекулярної самоорганізації з урахуванням структурної мінливості реагуючих макромолекул.

Виявлення й опис ефектів структурної пам'яті в реакціях макромолекул на прикладі електронного транспорту в конкретній макромолекулярній системі (фотосинтетичному реакційному центрі).

Методи дослідження. У роботі використані: методи квантової статистики і теорії необоротних процесів, методи якісного аналізу нелінійних рівнянь, методи теорії випадкових процесів, методи комп'ютерного моделювання.

Наукова новизна одержаних результатів. З нових наукових положень і результатів дисертації, одержаних вперше, можна відзначити наступні:

Концепція динамічної молекулярної самоорганізації: Зворотний зв'язок між повільними структурними перебудовами макромолекули і швидкими повторними актами виконуваної нею реакції здатний забезпечити граничне виникнення/зникнення стійких режимів її функціонування шляхом нерівноважних фазових переходів.

Твердження: Функціональна активність макромолекули може бути адекватно описана введенням узагальненої структурної змінної, що інтегрує складні процеси повільної релаксації макромолекули.

Концепція, у рамках якої заряд(субстрат)-конформаційні взаємодії розглядаються як вплив на структурну підсистему макромолекули неадитивного і немультиплікативного дискретного шуму, генерованого переходами заряду (субстрату) у макромолекулі.

Побудовані стохастичні рівняння і виведені рівняння еволюції системи (макромолекула + потік зарядів) з урахуванням дискретного і теплового шумів. Отримано рівняння для повільної структурної змінної у вигляді рівняння Фокера-Планка з ефективними параметрами дрейфу і дифузії.

Отримано точне рішення стохастичної задачі про вплив на структурну перемінну дихотомічного шуму зі зворотним зв'язком. Для актуальної моделі “збудження-рекомбінація” побудована фазова діаграма системи та описані нерівноважні фазові переходи по інтенсивності збудження.

Показано, що функціональні режими макромолекули описуються за допомогою ефективного нерівноважного адіабатичного потенціалу, керованого інтенсивністю ініціювання реакції.

Виявлені та описані гістерезисні, бістабільні та адаптаційні явища у редокс-реакціях кофакторів фотосинтетичного РЦ внаслідок світлоіндукованих структурних змін макромолекули РЦ, самоузгоджених з повторними актами електронного транспорту. Визначені структурні та релаксаційні параметри РЦ, а також параметри електрон-конформаційної взаємодії, що зумовлює його функціональні структурні перебудови.

Методами комп'ютерного моделювання процесів стаціонарного та імпульсного збудження для первинних фотохімічних редокс-реакцій у РЦ доведена наявність ефектів його структурної пам'яті, що триває за межами елементарного оберту електрона в ізольованому РЦ (результати пп.7-8 підтверджені у сумісних теоретико-експериментальних дослідженнях). Розвинуто метод розрахунку статистичних характеристик реакцій поодинокої макромолекули, що враховує ефекти її структурної пам'яті. Виявлені якісні та кількісні відмінності цих характеристик від отриманих у рамках стандартної хімічної кінетики.

Побудовано кінетичний формалізм, що дозволив виділення і повну класифікацію фізичних механізмів реакцій переносу заряджених частинок через малонаселені проміжні стани макромолекули при заданій структурі останньої. У рамках єдиної схеми визначені адитивні внески цих механізмів у швидкість реакції. Встановлено критерій застосовності кінетичних рівнянь при змінній температурі, що обґрунтовує низку неізотермічних методів дослідження реакцій. Запропоновано та застосовано метод визначення параметрів конформаційних переходів шляхом неквазістатичного охолодження.

Обчислено рухливість і інші кінематичні і динамічні характеристики дефектів воднево-зв'язаних ланцюжків як носіїв заряду в солітонних моделях протонного транспорту при накладенні зовнішніх полів (однопольові однокінкові моделі). Визначені граничні значення протонного дефіциту для виникнення таких носіїв як основного стану несумірних структур.

Показано, що окремі макромолекули не можуть бути ефективним первинним рецептором впливу слабких мікрохвильових випромінювань на біооб'єкти.

Практичне значення одержаних результатів. Розвинута в дисертації концепція молекулярної самоорганізації підкреслює здатність поодиноких макромолекул до активної перебудови своїх функціональних властивостей відповідно до змін умов функціонування. Це відкриває принципово нові шляхи нелінійного регулювання біохімічних реакцій, починаючи з процесів сорбції-десорбції лігандів (винятково важливих у фармакології чи розробці біосенсорів), трансмембранного переносу та розділення зарядів (як ефективного механізму перетворення і запасання енергії), тощо. Тригерні та кооперативні ефекти, зумовлені структурною лабільністю макромолекул, значно поширюють можливості конструювання елементарних приладів молекулярної електроніки. Запропоновані алгоритми обчислення статистичних характеристик реакцій поодиноких макромолекул дозволяють більш надійно визначати стадії ензиматичних реакцій. Висновки щодо дії слабких мікрохвильових випромінювань на макромолекули були важливими для проблеми первинної рецепції цих випромінювань біооб'єктами та подальших досліджень, пов'язаних з методами мікрохвильової резонансної терапії, у МНДЦ “Відгук”. Ряд результатів (метод неквазістатичного охолодження, тести на структурні лабільність та пам'ять) суттєво спрощує відповідні експериментальні процедури і вже був застосований на практиці.

Особистий внесок здобувача. Всі результати дисертації отримані здобувачем особисто. У роботах із співавторами здобувачу належить провідна роль у постановці задач, інтерпретації результатів та інших компонентах робіт, крім експериментальної частини робіт [19,24,25,27]. У роботах [1-3,8] автору належать метод виключення віртуальних процесів; класифікація внесків елементарних механізмів у загальну ефективність реакції; результати для випадків сильного зв'язку проміжних станів з коливаннями; у роботах [4,29] - отримання основного рівняння методу та критерію справедливості кінетичних рівнянь при перемінній температурі, ідея експерименту і вибір об'єкта для нього; у роботах [6,11,30] - одержання виразів для рухливості дефектів у зовнішніх полях у однокомпонентних кінкових моделях, що точно вирішуються, та результати з опису дефектів як несумірних структур; у роботах [7,9,15,31] - одержання результатів у моделях полімеру в ролі антени і впливу електромагнітного поля на форму полімеру та зарядовий транспорт, а у [32-34] - розділи щодо феноменологічних аспектів теорії впливу слабких мікрохвильових випромінювань на біооб'єкти та механізмів первинної рецепції цих випромінювань; у роботах [10,28] - одержання всіх аналітичних результатів; у роботі [22] - одержання прямих рівнянь еволюції, процедура адіабатичного виключення й одержання ефективного рівняння Фокера-Планка, результати для випадку двох станів; у роботі [26] - опис переносу електрона від первинного до вторинного акцептора РЦ у неперервних дифузійних моделях.

Апробація результатів дисертації. Результати, що включені в дисертацію, доповідались у багатьох провідних наукових центрах України і колишнього СРСР (ІТФ та ІФ НАНУ, ХІРЕ, МДУ, Інститути хімічної фізики, фізичної хімії, електрохімії РАН та ін.), Німеччини (Інститут Гана-Майтнер (Берлін), Макс-Планк-Інститут радіаційної хімії (Мюльхайм); в останньому на їх основі здобувачем прочитаний курс лекцій з самоорганізації у макромолекулярних системах. Результати сумісних з німецькими колегами робіт були в 2002г. премійовані дослідницьким грантом Німецької служби академічного обміну (DAAD)). З міжнародних наукових зібрань, на яких вони доповідалися, можна навести такі:

5 симп. “Ультрашвидкі явища у спектроскопії” (Вільнюс, 1987); 4 та 5 конф. з молекулярної електроніки (Гейтсберг, США, 1993; Гоа, Індія, 1994); 7 та 8 конф. з протонних провідників (Швабіш Гмюнд, Німеччина, 1994; Гуль, Норвегія, 1996); конф. НАТО з фізичних явищ у м'яких конденсованих середовищах (Гейло, Норвегія, 1995, 2001, 2003); 3 симп. зі статистичної фізики (Тайбей, Тайвань, 1995), 4 конф. “Структури, нелінійна динаміка та стохастика складних просторово розподілених систем” (Будапешт, Угорщина, 1997), 2, 3 та 5 Фольксваген-симп. з електронного транспорту (Клостер-Банц, 1998р., Констанц, 1999р. та Хемніц, 2001р., усі в Німеччині); 7 та 9 конф. з тонких плівок (Потсдам, Німеччина, 1998 та 2000рр.); 11 Всесвітній конгрес з фотосинтезу (Будапешт, Угорщина, 1998р.); 3 Європ. біофіз. конгрес (Мюнхен, Німеччина, 2000р.); 46 збори амер. біофіз. товариства (Сан-Франціско, США, 2002р.); конф. “Сучасні проблеми теоретичної фізики” (Київ, 2002р.) та багато інших.

Публікації. Результати дисертації представлені у 57 наукових працях, у тому числі 28 публікаціях у фахових виданнях (24 у журналах, 4 - в книгах та збірниках наукових праць), 7 - в препринтах Інституту теоретичної фізики АН УРСР та брошурі, виданій МНДЦ “Відгук”, 22 - в тезах міжнародних конференцій, симпозіумів, конгресів.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається з передмови, вступу, восьми розділів, висновків та додатків. Повний обсяг дисертації становить 348 сторінок, з яких додатки займають 19 сторінок. Дисертація містить 65 рисунків (з котрих 13 займають повну сторінку) та 1 таблицю. Список використаних бібліографічних джерел (353 найменування) займає 35 сторінок.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ