Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Зміна кінетики процесу квантового вивільнення медіаторів в хромафінних клітинах щура при різних типах стимуляції

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Останнім часом питанням вивчення процесів екзоцитозу в хромафінних клітинах приділяється особлива увага. Це пов`язано в першу чергу з тим, що дані процеси мають спільні загальні риси з явищами швидкого вивільнення медіатора в нейронах і тому можуть використовуватись як експериментальні моделі для дослідження синаптичної передачі. Однак наявність різних типів Са<sup>2+</sup>-каналів і популяцій везікул, що здатні секретувати з різними затримками, та існування механізмів клітинних адаптацій формує унікальну цілісну систему, що може добре модулюватись. Хоча, в основному, інформація про ці процеси стала відомою лише декілька останніх десятиліть, однак в багатьох випадках ми не можемо поки з`ясувати, як всі можливі рівні модуляції насправді використовуються клітиною при її нормальному функціонуванні. Гормони симпатоадренальної системи хоча і не є життєво необхідними, їх роль в організмі надзвичайно важлива: саме вони забезпечують адаптацію до гострих та хронічних стресів. Адреналін та норадреналін є основними елементами реакції «боротьби-або-втечі». Відповідь організму на стрес включає в себе швидку інтегровану перебудову багатьох складних процесів, що безпосередньо приймають участь в даній реакції (мозок, м`язи, серцево-судинна система тощо). Чітка регуляція процесу вивільнення необхідна, в першу чергу, для нормального функціонування як самих клітин, так і організму в цілому. Так в хромафінних клітинах, що містять в високих концентраціях адреналін, норадреналін та інші біологічно активні речовини, така регуляція, беззаперечно, необхідна для запобігання масивного неконтрольованого вивільнення катехоламінів в систему кровообігу, що може призводити до важких патофізіологічних ушкоджень і навіть смерті всього організму. Факт, що цей модуляторний механізм також присутній в хромафінних клітинах людини, посилює його фізіологічну та патофізіологічну цінність. Численні протиріччя і навіть діаметрально протилежні висновки в результатах наукових робіт по вивченню зв`язку кальцієвих каналів і ацетилхолінових рецепторів з процесом екзоцитозу в хромафінних клітинах та можливі відмінності в механізмах запуску секреції при різних типах клітинної стимуляції вказують на значну невивченість даних процесів. Надзвичайна складність досліджень даного плану пов`язана з необхідністю комплексного підходу до вивчення всієї сукупності регуляторних клітинних механізмів, що виникають при процесі вивільнення в хромафінних клітинах. Так, пригнічення або виокремлення якогось одного з можливих способів ініціації процесу секреції при певному експериментальному підході може призводити до зміни характеристик інших шляхів запуску екзоцитозу. Таким чином, дослідження впливу зміни тривалості та типу стимуляції, що адекватно моделюють різні фізіологічні та патофізіологічні стани збудливості хромафінних клітин, представляє безсумнівний науковий інтерес та практичне значення.

Зв`язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана в рамках наукової програми відділу загальної фізіології нервової системи Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України: «Молекулярні механізми, відповідальні за специфіку функцій різних мозкових структур».

Мета дослідження. Враховуючи вищесказане, мета даної роботи полягала в дослідженні зміни кінетики квантового вивільнення медіаторів в залежності від типу та тривалості стимуляції в хромафінних клітинах.

Завдання дослідження.

· Визначити властивості електродів з карбоновими волокнами та показати адекватність їх використання в електрофізіологічних дослідженнях на рівні окремих клітин. Удосконалити метод ідентифікації медіаторів, що секретуються хромафінними клітинами та довести ефективність його застосування при реєстрації процесу екзоцитозу.

· Дослідити кінетичні характеристики процесу вивільнення медіаторів з окремої хромафінної клітини при малих тривалостях стимулу, які можуть виникати в нормальних фізіологічних умовах, з використанням принципово різних агентів, що викликають секрецію.

· Визначити часову динаміку процесу екзоцитозу при екстремальних умовах збудження клітини, які виникають при важких патологічних порушеннях в організмі, використовуючи два окремих способи ініціації процесу вивільнення, що існують в хромафінних клітинах.

· Охарактеризувати зміни часової динаміки окремої секреторної події при різних типах стимуляції. Розробити теоретичну модель, що адекватно описує ці процеси.

Наукова новизна одержаних результатів. В дисертаційній роботі досліджено вплив параметрів стимуляції на інтенсивність та часову динаміку квантового вивільнення медіатора хромафінними клітинами. Вперше показано, що тривалість стимуляції прямо визначає кінетичні та функціональні характеристики процесу екзоцитозу. Так при короткотривалому збудженні, що існує при нормальному функціонуванні організму, загальна кількість вивільнених катехоламінів практично не залежить від способу активації, тоді як при довготривалій стимуляції, що виникає внаслідок важких патологічних порушеннях, активація ацетилхолінових рецепторів буде відігравати ключову роль підтриманні постійного рівня процесу екзоцитозу в хромафінних клітинах. Вперше показано, що кінетичні особливості процесу вивільнення окремого секреторного кванту суттєвого залежить від типу активації хромафінних клітин. Вперше охарактеризовано три різних профілі часової динаміки окремих секреторних подій, які виникають при різних станах фізіологічної активності клітин, та показано, що така гетерогенність може виникати внаслідок зміни радіусу секреторної пори, яка утворюється при злитті везікули з плазматичною мембраною, ймовірно внаслідок дії специфічних рецептор-опосередкованих процесів. Отримані експериментальні дані суттєво доповнюють сучасні уявлення відносно властивостей та механізмів процесу екзоцитозу від окремих хромафінних клітин при різних типах та тривалостях стимуляції.

Теоретичне та практичне значення одержаних результатів. Результати дисертаційної роботи перш за все представляють фундаментальний інтерес, оскільки отримані принципово нові дані про вплив типу та тривалості параметрів різних стимулів як на загальну кінетику процесу екзоцитозу, так і на часову динаміку вивільнення індивідуального секреторного кванту. Визначення ефективності різних агентів ініціювати процес екзоцитозу при різних станах фізіологічної активності хромафінних клітин допоможе знайти ефективні засоби, які будуть перешкоджати неконтрольованому масивному вивільненню адреналіну та норадреналіну в систему кровообігу при різного роду ураженнях та стресових ситуаціях, що може призводити до важких патофізіологічних станів (інфаркт міокарду, шок, аритмія тощо) і навіть до смерті всього організму. Крім того, в даному дослідженні було вдосконалено метод визначення типу нейротрансміттера за допомогою електродів з карбоновими волокнами при використанні різних тестуючих потенціалах безпосередньо під час реєстрації процесу вивільнення в електрофізіологічних експериментах. Запропонована в цій роботі нова теоретична модель процесу екзоцитозу окремої секреторної везікули є достатньо універсальною і тому може бути використана для моделювання часової динаміки вивільнення в інших типах клітин (зокрема для аналізу синаптичної передачі в нейронах) та для опису різних способів процесу злиття («kiss-and-run», повне злиття).

Особистий внесок здобувача. Робота по налагодженню електрофізіологічної установки, виділення окремих хромафінних клітин, електрофізіологічні досліди по реєстрації процесу секреції, обробка експериментальних даних, аналіз та узагальнення результатів досліджень були виконані особисто автором. Здобувач приймав активну участь у розробці концепції роботи, обговоренні й редагуванні результатів та формуванні висновків.

Апробація результатів дисертації. Загальні положення роботи докладались на І конференції Українського товариства нейронаук (Київ, 24-26 листопада 1998 р.), на міжнародній школі-семінарі «Мембрани та сигнали» (Київ, 3-8 вересня 2000 р.), на конференції «Bogomoletz-Nencki Meeting» (Сулейов, Польща, 7-8 травня 2001 р.), на ІІ конференції Українського товариства нейронаук (Донецьк, 30 травня-4 червня 2001 р.), на «Second Bogomoletz-Nencki Symposium. Intracellular signalling in excitable cells» (Київ, 1-3 вересня 2002 р.).

Публікації. По результатам роботи опубліковано 3 статті та тези 3 доповідей в наукових журналах.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається зі вступу, огляду літератури, матеріалів та методів дослідження, результатів досліджень, обговорення результатів, висновків та списку використаних джерел із 242 найменування. Робота викладена на 172 сторінках та ілюстрована 46 рисунками.

Основний зміст роботи

У вступі обґрунтована актуальність дослідження впливу зміни тривалості та типу стимуляції, що моделюють різні фізіологічні та патофізіологічні стани збудливості хромафінних клітин, сформульована мета та задачі дослідження, наведені відомості про наукову новизну, практичну цінність та апробацію отриманих результатів, публікацію матеріалів дисертації.

Розділ 1 «Огляд літературних даних» присвячений висвітленню відомих аспектів процесів вивільнення в нейроендокринних клітинах, їх спільні та відмінні риси з явищами швидкого вивільнення медіаторів в нейронах. Розглянуті властивості секреторних везікул в хромафінних клітинах, а також дві різні моделі їх злиття з мембраною. Охарактеризовані різні типи потенціал-залежних Са²⁺-каналів, ацетилхолінових рецепторів та їх зв`язок з процесом екзоцитозу в хромафінних клітинах. Висвітлені кінетичні характеристики явища вивільнення катехоламінів та можливі шляхи модуляції процесу секреції. Критично проаналізовано численні протиріччя в результатах наукових робіт та обгрунтовано актуальність дослідження динаміки процесу вивільнення катехоламінів при різних станах збудливості клітини.

Для досягнення поставленої мети у розділі 2 «Матеріали та методи дослідження» описано використання наступних методичних підходів:

· виділення гостроізольованих хромафінних клітин щура;

· реєстрація за допомогою електрохімічного методу процесу секреції шляхом використання електроду з карбоновим волокном;

· флуоресцентний метод вимірювання внутрішньоклітинної концентрації іонів Са²⁺;

· статистична обробка отриманих результатів з використання стандартних методів аналізу;

· теоретичне моделювання динаміки вивільнення, використовуючи стандартні методи математичної фізики.

Виділення гостроізольованих хромафінних клітин щура. В експериментах використовувались дорослі (56 місяців) самки білих щурів лінії Вістар. Процедура декапітації щура проводились у відповідності з вимогами НАН України по використанню експериментальних тварин. Виділені наднирники інкубувались на протязі 30 хвилин при 37С в стандартному розчині DPBS (9.6 гр/літр), що містив фермент колагеназу тип ІА (Sigma, США) в концентрації 0.5 мг/мл та 0.3 мг/мл. Для усування залишків та запобігання подальшої дії ферменту зрізи інкубувались в насиченому розчині білка альбуміну 1 мг/мл (Sigma, США) на протязі 10 хвилин. Окремі хромафінні клітини отримувались за допомогою м`якого, повільного піпетування з використанням піпеток різного діаметру не менше 15 хвилин.

Електрохімічний метод реєстрації процесу секреції. Для реєстрації вивільнення катехоламінів в хромафінних клітинах використовувались електрохімічні методи детектування, що основані на окисленні або відновленні специфічних сполук. Коли молекули, що легко окислюються (або відновлюються), дифундують до поверхні електроду, виникає хімічна реакція (рис. 1) і утворені в результаті електрони переходять через поверхню, викликаючи електричний струм. Найбільш поширеними в електрофізіологічних експериментах є електроди з карбоновими волокнами, оскільки вони мають більш стабільні електрохімічні властивості. Окреме карбонове волокно діаметром 10м та довжиною 6-8 см розташовується всередині поліетиленової трубки. За допомогою двох пар малих пінцетів трубка з волокном симетрично розташовується над нагрітою до 200-250С спіраллю. Потім кожний кінчик вставляється приблизно на 3-5 мм задньою стороною в скляний капіляр Безпосередньо перед експериментом кінчик електроду обрізається на відстані приблизно 20м від місця, де візуального вже не спостерігається поліетилен. Схема готового електроду представлена на рис. 2.

Вимірювання індукованих кальцієвих транзієнтів. Свіжоізольовані хромафінні клітини інкубували протягом 30 хв. при температурі 37°С в зовнішньоклітинному розчині, що містив 1-2мкМ FURA-2АМ (Molecular Probes, США). Після цього клітини відмивались чистим зовнішньоклітинним розчином і залишали в темряві при кімнатній температурі на 30-40 хвилин для завершальної деестерифікації FURA-2АМ. Збудження флуоресцентного зонду здійснювалось при довжинах хвилі 360 та 380 нм за допомогою відповідних фільтрів. Зареєстровані сигнали подавались на вхід LPS-150 (Till Photonics, Японія), який в реальному масштабі часу розраховував відношення флуоресцентних сигналів на двох довжинах R=F1/F2.

Електрофізіологічні вимірювання. Для реєстрації квантового процесу вивільнення використовувались наступні розчини, у мМ: контрольний - NaCl 130, KCl 5, CaCl₂ 2, MgCl₂ 2, HEPES 10, глюкоза 10, рH 7.3; деполяризуючий розчин - NaCl 85, KCl 50, CaCl₂ 2, MgCl₂ 2, HEPES 10, глюкоза 10, рH 7.3. Для визначення вкладу ацетилхолінових рецепторів в контрольний розчин додавались відповідні агоністи, у мМ: ацетилхолін 1, пілокарпін 1, нікотин 0.15. Чашка Петрі з клітинами розташовувалась в полі зору інвертованого мікроскопу Olympus IX70 (Токіо, Японія) з короткофокусним об`єктивом зі збільшенням 40^х. Електрод з карбоновим волокном за допомогою мікроманіпулятора підводився на якомога меншу відстань до досліджуваної клітини. Для реєстрації індукованих електричних струмів використовувався підсилювач ЕРС-9 (НЕКА, Ламбрехт, Німеччина). В конфігурації «Швидка циклічна вольтамперометрія» на електрод подавалась періодична напруга трикутної форми від -700 до +900мВ з швидкістю наростання 400В/сек. Визначення характеристик карбонових електродів проводилось за допомогою аплікації в робочу камеру різних катехоламінів: адреналіну, норадреналіну, допаміну та серотоніну (всі виробництва Sigma, США) в концентрації 1мМ. Реєстрація окремих секреторних піків відбувалась в конфігурації «Амперометрія», при прикладанні на електрод постійного потенціалу +600мВ. Вихідний сигнал підсилювача фільтрувався при частоті зрізу 3кГц за допомогою трьохполюсного фільтру Бесселя та 10кГц цифровим фільтром. Всі величини представлені як середнє значеннястандартна помилка (SEM). Статистичні відмінності були оцінені за допомогою стандартних методів із рівнем достовірності р.

У третьому розділі «Результати досліджень» експериментально визначені кінетичні особливості квантового процесу вивільнення медіаторів при моделюванні різних умов збудливості хромафінних клітин.

Властивості електродів з карбоновими волокнами. Для застосування електродів з карбоновими волокнами в електрофізіологічних експериментах було проведено ряд досліджень по визначенню їх властивостей. Спочатку досліджувався вплив суміші медіаторів на електрод з карбоновим волокном. Отримана циклічна вольтамперограма аплікації на електрод суміші серотоніну та допаміну представлена на рис. 3. Якщо теоретично змоделювати цю ситуацію, побудувавши циклічну вольтамперограму, яка буде суперпозицією вольтамперограм, отриманих окремо для кожної сполуки при таких концентраціях (рис. 4), то вона буде майже ідентичною (по положенням окислювального та відновлюваного піків) до отриманої експериментально. Це свідчить про те, що кожний з медіаторів окислюється (або відновлюється) незалежно від іншого і результуюча циклічна вольтамперограма є не що інше, як проста сумація вольтамперограм усіх компонент.

Далі було проведено калібрування чутливості електродів з карбоновим волокном при різних концентраціях медіатора. В конфігурації «Амперометрія» при подаванні на електрод постійного потенціалу +600мВ реєструвались зміни дифузійного струму при аплікації розчинів, що містили 1; 10; 100; 200 та 500М адреналіну. Отримані значення чутливості електродів від концентрації медіатора (рис. 5) добре апроксимуються лінійною залежністю з коефіцієнтами 9.180.03 та 1.332.90 відповідно (р<0.001). Наступним етапом було досліджено чутливість електродів з карбоновими волокнами до різних сполук, що можуть секретуватись хромафінними клітинами при прикладанні певних калібрувальних потенціалів. В якості досліджуваних речовин використовувались однакові (20мкМ) концентрації адреналіну та норадреналіну, що аплікувались на той самий електрод. Реєстрація струму проводилась в конфігурації «Амперометрія», електродний потенціал складав відповідно +400; +500 та +600мВ. Для порівняння чутливості карбонового електроду до цих катехоламінів було проведено нормування зареєстрованих значень дифузійних струмів до відповідних величин, отриманих при потенціалі +600мВ. Таким чином, дифузійні струми, отримані при аплікації норадреналіну та адреналіну, проявляють різну потенціалзалежність (рис. 6).

Тобто за допомогою такого експериментального підходу можна розрізняти тип медіатора, що вивільняється окремою хромафінною клітиною (адренергічні та норадренергічні клітини). Для цього необхідно визначити найбільш достовірну амплітуду зареєстрованих квантових подій вивільнення в конфігурації «Амперометрія» при різних потенціалах на вимірювальному електроді (+400; +500 та +600мВ), та побудувати відповідну калібрувальну характеристику. Визначивши потенціалзалежність такої характеристики, можна з високою ступінню ймовірності робити висновок про тип медіатора, що вивільняється певною окремою клітиною. В подальших дослідах не проводилось визначення типу медіатора в кожній окремій клітині.

Кінетичні фази процесу вивільнення від окремої хромафінної клітини при короткочасній стимуляції. Наступна серія експериментів була присвячена дослідженню динаміки процесу вивільнення від окремої хромафінної клітини. Для цього застосовувалось два способи ініціації процесу екзоцитозу: активація нікотинових та мускаринових рецепторів за допомогою аплікації їх агоніста ацетилхоліну (АХ) в концентрації 1мМ та деполяризація клітини розчином, що містив підвищену концентрацію KCl (50мМ). Аплікація протягом 2.5 секунд клітини АХ призводила до помітного процесу вивільнення, що тривав ще протягом 2025 секунд після припинення стимуляції (рис. 7). При цьому можна виділити 2 кінетичних фази процесу екзоцитозу: «швидку», що тривала 57 секунд після початку стимуляції і «залишкову», тривалість якої складала 1015 секунд. Ці фази розрізнялись перш за все своєю інтенсивністю. Так, середня частота появи амперометричних піків. під час першої фази складала 2.00.3с^-1 (n=15), тоді як для другої фази ця величина становила всього 0,580,08с^-1 (n=15). Деполяризація клітини розчином, що містив підвищену концентрацію KCl (50мМ) протягом 2.5 секунд, теж ініціює значний процес вивільнення (рис. 8). Як і в попередньому випадку, можна було розрізнити 2 кінетичних фази, однак їхні характеристики були дещо відмінними. Так, середня частота появи секреторних подій під час «швидкої фази» складала 4.90.7с^-1 (n=7), що є достовірно вище, ніж в попередньому випадку (р<0.001), але «залишкова фаза» характеризувалась середньою частотою виникнення амперометричних піків 0.320.07с^-1 (n=7), що достовірно нижче, ніж у випадку стимуляції клітини ацетилхоліном (р<0.05).

Часова динаміка процесу вивільнення при стимуляції клітин 1мМ АХ та 50мМ KCl дуже добре узгоджується з кінетичними характеристиками індукованих внутрішньоклітинних кальцієвих транзієнтів при таких типах стимуляції (рис. 9). Так, при короткочасовій аплікації 50мМ KCl, зареєстрований кальцієвий транзієнт мав достовірно більшу амплітуду (F1/F2=1.420.03 n=58), ніж при стимуляції клітини 1мМ АХ (F1/F2=0.880,06 n=53), але меншу тривалість (213 сек та 283 сек відповідно). Тобто, кінетичні характеристики індукованого процесу вивільнення при різних типах стимуляції можуть прямо визначатись величиною внутрішньоклітинної концентрації іонів Са²⁺ в кожний момент часу. Таким чином, при стимуляції клітини різними агентами спостерігаються очевидні відмінності в динаміці процесу екзоцитозу. Активація ацетилхолінових рецепторів може відігравати суттєву роль в пролонгації секреції в хромафінних клітинах при короткочасних стимуляціях, тоді як деполяризація клітини та відкривання потенціал-керованих Са²⁺-каналів необхідні для транзієнтної та інтенсивної клітинної відповіді.

Кінетичні характеристики процесу вивільнення при перманентній стимуляції клітини. Наступною стадією досліджень було визначення кінетичних властивостей квантового процесу вивільнення від окремої клітини при довготривалій стимуляції. Додавання в робочу камеру 1мМ ацетилхоліну призводило до стимуляції специфічних рецепторів і помітного процесу квантового вивільнення нейромедіатора (рис. 10), що тривав, по крайній мірі, декілька хвилин без помітних змін в середній частоті появи квантових подій вивільнення, після чого відбувалось припинення екзоцитозу, ймовірно, внаслідок спустошення запасів медіатора в клітині. Середня частота появи амперометричних піків, що відповідають квантовому процесу вивільнення окремої секреторної везікули, в залишковій (перманентній) фазі екзоцитозу складала 0.750.07с^-1 (n=23). При деполяризації клітини розчином, що містив 50мМ KCl (рис. 11), середня частота появи амперометричних піків під час перманентної фази вивільнення складала лише 0.280.05с^-1 (n=13). Таким чином, як і у випадку короткочасової стимуляції, середня частота появи квантових процесів вивільнення при стимуляції АХ є достовірно вища, ніж у випадку деполяризації клітини підвищеною концентрацією KCl.

В якості досліджуваних параметрів окремих подій вивільнення виступали амплітуда, ширина піку (по спаданню амплітуди до 5% від максимального значення), напівширина (по 50% спаданню), часи наростання і спаду піку та його площа (рис. 12). При обох вищеописаних типах стимуляції гістограми розподілу значень часових та амплітудних характеристик квантових подій вивільнення проявляли подібні до нормального розподілу ознаки. Проте, виявляється, що їх середні величини суттєво відрізнялись між собою (рис. 17). Таким чином в хромафінних клітинах щура спостерігається зміна кінетики процесу вивільнення при різних типах стимуляції.

Роль різних типів ацетилхолінових рецепторів в процесі квантового вивільнення катехоламінів. Для дослідження вкладу підтипів ацетилхолінових рецепторів були проведені досліди по стимуляції окремих хромафінних клітин відповідними агоністами: нікотином та пілокарпіном. Додавання в робочу камеру 1мМ пілокарпіну (Піл) викликало помітний процес вивільнення (рис. 13), середня частота появи амперометричних піків складала 0.400.04с^-1. Це достовірно нижче (р<0.001, n=20), ніж у випадку стимуляції 1мМ АХ. Перманентна стимуляція клітини нікотином (150М) викликає суттєвий процес вивільнення (рис. 14). Середня частота появи окремих секреторних піків складала 0.460.05с^-1, що теж достовірно нижче (р<0.001), ніж при стимуляції клітини 1мМ АХ.

Для статистичного аналізу характеристик окремих амперометричних піків було досліджено вибірку із 334 піків від 20 клітин у випадку стимуляції 1мМ пілокарпіну та 215 піків від 7 клітин для ініціації процесу вивільнення 150М нікотину. Отримані характеристики окремих піків теж проявляють ознаки одномодального розподілу. Порівняльний аналіз часових та амплітудних характеристик окремих секреторних відповідей при активації різних типів ацетилхолінових рецепторів не виявив суттєвих достовірних відмінностей в їх кількісних значеннях (рис. 17). Таким чином, динаміка процесу вивільнення із окремої везікули в хромафінних клітинах практично не залежить від типу активованого рецептора.

Сукупна дія активації специфічних ацетилхолінових рецепторів та деполяризації клітини гіперкалієвим розчином в ініціації процесу вивільнення. В наступній серії дослідів використовувалась сукупна дія і активації специфічних типів ацетилхолінових рецепторів, і деполяризації клітини гіперкалієвим розчином. Частота появи клітинних секреторних відповідей у випадку одночасної аплікації 50мМ KCl та 1мМ АХ була 0.600.06с^-1 (рис. 15). Для визначення вкладу підтипів ацетилхолінових рецепторів при такому способі стимуляції також було здійснено протокол одночасної стимуляції відповідних субтипів рецепторів та деполяризації клітини. На рис. 16 представлена узагальнена порівняльна характеристика значень середніх частот появи квантових подій вивільнення для всіх вищеописаних типів стимуляцій. Цікаво, що у випадку стимуляції сумішами відповідних агоністів та деполяризуючого агента відмінності в середній інтенсивності ініційованого процесу вивільнення не є статистично достовірними, як це спостерігається у випадку стимуляції клітин лише активаторами специфічних рецепторів. Також у всіх випадках відмінності в середніх значеннях появи квантових секреторних відповідей у випадку простої аплікації агоніста та того ж агоніста разом з деполяризаційним агентом теж не достовірні.

Проте, амплітудні та часові характеристики окремих квантових подій вивільнення при таких сукупних стимуляціях відрізняються як від відповідних значень при простій активації специфічних рецепторів, так і від характеристичних значень секреторних піків, отриманих при деполяризації клітини. При таких сукупних стимуляціях клітини гістограми розподілу характеристичних параметрів динаміки окремих секреторних подій вивільнення не є сумою відповідних розподілів, отриманих для простої активації специфічних рецепторів та деполяризації клітини. Отримана популяція амперометричних піків має достовірно більшу напівширину (рис. 17 частина А) та ширину (рис. 17 частина Б), ніж при стимуляції відповідного типу рецепторів, але ці параметри достовірно менші, ніж у випадку деполяризації клітини гіперкалієвим розчином. Така сповільненість проявлялась в збільшенні часів наростання та спаду. Також відбувалось статистично достовірне зменшення значення амплітуди амперометричних піків (рис. 17 частина Г) при сукупних стимуляціях в порівнянні зі значеннями, отриманими при простій активації відповідних типів рецепторів. Однак площа окремих квантових подій вивільнення при всіх досліджуваних типах стимуляції лишалась постійною (рис. 19 частина В). На рис. 18 представлена порівняльна характеристика часової динаміки окремих квантових подій вивільнення при стимуляції 1мМ АХ, 50мМ KCl та сукупній дії цих двох агентів.

Моделювання процесу вивільнення із окремої секреторної везікули за допомогою методів математичної фізики. Нехай внаслідок стимуляції клітини будь-яким специфічним активатором відбувається процес вивільнення окремої секреторної везікули (рис. 19). Нехай вимірювальний електрод знаходиться на відстані від поверхні клітини, радіус секреторної везікули , а при процесі злиття секреторної везікули з плазматичною мембраною утворюється пора, з радіусом . Оскільки в задачі є сферична симетрія, то для спрощення розрахунків можна розглядати одновимірний випадок, для трьохмірного випадку ситуація буде практично ідентичною. Припускаючи, що медіатор всередині везікули рухається вільно і знаходиться в стані спокою можна записати закон зменшення його концентрації при наявності отвору радіусу :

, (1)

де - площа пори, - концентрація молекул всередині везікули, - загальна кількість молекул речовини в момент часу , - об`єм везікули, - середня швидкість молекул медіатора. Розв'язок рівняння (1) призводить до експоненціального закону зменшення концентрації:

, (2)

тут початкова кількість молекул медіатора. Беручи до уваги наявність можливих додаткових механізмів, що призводять до вивільнення медіатора, значення експоненціальної константи буде іншим, тому в більш загальному випадку можна вважати, що

, (3)

а коефіцієнт , зважаючи на зміст величин та , визначається наступним чином: .

де , значення якої буде обговорено пізніше. Відповідне значення вихідного потоку молекул медіаторів з пори везікули має вигляд:

, . (4)

Згідно класичних фізичних уявлень про випадкове блукання часточки в нескінченному однорідному середовищі вздовж осі при наявності абсолютно відбиваючої (границя вивільнення) та поглинаючої (електрод) площин струм на електроді, що як раз і піддається експериментальній реєстрації буде складати:

(5)

Розв`язок (5) описує теоретичну оцінку, проведену згідно класичних уявлень про блукання окремої часточки. Однак зважаючи на те, що довжина вільного пробігу молекул медіатора мала в порівнянні з усіма характерними розмірами задачі, а також припускаючи, що процес розповсюдження молекул медіатора відбувається в нерухомому середовищі незмінного складу і має ізотермічний характер, зміну концентрації медіатора є сенс описати класичним дифузійним рівнянням:

. (6)

Гранична умова при відображує той факт, що всі молекули медіатора, які попадають на електрод завдяки дифузійному потоку, окислюються, а хімічна реакція (рис. 1), що до цього призводить, є реакцією першого порядку. Розв`яжемо отриману задачу операторним методом. Для цього скористаємось перетворенням Лапласа. Наближений розв`язок (6) буде мати вигляд:

(7)

Значення струму через вимірювальний електрод визначається кількістю молекул медіатора, що попадають на електрод за одиницю часу . Таким чином, можна записати:

. (8)

Оцінимо тепер числові значення всіх параметрів та коефіцієнтів, що входять до остаточного розв`язку задачі. Можна оцінити радіус везікули порядку 150 нм, радіус пори - 15 нм, - 1 мкм. Для оцінки параметру скористаємось тим фактом, що він відображає характеристичний час, за який відбувається вивільнення окремої секреторної везікули, а він корелює з шириною експериментальних амперометричних піків. Це призводить до значення сек^-1 (змінюючи коефіцієнт пропорційності ). Значення коефіцієнту дифузії для адреналіну: . Заради спрощення будемо вважати . Параметр має зміст коефіцієнта масовіддачі, а тому його можна оцінити як , де - характерний розмір системи, а - характерний час взаємодії медіатора з електродом. Оскільки мкм, а мксек, то м/сек. Однак зміна значення на декілька порядків впливає лише на амплітуду , та не впливає на його часову залежність. Застосовуючи формули (6) - (7) було отримано часові характеристики електродного струму в залежності від різних параметрів задачі. Так на рис. 20 представлені промодельовані характеристики часової динаміки процесу вивільнення в залежності від відносної зміни радіусу секреторної везікули . Збільшення або зменшення радіусу секреторної везікули призводить до пропорційної зміни концентрації медіатора на детекторі, але при цьому зміна динаміки квантового явища секреції не може бути адекватно промодельована зміною радіусу секреторної везікули. В наступній апроксимації радіус везікули лишався постійним, а змінювався радіус пори, що утворюється при злитті секреторної везікули з мембраною (рис. 21). Так при зменшенні величини відбувається істотне сповільнення часової динаміки процесу вивільнення (зростання ширини отриманих піків). Проте загальна площа піку в усіх випадках лишалась приблизно постійною. Отримані теоретичні моделювання динаміки процесу вивільнення в цьому випадку дуже добре корелюють з експериментально отриманими амперометричними піками від окремої везікули для різних типів стимуляції клітин (рис. 18). Для порівняння на рис. 23 представлена залежність теоретичної оцінки випадкового блукання окремих часточок (5) при аналогічних значеннях параметрів. Незважаючи на незначні похибки в значеннях пікових амплітуд, часова динаміка отриманих залежностей (рис. 21,23) є практично ідентичною. Для інших апроксимацій теж виявлене чітке співпадання часової динаміки. Як видно із представлених кривих (рис. 22), при зміні відстані вимірювального електроду відносно поверхні клітини не відбувається істотної зміни часової динаміки концентрації медіатора на електроді. При зростанні відстані положення максимуму промодельованого піку лише незначно зсувається вправо внаслідок виникнення дифузійної затримки. Отже, можна припустити, що експериментально зареєстрована зміна динаміки квантового процесу вивільнення при різних типах стимуляції виникає внаслідок зміни діаметру пори, що утворюється при злитті секреторної везікули з плазматичною мембраною.

Обговорення результатів. Раніше вважалось, що необхідно використовувати дві різних конфігурації щоб визначити рівень вивільнення («Амперометрія») та тип медіатора («Швидка циклічна вольтамперометрія»). Запропонований в цьому дослідженні метод одночасного оцінки даних характеристик, використовуючи певні тестуючі потенціали, дозволяє дещо спростити експериментальний протокол реєстрації, оскільки для коректного визначення типу нейромедіатора в конфігурації «Швидка циклічна амперометрія» необхідне співпадання в часі тестуючого ремпу потенціалу, що прикладається на вимірювальний електрод, та квантового процесу вивільнення від окремої везікули. Численні протиріччя в результатах досліджень по визначенню ефективності ініціації процесу екзоцитозу в хромафінних клітинах для різних типів каналів та ацетилхолінових рецепторів можуть виникати внаслідок відмінностей в параметрах стимулів (тривалість, сила стимуляції) та експериментальних підходах (наприклад неспецифічна дія різних блокаторів субтипів Са²⁺-каналів, специфічних типів рецепторів тощо). Тому для дослідження модулюючого впливу різних типів стимуляції на динаміку процесу вивільнення окремих хромафінних клітин було використано два різних експериментальних підходи. При першому експериментальному протоколі використовувалась короткочасова (23 сек) стимуляція різними агентами, що здатні ініціювати процес вивільнення в хромафінних клітинах. Внаслідок достатньо великої відстані між потенціал-керованими Са²⁺-каналами або ацетилхоліновими рецепторами та секреторними везікулами стимуляція хромафінних клітин окремий ПД в загальному випадку не приводить до процесу вивільнення. Тому в дослідженнях короткотривала аплікація ацетилхоліну, що є природним активатором хромафінних клітин, є експериментальною моделлю стимуляції послідовністю ПД, що генеруються відповідними парасимпатичними нервовими волокнами. Інший протокол реєстрації процесу вивільнення від хромафінних клітин використовував перманентну стимуляцію відповідними агентами. Така надмірна активація хромафінних клітин може виникати внаслідок порушення нормальної іннервації хромафінних клітин парасимпатичними нервовими волокнами. При запропонованому в даній роботі експериментальному протоколі ідентифіковано дві різні кінетичні фази процесу вивільнення для обох типів стимуляції. Перша фаза, що тривала приблизно 5 секунд після початку аплікації агентів характеризувалась високою частотою появи квантових подій вивільнення і, таким чином, може в основному характеризуватись процесом вивільнення секреторних везікул, що вже здійснили докінг, проте у випадку деполяризації клітини гіперкалієвим розчином, ця інтенсивність її була майже втричі більшою (рис. 7-8). Друга фаза (в ній значну роль вже буде відігравати процес перезаповнення множини докінгових везікул), що тривала наступні 1015 секунд теж відрізнялась при обох типах стимуляції; так для випадку активації ацетилхолінових рецепторів середній рівень процесу секреції був достовірно більшим, ніж під час деполяризації мембрани. Також виявлено пряму кореляцію між рівнем вивільнення та індукованими внутрішньоклітинними кальцієвими транзієнтами при стимуляції клітини 1мМ АХ та 50мМ KCl в кожний момент часу (рис. 9). Пролонгація процесу вивільнення під час аплікації клітини АХ може виникати внаслідок збільшення активності РКС, що виступає вторинним посередником при процесах активації специфічних рецепторів. Показано, що РКС здатна модулювати процес розузгодження кортикальної актинової сітки внаслідок специфічного фосфорилювання. Це призводить до вивільнення резервних везікул із цитоскелетних бар`єрів та їх наступної транслокації до плазматичної мембрани. В наступній серії дослідів використовувався протокол перманентної стимуляції окремої клітини. В даному випадку брались до уваги лише кінетичні особливості «перманентної» фази вивільнення - фази, при якій рівень вивільнення встановлювався на певному рівні. При перманентній аплікації 1мМ АХ (рис. 10) середня інтенсивність процесу секреції була достовірно вище, ніж у випадку постійної деполяризації клітини 50мМ KCl (рис. 11). Менший рівень процесу вивільнення катехоламінів при перманентній деполяризації клітини може бути пояснений інактивацією потенціал-керованих Са<sup>2+</sup>-каналів при тривалому стимулі. Таким чином, при моделюванні нормальних умов іннервації хромафінних клітин за допомогою транзієнтної аплікації секреторних агентів обидва типи стимуляції будуть відігравати суттєву роль в процесі вивільнення катехоламінів. Однак, у випадку тривалої стимуляції - умови, що може досягатись при різного роду важких патофізіологічних порушеннях, лише активація ацетилхолінових рецепторів буде відігравати домінантну роль в підтриманні процесу екзоцитозу від хромафінних клітин. Для дослідження участі підтипів ацетилхолінових рецепторів при тривалій стимуляції хромафінних клітин 1мМ АХ, використовувались специфічні агоністи відповідних субтипів: нікотин та пілокарпін. В експериментах аплікувались насичуючі концентрації відповідних сполук для оцінки їх максимальної здатності ініціювати процес вивільнення. Той факт, що агоністи специфічних типів рецепторів здатні ініціювати процес вивільнення лише в певної частини популяції хромафінних клітин, може свідчити про гетерогенність експресії нікотинових та мускаринових рецепторів в різних клітинах. Це припущення підтверджується наявністю двох окремих типів внутрішньоклітинних кальцієвих транзієнтів при стимуляції клітини ацетилхоліном в різних клітинах. Крім того, така гетерогенність виявлена в фізіологічно різних типах хромафінних клітин: адренергічних та норадренергічних. Більший рівень вивільнення при тривалій стимуляції лише одного з типів ацетилхолінових рецепторів, ніж при перманентній деполяризації може пояснюватись меншою десенсилітацією у випадку нікотинових рецепторів, порівняно з процесами інактивації потенціал-керованих Са<sup>2+</sup>-каналів, а при тривалій активації мускаринових рецепторів, що функціонально пов`язані з процесами вивільнення іонів Са²⁺ з внутрішньоклітинних депо, а після їх спустошення - до ініціації процесу ємнісного входу іонів Са²⁺ в клітину. Статистично недостовірні відмінності середніх інтенсивностей процесу вивільнення при стимуляції кожного з типу ацетилхолінових рецепторів (рис. 16) свідчить про практично однакову ефективність активації нікотинових та мускаринових рецепторів в ініціації секреції в хромафінних клітинах щура. При одночасній ініціації процесу вивільнення за допомогою аплікації специфічних агоністів рецепторів та деполяризуючого агента загальний рівень вивільнення є меншим, ніж сума відповідних значень при стимуляції клітини кожним активатором окремо (рис. 16). Це свідчить про те, що при обох типах стимуляції молекулярні механізми процесу вивільнення мають як спільні, так і відмінні стадії, в противному випадку рівень вивільнення визначався б лише загальною силою стимулу. Таким чином, процеси інактивації потенціал-керованих Са²⁺-каналів, що виникають при тривалій деполяризації клітини можуть ініціювати певні внутрішньоклітинні ефекти, які здатні інгібувати процес вивільнення, що ініціюється активацією різних типів ацетилхолінових рецепторів. В наступному етапі експериментальних досліджень розглядалось питання можливих змін часової динаміки індивідуальних квантових процесів вивільнення при різних типах стимуляції. Особливості будови та властивості електродів з карбоновими волокнами дають можливість порівнювати параметри амперометричних піків, що відповідають індивідуальним квантовим подіям вивільнення, отриманих від різних клітин. Всі гістограми розподілів значень характеристичних параметрів амперометричних піків виявляли характеристики нормального розподілу. Виявляється, у випадку стимуляції клітини АХ амперометричні піки мали достовірно менші ширину, напівширину, часи наростання та спаду, ніж у випадку ініціації вивільнення підвищеною концентрацією KCl. Більш того, амплітуда секреторних відповідей клітини була достовірно більшою для першого типу стимуляції. Проте, порівняльний статистичний аналіз площ секреторних амперометричних піків для обох типів стимуляції не виявили достовірних відмінностей (рис. 17 частина Д). Мускаринові та нікотинові рецептори є більш близькі до своїх відповідних сімейств, ніж один до одного як структурно, так і функціонально. Однак, порівняльний статистичний аналіз часових та амплітудних характеристик окремих секреторних відповідей, при активації різних типів ацетилхолінових рецепторів не виявив суттєвих достовірних відмінностей в їх кількісних значеннях. Таким чином, динаміка процесу вивільнення із окремої везікули в хромафінних клітинах не залежить від типу активованого рецептора. В наступній серії дослідів використовувалась сукупна дія і активації специфічних типів ацетилхолінових рецепторів, і деполяризація клітини гіперкалієвим розчином. Проте, амплітудні та часові характеристики окремих амперометричних піків при таких сукупних стимуляціях відрізняються як від відповідних значень при простій активації специфічних рецепторів, так і від характеристичних значень секреторних піків, отриманих при деполяризації клітини 50мМ KCl. Таким чином, при таких сукупних стимуляціях клітини, гістограми розподілу характеристичних параметрів динаміки окремих секреторних подій вивільнення не є сумою відповідних розподілів, отриманих для простої активації специфічних рецепторів та деполяризації клітини. Сповільнення динаміки процесу вивільнення при тривалій деполяризації або при сукупній стимуляції клітини агоністами ацетилхолінових рецепторів може виникати внаслідок специфічних рецептор-опосередкованих процесів, одним з яких є пригнічення активності РКС в дозозалежній манері, що опосередковується специфічними G-протеїнами, які пов`язані з потенціал-керованими Са<sup>2+</sup>-каналами. Для того, щоб пояснити біофізичну природу зміни часової динаміки вивільнення окремої секреторної везікули в наступній частині роботи була розроблена теоретична модель такого процесу. В ній припускається, що процес вивільнення із окремої везікули описується за допомогою «полегшеної» дифузії. Тобто, вважається, що, як і у випадку нормальної дифузії потік молекул з везікули виникає внаслідок градієнту концентрації і описується експоненційним законом (3) з постійною часу , в якій враховано можливі додаткові механізми виникнення інших рушійних сил. Дослідження зміни розташування реєструючого електроду з карбоновим волокном відносно поверхні клітини (рис. 22) показує лише дуже незначний зсув максимуму промодельованих характеристик часової динаміки зміни концентрації вивільнених катехоламінів, що добре узгоджується з розрахунками дифузійної затримки ідеалізованих амперометричних сигналів. Використання впливу відносної зміни параметрів та на часову динаміку процесу екзоцитозу дозволяє адекватно моделювати участь везікул різних популяцій (що відрізняються своїми розмірами) та зміни інтенсивності витікання катехоламінів через утворену пору для везікул однієї популяції (рис. 20-21). Виявляється, що зміна кінетики експериментально зареєстрованих індивідуальних квантових подій вивільнення при різних типах стимуляції хромафінних клітин (рис. 18) добре описується зміною радіусу утворюваної при цьому фузійної пори (рис 21). Для перевірки адекватності застосування запропонованих математичних підходів при таких умовах було проведено теоретичну оцінку, основану на випадковому блуканні окремих часточок у присутності відбиваючої та поглинаючої площин згідно класичних фізичних уявлень. Отримані профілі часової динаміки процесу вивільнення в залежності від зміни характеристичних параметрів при використанні обох теоретичних підходів дуже добре корелюють між собою (рис. 21,23). Тому, на даному етапі досліджень не можна чітко з`ясувати яка із оцінок є більш достовірною. Таким чином, отримані в цьому дослідженні дані дозволяють припустити, що специфічні рецептор-опосередковані процеси здатні взаємодіяти з певними специфічними протеїнами, які приймають участь на фінальних стадіях процесу злиття секреторної везікули з плазматичною мембраною ймовірно шляхом формування фузійної пори, можуть змінювати їх конформаційну перебудову, що в свою чергу може призводити до збільшення загального радіусу пори та прискорення кінетики процесу вивільнення медіатора.

Висновки

1. За допомогою застосування електрохімічного методу показана можливість розрізняння специфічних типів нейротрансміттерів по амплітуді та розташуванню окислювальних та відновлювальних піків струму на відповідних циклічних вольтамперограмах. Виявлено, що при дії суміші кожний з медіаторів окислюється або відновлюється на поверхні електроду незалежно від іншого. Визначено характеристики електродів з карбоновими волокнами та показана адекватність їх застосування в електрофізіологічних експериментах на рівні окремих клітин. На підставі цього запропоновано новий метод ідентифікації адреналіну та норадреналіну, що вивільняються хромафінними клітинами з використанням різних тестуючих постійних потенціалів при безпосередньому вимірюванні процесу вивільнення.

2. Використовуючи різні способи ініціації екзоцитозу в хромафінних клітинах: активації специфічних ацетилхолінових рецепторів та деполяризації клітини, зареєстровано дві окремих кінетичних стадії процесу вивільнення, характеристики яких залежать від типу стимуляції. Показано, що при короткотривалому збудженні, що може відбуватись при нормальній іннервації хромафінних клітин, загальна кількість вивільнених катехоламінів практично не залежить від способу ініціації процесу екзоцитозу.

3. Виявлено, що при довготривалій стимуляції, що може виникати під час важких патофізіологічних станах, постійний рівень вивільнення суттєво залежить від способу збудження клітини. При таких умовах активація ацетилхолінових рецепторів буде відігравати ключову роль в підтриманні процесу секреції в хромафінних клітинах ймовірно внаслідок активації механізмів, що опосередковуються специфічними вторинними посередниками. Однак при цьому не виявлено суттєвих відмінностей в ефективності ініціації екзоцитозу при стимуляції обох підтипів ацетилхолінових рецепторів: нікотинових та мускаринових.

4. Показано, що часова динаміка окремих квантових подій вивільнення залежить від способу стимуляції хромафінних клітин. У випадку активації ацетилхолінових рецепторів амперометричні піки мали достовірно меншу тривалість, часи наростання та спаду, проте більшу амплітуду, ніж у випадку деполяризації гіперкалієвим розчином. Не виявлено принципових відмінностей кінетики індивідуальних подій вивільнення при стимуляції різних типів ацетилхолінових рецепторів.

5. Сукупна стимуляція клітини агоністами ацетилхолінових рецепторів та деполяризуючого агенту призводить до появи секреторних подій, часова динаміка яких повільніша, ніж при стимуляції клітин лише агоністами, проте більш транзієнтна, ніж при активації потенціал-керованих Са²⁺-каналів. Постійність площі амперометричних піків при всіх типах стимуляції свідчить про те, що в процесі вивільнення в хромафінних клітинах виділяється однакова кількість нейротрансміттеру під час процесу вивільнення із окремих секреторних везікул.

6. Моделювання динаміки екзоцитозу окремої секреторної везікули вказує, що зміна кінетичних характеристик індивідуального піку може відбуватися внаслідок зміни радіусу фузійної пори, що утворюється при злитті везікули з плазматичною мембраною.

7. Припускається, рецептор-опосередковані процеси здатні взаємодіяти з специфічними протеїнами, які приймають участь на фінальних стадіях процесу злиття секреторної везікули з плазматичною мембраною ймовірно шляхом формування фузійної пори, можуть змінювати їх конформаційну будову, що в свою чергу може призводити до збільшення загального радіусу пори та прискорення кінетики процесу вивільнення медіатора.

Перелік опублікованих праць здобувача за темою дисертації

1. Починюк О.М. Заїка О.Л. Лук`янець О.О., Техніка порівняльних амперометричних вимірів для ідентифікації вивільнених нейротрансміттерів. Нейрофізіологія 1998, т. 30, №4/5, ст. 284-287.

2. Заика О.Л. Починюк О.Н. Лукьянец Е.А. Электрохимические исследования индуцируемой секреции катехоламинов из одиночных везикул хромаффинных клеток крысы. Український біохімічних журнал 2001, т. 73, №4, ст. 69-72

3. Zaika O.L. Pochynyuk O.M. Lukyanetz E.A. Comparative studies of calcium transients induced by acetylcholine in rat chromaffin cells. Нейрофізіологія 2002, т. 34, №2/3 ст. 270-272.

Тези доповідей.

1. Заика О.Л. Починюк О.Н. Лукьянец Е.А. Электрохимические исследования индуцируемой секреции катехоламинов из одиночных везикул хромаффинной клетки крысы. Укр. Біохім. Журнал 2000 т. 72, №6 ст. 125.

2. Починюк О.Н., Заика О.Л., Лукьянец Е.А. Амперометрическое исследование секреторных ответов хромаффинных клеток крысы, индуцируемых агонистами ацетилхолиновых рецепторов. Архив клинич. и экспер. медицины 2001, т. 10, №2, ст. 206.