Размещено на http://www.allbest.ru/

ХАРКІВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

імені В.Н. КАРАЗІНА

Доманов Єгор Олексійович

УДК 577.35

ІНДУКТИВНО-РЕЗОНАНСНИЙ ПЕРЕНОС ЕНЕРГІЇ В МЕМБРАННИХ СИСТЕМАХ

03.00.02 - біофізика

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата фізико-математичних наук

Харків - 2005

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Харківському національному університеті імені В.Н. Каразіна Міністерства освіти і науки України.

Науковий керівник: доктор фізико-математичних наук, старший науковий співробітник Горбенко Галина Петрівна Харківський національний університет імені В.Н. Каразіна професор кафедри біологічної і медичної фізики.

Офіційні опоненти:

доктор фізико-математичних наук, професор Харкянен Валерій Миколайович, Інститут фізики НАН України, завідувач відділу фізики біологічних систем (м. Київ);

кандидат фізико-математичних наук, старший науковий співробітник Зозуля Віктор Миколайович, Фізико-технічний інститут низьких температур ім. Б.І. Вєркіна НАН України, старший науковий співробітник відділу молекулярної біофізики (м. Харків);

Провідна установа: Інститут теоретичної фізики ім. М.М. Боголюбова НАН України (м. Київ).

Захист відбудеться 22.04.2005 року о 13-30 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.051.13 у Харківському національному університеті імені В.Н. Каразіна за адресою: 61077, м. Харків, пл. Свободи, 4, ауд. 7-4.

З дисертацією можна ознайомитись у Центральній науковій бібліотеці Харківського національного університету імені В.Н. Каразіна за адресою: 61077, м. Харків, пл. Свободи, 4.

Автореферат розісланий 20.03.2005 року.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради Гаташ С.В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Метод індуктивно-резонансного переносу енергії (ІРПЕ) є одним з найпотужніших методів структурних досліджень у сучасній біофізиці та біохімії. Він дозволяє отримувати багату інформацію про взаємне розташування макромолекул і їх структурних елементів як in vitro, так і in vivo. Особливо багато переваг цей метод дає при дослідженні молекулярної організації мембран та різноманітних мембранних процесів, зокрема білок-ліпідних взаємодій. Надійна кількісна інтерпретація даних, отриманих методом переносу енергії, зумовлюється, насамперед, наявністю ґрунтовних теоретичних моделей цього явища у відповідних системах, які мають коректно описувати можливі просторові конфігурації донорів і акцепторів, їх взаємну орієнтацію, особливості розподілу хромофорів у системі, а також базуватися на адекватних процедурах усереднення параметрів. Складність такого теоретичного розгляду, а також наявність певних теоретичних і методологічних проблем, що досі не є вирішеними, примушує багатьох дослідників використовувати метод ІРПЕ тільки в якісному аспекті, що значно обмежує спектр вирішуваних за його допомогою задач. Тому існує потреба удосконалення теоретичного та методологічного підґрунтя індуктивно-резонансного переносу енергії саме як кількісного методу дослідження біологічних мембран.

Треба також відзначити, що визначення вірної стратегії застосування методу ІРПЕ є неможливим без його перевірки в реальних експериментальних дослідженнях. Тому в експериментальній частині даної роботи метод переносу енергії було застосовано для вивчення модельних білок-ліпідних систем, що складалися з ліпідних везикул (ліпосом) та ізольованих білків цитохрому с і гемоглобіну. Знання про структуру та поведінку цих комплексів до цього часу залишаються недосконалими і суперечливими. З точки зору актуальності обраних білок-ліпідних систем, треба відзначити такі моменти. Проблема взаємодії цитохрому с з аніонними фосфоліпідними мембранами пов'язана щонайменше з трьома дуже важливими фізіологічними та патологічними процесами, а саме: і) участю цитохрому с у ланцюгу переносу електрона на внутрішній мембрані мітохондрій в процесі дихання; іі) виходом цитохрому с з мітохондрій на початковій стадії апоптозу; ііі) каталізованим мембраною утворенням амілоїдних волокон. Дослідження молекулярних механізмів взаємодії між гемоглобіном та мембранами є безумовно актуальним як у фундаментальному аспекті, так і з точки зору створення замінників крові на основі штучних структур, що містять гемоглобін, - так званих гемосом. Крім того, в останні десятиріччя цитохром с та гемоглобін знаходять все більше застосування при розробці молекулярних електронних пристроїв і біосенсорів.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконувалася на кафедрі біологічної і медичної фізики Харківського національного університету ім. В.Н. Каразіна у відповідності з планом науково-дослідних робіт кафедри за темою “Дослідження впливу високочастотного електромагнітного випромінювання на структурно-функціональні та фізичні властивості біологічних об'єктів” (№ держреєстрації 0198U005829).

Мета і задачі дослідження. Метою даної роботи було встановлення структури і молекулярних механізмів утворення комплексів цитохрому с і гемоглобіну з модельними фосфоліпідними мембранами за допомогою методу індуктивно-резонансного переносу енергії. Для досягнення даної мети розв'язувалися такі задачі:

- побудувати універсальну систему моделей ІРПЕ для опису найбільш важливих ситуацій, що зустрічаються у біофізичних дослідженнях мембранних систем;

- кількісно описати і промоделювати вплив орієнтаційних ефектів на ефективність переносу енергії в мембранах;

- вдосконалити методологію вимірювань ІРПЕ в мембранах для отримання найбільш повної і статистично достовірної інформації за даними стаціонарної флуоресцентної спектроскопії;

- визначити структурні параметри комплексів цитохрому с з модельними мембранами та дослідити, як ці параметри залежать від вмісту аніонних фосфоліпідів та іонної сили середовища;

- дослідити механізми взаємодії гемоглобіну з модельними фосфоліпідними мембранами та охарактеризувати структуру його комплексів з ліпідами.

Об'єкт дослідження - явище індуктивно-резонансного переносу енергії за механізмом слабкої диполь-дипольної взаємодії.

Предмет дослідження - особливості індуктивно-резонансного переносу енергії в модельних ліпідних та білково-ліпідних мембранах; структурні характеристики комплексів цитохрому с і гемоглобіну з фосфоліпідними мембранами.

Методи дослідження. В теоретичних дослідженнях використовували методи математичного аналізу, чисельного моделювання і статистики. Експериментальні дослідження проводили методами флуоресцентної спектроскопії і спектрофотометрії, а для обробки даних застосовували нелінійну оптимізацію, чисельні розрахунки та методи математичної статистики.

Наукова новизна одержаних результатів.

1. Вперше побудовано моделі ІРПЕ для випадку об'ємного розподілу донорів всередині мембрани та, на основі даних моделювання, продемонстрована можливість визначення вимірності розподілу донорів та/або акцепторів у мембрані.

2. Удосконалено моделі ІРПЕ для випадку розташування донорів і акцепторів у кількох площинах, паралельних до поверхні бішару. Визначені оптимальні умови проведення експериментів при такому розташуванні хромофорів. Розроблено моделі ІРПЕ для сферичних розподілів донорів і акцепторів. Оцінено вплив кривизни мембранної поверхні на ефективність переносу енергії.

3. Проведено математичне моделювання переносу енергії при різноманітних можливих варіантах орієнтаційних розподілів донорів і акцепторів; отримані помилки оцінювання структурного параметра, що мають місце, коли орієнтаційні ефекти в мембрані не враховуються; вперше показано, що ефекти невизначеності орієнтаційної поведінки хромофорів у мембрані є значно слабкішими ніж у випадку внутрішньомолекулярного переносу енергії.

4. Методом ІРПЕ отримано кількісні оцінки положення гемової групи цитохрому с відносно центра бішару разом з оцінками параметрів зв'язування білку в рамках різних формалізмів адсорбції.

5. Вперше методом флуоресцентної спектроскопії отримані докази на користь занурення периферичного білку цитохрому с вглиб бішару при підвищенні поверхневої концентрації білку на мембрані, що містить аніонні фосфоліпіди, за умов низької іонної сили.

6. На основі кількісного аналізу даних ІРПЕ для взаємодії гемоглобіну з фосфоліпідними мембранами, зроблено висновок про існування двох типів білок-ліпідних комплексів, які відрізняються за параметрами зв'язування, а також за положенням білку відносно поверхні бішару. Отримано кінетичні параметри комплексоутворення.

Практичне значення одержаних результатів. Розроблена система математичних моделей переносу енергії в мембранах є досить гнучкою і універсальною, отже, її можна застосовувати для кількісного описання ІРПЕ при різноманітних конфігураціях донорів і акцепторів у мембрані. На основі розгляду особливостей ІРПЕ у мембранах, зокрема, орієнтаційних ефектів, запропоновано ряд рекомендацій щодо підбору оптимальних донорно-акцепторних пар, які забезпечуватимуть отримання найбільш точної і надійної структурної інформації у флуоресцентних дослідженнях мембранних систем. Запропонована методологія та комплекс комп'ютерних програм для обробки багатовимірних масивів даних ІРПЕ в мембрані, які можуть з успіхом використовуватися як кількісний інструмент при дослідженні ліпід-ліпідних та білок-ліпідних взаємодій, а також взаємодій біологічно-активних речовин (зокрема, ліків) з мембранами. Результати експериментальних досліджень будови комплексів цитохрому с і гемоглобіну з фосфоліпідними мембранами можуть бути використані при розробці молекулярних електронних пристроїв і біосенсорів, а також при створенні замінників крові на основі ліпосомальної моделі еритроциту.

Особистий внесок здобувача. В опублікованих зі співавторами наукових працях особистий внесок здобувача полягає в:

у роботах [1,4,14,17] - участь у розробці математичних моделей, комп'ютерному програмуванні; у роботах [8,9,15,16,18] - математичні розрахунки, програмування; в роботах [1-4,8,14,15,17] - проведення чисельного моделювання; в роботах [9,12,16,18] - практично весь об'єм експериментальної роботи, в [5,6,13] - участь в експерименті; обробка, аналіз та оформлення експериментальних даних [5,6,9-13,16,18,19] або даних чисельного моделювання [1-4,8,9,14-17]; в роботах [1,3,4,6,8-10,12-19] - активна участь в обговоренні результатів; у роботах [9,16,18] - участь у постановці задачі.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертаційної роботи були представлені та доповідались на: Всеукраїнській науковій конференції “Успіхи та перспективи розвитку кріобіології і кріомедицини”, Харків, 2001; XIV Міжнародній конференції з хімічної термодинаміки, Санкт-Петербург, 2002; VIII Українському біохімічному з'їзді, Чернівці, 2002; III З'їзді Українського біофізичного товариства, Львів, 2002; Міжнародній конференції “Молекулярные, мембранные и клеточные основы функционирования биологических систем”, Мінськ, 2002; Другій харківській конференції молодих вчених і науковців “Радіофізика та НВЧ електроніка”, Харків, 2002; 8th Conference on Methods and Applications of Fluorescence: Spectroscopy, Imaging and Probes, Prague, Czech Republic, 2003; XVI Міжнародній школі-семінарі “Спектроскопія молекул і кристалів”, Севастополь, 2003; 5th International Conference on Biological Physics, Gцteborg, Sweden, 2004; І Українській науковій конференції “Проблеми біологічної і медичної фізики”, Харків, 2004.

Публікації. Основні матеріали дисертації опубліковані в 19 наукових працях, у тому числі в 9 статтях у наукових фахових журналах та в 10 тезах доповідей на міжнародних і національних конференціях.

Структура та об'єм дисертації. Дисертація складається зі вступу, шести основних розділів, висновків, списку використаних джерел та додатка. Загальний об'єм дисертації складає 163 сторінки, з яких 4 сторінки займає додаток. Дисертація містить 38 рисунків (з них 2 займають повні сторінки) та 6 таблиць. Список використаних джерел складається з 212 найменувань і займає 26 сторінок.

цитохром гемоглобін мембранний фізичний

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

У вступі обґрунтовано актуальність обраної теми, сформульовано мету досліджень та задачі, що необхідно вирішити для її досягнення, визначено наукову новизну та практичну цінність отриманих результатів, наведено загальну структуру дисертаційної роботи.

Перший розділ присвячено висвітленню фізичних основ переносу енергії, а також аналізу існуючих моделей і застосувань цього явища при дослідженні біологічних систем і, насамперед, модельних та біологічних мембран.

Розглянуто фізичні механізми і особливості індуктивно-резонансного переносу енергії між молекулою-донором і молекулою-акцептором. Наведено ключові положення квантово-механічної теорії Фьорстера, яка дозволяє пов'язати швидкість переносу енергії із спектроскопічними характеристиками донора і акцептора, а саме: мірою перекривання спектра флуоресценції донора зі спектром поглинання акцептора, квантовим виходом донора і взаємною орієнтацією моментів переходу донора і акцептора. В рамках цієї теорії вважається, що перенос енергії відбувається за механізмом слабкої диполь-дипольної взаємодії між збудженою молекулою донора і молекулою акцептора, при цьому швидкість переносу виявляється обернено пропорційною до шостого степеня відстані між хромофорами, що взаємодіють.

Наведено методи експериментального визначення ефективності переносу енергії. Розглянуто відмінності ІРПЕ в системах з різною вимірністю.

Критично розглянуто існуючі моделі переносу енергії в мембранних системах. Проаналізовано межі застосовності кожного теоретичного підходу, які визначаються спрощеннями і припущеннями, що робляться при побудові моделі. Різні підходи порівняно з точки зору точності отримуваних оцінок ефективності переносу енергії, а також зручності та доступності обчислювальних процедур.

Подано різні схеми класифікації застосувань ІРПЕ, а також окреслено коло задач біофізики і біохімії, що можна вирішувати за допомогою цього методу.

У розділі 2 наведена загальна характеристика матеріалів та методів дослідження.

Об'єктами експериментальних досліджень були модельні фосфоліпідні мембрани. У якості модельних мембранних систем використовували моноламелярні ліпосоми, які готували методом етанольної інжекції із сумішей цвіттеріонного ліпіду фосфатидилхоліну (ФХ) і аніонного ліпіду кардіоліпіну (КЛ) в різних молярних відношеннях. Донором енергії в більшості експериментів був флуоресцентний ліпідний аналог антрілвініл-фосфатидилхолін (АВ_ФХ), що являє собою молекулу фосфатидилхоліну, в якій до одного з аліфатичних ланцюгів ковалентно приєднано флуорофорну групу. АВ_ФХ має флуоресценцію в синьо-фіолетовій області з квантовим виходом близько 0,8.

В експериментах досліджували взаємодії водорозчинних гем-білків цитохрому с і гемоглобіну з фосфоліпідними мембранами. Завдяки тому, що спектр флуоресценції АВ_ФХ істотно перекривається зі спектром поглинання гемових груп білків (переважно в смузі Соре - рис. 1), АВ_ФХ і гем-білки утворюють ефективну донорно-акцепторну пару.

Усі розрахунки, зокрема, чисельне інтегрування і нелінійну оптимізацію проводили в середовищі MathCad на персональному комп'ютері.

У розділі 3 представлено розроблені автором математичні моделі індуктивно-резонансного переносу енергії між донорами і акцепторами, розподіленими в мембранних системах з різною геометрією. В основі всіх моделей лежить підхід Волбера і Хадсона до описання переносу енергії в площині. У рамках цього підходу розглядається збуджена молекула донора, від якої енергія може передаватися на декілька найближчих до неї молекул акцепторів; при цьому вважається, що донори і акцептори випадково розподілені в одній площині. Нами було поставлено і розв'язано задачу описання ІРПЕ у випадках, коли розподіли донорів і акцепторів мають більш складну геометрію. Для цього були отримані вирази для радіальної функції розподілу акцепторів навколо донора <формула> (тобто імовірності знаходження акцептора на відстані <формула> від донора) у різних геометріях, що можуть мати місце при дослідженні переносу енергії в модельних ліпідних і білково-ліпідних мембранах.

Наприклад, у випадку, коли донори є гідрофобними зондами, а акцептори мають амфіфільну природу, перенос енергії відбувається від донорів, що розподілені в об'ємі гідрофобної ділянки бішару, на акцептори, що локалізуються на межі гідрофобної і гідрофільної ділянок.

Чисельний аналіз отриманих моделей демонструє можливість визначення вимірності розподілу донорів та/або акцепторів у мембрані на основі залежності відносного квантового виходу донора від поверхневої концентрації акцептора.

Також побудовано моделі переносу енергії для випадків розподілу донорів і акцепторів у концентричних сферах, які можна застосовувати для опису ІРПЕ в міцелах і маленьких ліпідних везикулах. На основі даних чисельного моделювання оцінено вклад ефектів кривизни поверхні в ефективність переносу. Чисельне моделювання показує, що ефективність переносу енергії втрачає залежність від кривизни поверхні, коли радіус частинки більш ніж втричі перевищує радіус Фьорстера.

Детально розглянуто орієнтаційну поведінку хромофорів у мембрані та вплив орієнтаційних ефектів на ефективність переносу енергії. Невизначеність оріентаційної поведінки хромофорів вважається одним з основних джерел помилок при аналізі даних переносу енергії. Від взаємної орієнтації моментів переходу донора і акцептора залежить радіус Фьорстера для даної донорно-акцепторної пари. Орієнтаційний фактор пов'язаний з кутами, що утворені моментами переходу донора і акцептора між собою та з напрямком переносу.

Нами було застосовано підхід Дейвенпорт і співробітників для описання орієнтаційної поведінки хромофорів у мембрані. При такому описі стає функцією відстані між донором і акцептором, яка вводиться у відповідний інтеграл.

З використанням відповідних співвідношень для <формула> нами було проведено математичне моделювання переносу енергії при різноманітних можливих варіантах орієнтаційних розподілів донорів і акцепторів; отримані помилки оцінювання структурного параметра, що мають місце, коли орієнтаційні ефекти в мембрані не враховуються. Показано, що ефекти невизначеності орієнтаційної поведінки хромофорів у мембрані є значно слабкішими, ніж у випадку внутрішньомолекулярного переносу енергії. Розгляд особливостей ІРПЕ у мембранах, дозволяє визначити області параметрів розподілу хромофорів, при яких орієнтаційні ефекти справляють мінімальний вплив на розрахункові залежності. На основі такого аналізу сформульовано рекомендації щодо підбору оптимальних донорно-акцепторних пар, які забезпечуватимуть отримання найбільш точної і надійної структурної інформації у флуоресцентних дослідженнях мембранних систем.

Розділ 4 присвячено розробці методичного підходу до аналізу багатовимірних масивів даних ІРПЕ в мембранах у випадку, коли акцептор може розподілятися між ліпідною і водною фазами. Комбінуючи відповідні моделі переносу енергії і зв'язування акцептора з мембраною, можна представити відносний квантовий вихід як функцію п'яти змінних. Дві з них, загальна концентрація акцепторів і загальна концентрація доступного ліпіду є незалежними змінними, які можна варіювати в експерименті. Стехіометрія і рівноважна константа дисоціації (у випадку моделі адсорбції Ленгмюра) та відстань між площинами донорів і акцепторів (у випадку моделі переносу енергії з однієї площини донорів на одну площину акцепторів) є невідомими параметрами, котрі необхідно визначити під час апроксимації експериментальних даних за методом найменших квадратів. Між цими параметрами існує сильна взаємна кореляція, а тому одну і ту ж саму експериментальну залежність можна описати багатьма різними комбінаціями параметрів. Нами показано, що взаємну кореляцію між трьома підгоночними параметрами можна подолати шляхом одночасного аналізу двовимірного масиву експериментальних даних, отриманого варіюванням як загальної концентрації акцептора, так і концентрації ліпіду.

Перевірку адекватності запропонованого підходу до аналізу стаціонарних даних ІРПЕ, а також оцінювання точності і взаємної кореляції отримуваних параметрів здійснювали, використовуючи змодельовані експериментальні дані. На рис. 3 наведено проекції так званих поверхонь помилок по відношенню до одного з параметрів. Чим вузькіший мінімум на такій поверхні, тим точніше може бути визначений даний параметр при апроксимації. Як видно з рисунка, аналіз звичайного одновимірного масиву даних взагалі не дає чіткого мінімуму (штрихова лінія), у той час як двовимірний масив даних забезпечує чіткий вузький мінімум. Точки перетину проекції з 67%-вим довірчим рівнем дають відповідний довірчий інтервал для параметра.

У п'ятому розділі викладені результати досліджень взаємодії цитохрому с з модельними фосфоліпідними мембранами.

Ліпосоми містили 10 молярних відсотків кардіоліпіну (решта - фосфатидилхолін). Експерименти проводились в умовах низької іонної сили (у 5 мМ натрій-фосфатному буфері) при п'ятьох різних концентраціях ліпіду. Чисельний аналіз даних проводили в рамках різних моделей адсорбції з використанням формалізму, викладеного в розділі 4. При цьому користувались моделлю переносу енергії в мембранах для двох площин донорів і однієї площини акцепторів. Геометрія моделі представлена на рис. 5.

У Таблиці 1 приведено значення структурного параметра і параметрів зв'язування, які було отримано при апроксимації експериментальних даних комбінацією моделі ІРПЕ з різними моделями адсорбції. З таблиці видно, що значення параметра, тобто поперечне положення гемової групи цитохрому с відносно центра бішару, практично не залежить від типу моделі адсорбції.

Подібні експерименти було проведено також у модельних мембранах, які містили 20 і 40 молярних відсотків кардіоліпіну в умовах низької іонної сили (5 мМ). Крім того, масиви даних для ліпосом з 20 мол. % КЛ було отримано в умовах підвищеної іонної сили: 15 мМ та 30 мМ NaCl (+ 5 мМ натрій-фосфатний буфер). Чисельний аналіз виявив, що дані для мембран з вищим вмістом КЛ (20 і 40 мол. %) при низькій іонній силі не узгоджуються зі звичайними моделями адсорбції і моделлю переносу енергії при рівномірному та випадковому розподілі донорів і акцепторів у паралельних площинах, що змушує припустити наявність якогось додаткового процесу або фактора, величина якого залежить від: і) вмісту кардіоліпіну; іі) концентрації ліпіду або співвідношення загальних концентрацій ліпіду і білку, <формула>; та ііі) іонної сили розчину. На рис. 6 дані для ліпосом з різним вмістом КЛ наведено у вигляді залежностей відносного квантового виходу флуоресценції АВ_ФХ від поверхневої густини цитохрому с. Співставлення експериментальних даних з теоретичними кривими дозволяє зробити висновок, що в діапазоні поверхневих густин від 0,025 до 0,07 нм-2 будова білок-ліпідної мембрани з високим вмістом кардіоліпіну 20 мол. % змінюється таким чином, що уявна відстань між площинами донорів і акцепторів зменшується.

Серед можливих перебудов білок-ліпідної мембрани, які можуть пояснити спостережувані ефекти, розглядається три класи явищ. По-перше, взаємодія білкового і ліпідних компонентів може призводити до латерального перерозподілу останніх та/або нерівномірного розподілу білку на поверхні мембрани. По-друге, якщо один з ліпідних компонентів мембрани схильний до утворення небішарових структур, білок може індукувати утворення НІІ-фази, обернених міцел, або пор. По-третє, зміни поверхневої густини білку можуть модулювати глибину його занурення у бішар. Додаткові експерименти з іншим аніонним ліпідом - фосфатидилгліцерином, який не є схильним до утворення небішарових структур, а також експерименти з негативно зарядженим флуоресцентним ліпідним аналогом антрілвініл-фосфатидилгліцерином показали, що в наших даних відбивається останній механізм, тобто часткове занурення цитохрому с у бішар при підвищенні поверхневої густини білку.

Шостий розділ присвячено вивченню особливостей утворення комплексів гемоглобіну з модельними мембранами. У розділі викладені результати, отримані методом переносу енергії з АВ-ФХ на гемові групи гемоглобіну. Рівноважні значення відносного квантового виходу АВ_ФХ (через 30 хв. після додавання білку до суспензії ліпосом) записували при різних концентраціях білку і ліпіду для ліпосом, що містили 10, 20 або 40 мол.% КЛ. Первинний чисельний аналіз показав, що отримані дані неможливо описати комбінацією простих моделей ІРПЕ і білкової адсорбції, так, як це було зроблено із даними для цитохрому с. Найбільш розумним ускладненням теоретичного опису було припущення наявності двох типів комплексів гемоглобіну з фосфоліпідними мембранами. Для такого опису була розроблена відповідна теоретична модель, в рамках якої молекула акцептору (гемоглобіну) може утворювати два різних типи комплексів з мембраною, що мають різні константи дисоціації, а також розрізняються за положенням акцепторної хромофорної групи у мембрані.

У той же час, значення близько 6-7 нм для 2-го типу комплексів відповідають поверхневій локалізації білку. Такі величини дещо перевищують верхню межу можливих значень для зв'язаного білку, яка з геометричних міркувань має дорівнювати близько 5 нм. Серед можливих причин такого завищення може бути часткова деструкція або дисоціація гема від глобіну, яка може призводити до зменшення ефективного, а отже до уявного збільшення.

Дуже низькі значення, отримані для констант дисоціації комплексів першого типу, відбивають нерівноважний характер утворення першого (гідрофобного) типу комплексів, які після утворення вже не можуть дисоціювати.

Отримані часові залежності ефективності переносу енергії, які відбивають кінетику утворення білково-ліпідних комплексів, а також кінетику дисоціації комплексів після підвищення іонної сили. Апроксимація цих залежностей дозволила оцінити кінетичні параметри різних стадій процесу і зробити висновки щодо механізмів асоціації і дисоціації гемоглобіну від заряджених модельних мембран.

ВИСНОВКИ

У дисертаційній роботі наведене нове вирішення важливої задачі біофізики мембран - встановлення молекулярної організації білок-ліпідних комплексів. Вперше методом індуктивно-резонансного переносу енергії охарактеризовано структурні особливості комплексів цитохрому с і гемоглобіну з фосфоліпідами. Запропоновані в роботі моделі та методичні підходи дозволять отримати нову кількісну інформацію про структуру як модельних, так і природних мембран.

1. Розроблено універсальну систему моделей індуктивно-резонансного переносу енергії для опису різних випадків розподілу донорних і акцепторних хромофорів у мембранних системах; зокрема, вперше побудовано моделі ІРПЕ для випадку об'ємного розподілу донорів всередині мембрани та на основі даних моделювання продемонстрована можливість визначення вимірності розподілу донорів та/або акцепторів у мембрані.

2. Проведено математичне моделювання переносу енергії при різноманітних можливих варіантах орієнтаційних розподілів донорів і акцепторів; отримані помилки оцінювання локалізації хромофорів у ліпідному бішарі, що мають місце, коли орієнтаційні ефекти в мембрані не враховуються; вперше показано, що ефекти невизначеності орієнтаційної поведінки хромофорів у мембрані є значно слабкішими, ніж у випадку внутрішньомолекулярного переносу енергії.

3. На основі розгляду особливостей ІРПЕ у мембранах, зокрема, орієнтаційних ефектів, запропоновано ряд рекомендацій щодо підбору оптимальних донорно-акцепторних пар, які забезпечуватимуть отримання найбільш точної і надійної структурної інформації у флуоресцентних дослідженнях мембранних систем.

4. Запропонована методологія та комплекс комп'ютерних програм для обробки багатовимірних масивів даних ІРПЕ в мембранах. З використанням чисельного моделювання та аналізу взаємної кореляції параметрів показано, що така методологія отримання та аналізу даних дозволяє оцінювати одночасно як параметри зв'язування акцептора з мембраною, так і відстань від площини акцепторів до центра бішару. Таким чином, можна отримувати оцінки цих параметрів з високою точністю і статистичною достовірністю, використовуючи лише дані стаціонарної флуоресцентної спектроскопії.

5. За допомогою методу ІРПЕ визначено положення гемової групи цитохрому с відносно центра ліпідного бішару, а також параметри зв'язування білку з ліпідами в рамках різних формалізмів адсорбції.

6. Проаналізовано залежність ефективності взаємодії цитохрому с з модельними мембранами та структури білок-ліпідних комплексів від вмісту аніонного ліпіду кардіоліпіну, а також від іонної сили середовища. Вперше методом флуоресцентної спектроскопії виявлено занурення цитохрому с вглиб зарядженого бішару при підвищенні поверхневої концентрації білку за умов низької іонної сили.

7. Проведено кількісний аналіз комплексоутворення гемоглобіну з фосфоліпідними мембранами. Вперше методом ІРПЕ отримані докази на користь існування двох типів комплексів гемоглобіну з ліпідним бішаром. Проведена оцінка ефективних рівноважних і кінетичних параметрів комплексоутворення.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Domanov Ye.A., Gorbenko G.P. Resonance energy transfer in membrane systems. I. Bulk donor distribution // Вісник ХДУ №528, Біофізичний вісник.- 2001, № 9(2), С.71-75.

2. Gorbenko G.P., Domanov Ye.A. Energy transfer method in membrane studies: some theoretical and practical aspects // J. Biochem. Biophys. Methods.- 2002.- Vol.52, No.1.- P.45-58.

3. Gorbenko G.P., Domanov Ye.A. Resonance energy transfer in membrane systems. II. Effect of surface curvature // Вісник ХДУ №560, Біофізичний вісник.- 2002, № 10(1), С.50-53.

4. Domanov Ye.A., Gorbenko G.P. Analysis of resonance energy transfer in model membranes: role of orientational effects // Biophys. Chemistry.- 2002.- Vol.99, No.2.- P.143-154.

5. Gamolina O.V., Gorbenko G.P., Domanov Ye.A. Fluorescence quenching study of ribonuclease A complexes with model phospholipid membranes // Вісник ХДУ №560, Біофізичний вісник.- 2002, № 10(1), С.124-126.

6. Gorbenko G.P., Domanov Ye.A. Cytochrome c location in phosphatidylcholine/ cardiolipin model membranes: resonance energy transfer study // Biophys. Chemistry.- 2003.- Vol.103, No.3.- P.239-249.

7. Domanov Ye.A. Resonance energy transfer in membrane systems. III. Planar acceptor distribution in two monolayers // Вісник ХДУ №593, Біофізичний вісник.- 2003, № 12(1), С.86-88.

8. Domanov Ye.A., Gorbenko G.P., Gamolina O.V. Fluorescence quenching in protein-lipid systems: contribution of diffusion-controlled factors // Вісник ХДУ №593, Біофізичний вісник.- 2003, № 12(1), С. 117-119.

9. Domanov Ye.A., Gorbenko G.P., Molotkovsky, J.G. Global analysis of steady-state energy transfer measurements in membranes: resolution of structural and binding parameters // J. Fluoresc.- 2004.- Vol.14, No.1.- P.49-55.

10. Доманов Е.А., Горбенко Г.П., Дюбко Т.С. Влияние криопротекторов и низких температур на структурное состояние модельных фосфолипидных мембран // Проблемы криобиологии.- 2001.- № 3.- С.26-27.

11. Горбенко Г.П., Доманов Е.А. Термодинамические аспекты образования белок-липидных комплексов // Труды XIV Междунар. конф. по химической термодинамике.- Санкт-Петербург.- 2002.- с.219.

12. Domanov Ye.A., Gorbenko G.P. Methemoglobin effect on structural state of model membranes // Тези доп. VIII З'їзду Українського біохімічного товариства.- Чернівці.- 2002.- С.27.

13. Domanov Ye.A., Gorbenko G.P. Cytochrome c disposition in lipid model membranes as revealed by resonance energy transfer // Тези доп. III З'їзду Українського біофізичного товариства.- Львів.- 2002.- С.45.

14. Доманов Е.А., Горбенко Г.П. Индуктивно-резонансный перенос энергии в модельных белок-липидных системах // Труды Междунар. конф. “Молекулярные, мембранные и клеточные основы функционирования биологических систем”.- Минск.- 2002.- С.67.

15. Domanov Ye.A., Gorbenko G.P., Gamolina O.V. Dynamic fluorescence quenching in model membranes: role of diffusion-controlled effects // Тези доп. Другої харківської конф. молодих вчених і науковців “Радіофізика та НВЧ електроніка”.- Харків.- 2002.- С.12.

16. Domanov Ye.A., Gorbenko G.P., Global analysis of steady-state energy transfer measurements in membranes: resolution of structural and binding parameters // Proc. of the 8th Conference on Methods and Applications of Fluorescence: Spectroscopy, Imaging and Probes.- Prague.- 2003.- P.82.

17. Domanov Ye.A., Gorbenko G.P. Contribution of orientational effects to the efficiency of nonradiative energy transfer in membrane systems, Праці XVI Міжнародної школи-семінару “Спектроскопія молекул і кристалів”.- Севастополь.- 2003.- С.290.

18. Domanov Ye.A., Gorbenko G.P. FRET reveals concentration-dependent changes of cytochrome c location in phospholipid membranes al low ionic strength Proc. of the 5th International Conference on Biological Physics.- Gцteborg.- 2004.- P.113.

19. Domanov Ye.A., Gorbenko G.P. Resonance energy transfer and light scattering studies of glucose oxidase interaction with liposomes // Тези доп. Першої української наукової конференції “Проблеми Біологічної і медичної фізики”.- Харків.- 2004.- С.115.

АНОТАЦІЯ

Доманов Є.О. Індуктивно-резонансний перенос енергії в мембранних системах. - Рукопис. Дис... канд. фіз.-мат. наук: 03.00.02 - біофізика. - Харківський національний університет ім. В.Н. Каразіна, м. Харків, 2004.

Робота поєднує теоретичні та експериментальні дослідження індуктивно-резонансного переносу енергії (ІРПЕ) в модельних ліпідних і білково-ліпідних мембранах. Акцент зроблено на розвитку і застосуванні ІРПЕ як кількісного методу досліджень. В теоретичній частині на основі формалізму переносу енергії в площині побудовано систему моделей ІРПЕ для опису найбільш важливих ситуацій, що зустрічаються у біофізичних дослідженнях мембран; кількісно описано і промодельовано вплив орієнтаційних ефектів на ефективність переносу енергії в мембранах. Розроблена методологія вимірювання і аналізу багатовимірних масивів даних ІРПЕ в мембранах, що забезпечує отримання найбільш повної і статистично достовірної структурної інформації за даними стаціонарної флуоресцентної спектроскопії. Розроблені математичні моделі та методичні підходи застосовано для отримання кількісної інформації про структуру комплексів цитохрому с і гемоглобіну з модельними фосфоліпідними мембранами і для дослідження молекулярних механізмів їх утворення.

Ключові слова: перенос енергії, ІРПЕ, мембрани, білок-ліпідні взаємодії, цитохром с, гемоглобін, антрілвініл, ліпосоми.

АННОТАЦИЯ

Доманов Е.А. Индуктивно-резонансный перенос энергии в мембранных системах. - Рукопись. Дисс... канд. физ.-мат. наук: 03.00.02 - биофизика. - Харьковский национальный университет им. В.Н. Каразина, г. Харьков, 2004.

Работа объединяет теоретические и экспериментальные исследования индуктивно-резонансного переноса энергии (ИРПЭ) в модельных липидных и белково-липидных мембранах. Акцент сделан на развитии и применении ИРПЭ как количественного метода исследований. В теоретической части на основе формализма переноса энергии в плоскости построена система моделей ИРПЭ для описания наиболее важных ситуаций, встречающихся в биофизических исследованиях мембран; количественно описано и промоделировано влияние ориентационных эффектов на эффективность переноса энергии в мембранах. Разработана методология измерения и анализа многомерных массивов данных ИРПЭ в мембранах, которая обеспечивает получение наиболее полной и статистически достоверной структурной информации по флуоресцентным данным. Разработанные математические модели и методические подходы применены для получения количественной информации о структуре комплексов цитохрома с и гемоглобина с модельными фосфолипидными мембранами и для выяснения молекулярных механизмов их образования.

Ключевые слова: перенос энергии, ИРПЭ, мембраны, белок-липидные взаимодействия, цитохром с, гемоглобин, антрилвинил, липосомы.

SUMMARY

Domanov Ye.A. Fluorescence resonance energy transfer in membrane systems. - PhD thesis in biophysics. - V.N. Karazin Kharkiv National University, Kharkiv, 2004.

The dissertation combines theoretical and experimental studies of fluorescence resonance energy transfer (FRET) in model lipid and proteolipid membranes. The emphasis is made on the development and application of FRET as a quantitative tool. The theoretical part of dissertation is devoted to construction of a system of models for energy transfer between chromophores distributed in membrane systems with various geometries occurring in biophysical studies of protein-lipid or drug-lipid interactions. The formalism initially proposed by Wolber and Hudson for energy transfer from a donor to multiple acceptors arranged in a plane has been extended here to the cases of i) donors and acceptors randomly distributed in several parallel planes in one or two bilayer leaflets, ii) donors randomly distributed in the bulk of the membrane hydrophobic core and acceptors localizing either in the hydrophobic part of the membrane or at the interface between hydrophobic and hydrophilic regions, iii) donors and acceptors distributed in one or several concentric spheres inside small unilamellar vesicles or micelles. It has been shown that the dimensionality of the donor and acceptor distributions can be determined on the basis of FRET measurements.

In the planar geometries, factors determining energy transfer rate has been considered with special attention being given to the contribution from orientational heterogeneity of the donor emission and acceptor absorption transition moments. Analysis of simulated data suggests that FRET in membranes, as compared to intramolecular energy transfer, is substantially less sensitive to the degree of reorientational freedom of chromophores due to averaging over multiple donor-acceptor pairs. The uncertainties in the distance estimation resulting from the unknown mutual orientation of the donor and acceptor transition moments are analyzed.

A method has been developed allowing structural and binding parameters to be recovered by global analysis of two-dimensional array of steady-state FRET data in the special case where energy acceptors distribute between aqueous and lipid phases while donors are embedded in the membrane at a known depth. To test the validity of this approach, correlation and error analyses have been performed using simulated data. It has been shown that the global analysis of FRET efficiency measured at varying acceptor (protein) and lipid concentrations allows the tight cross-correlation between the fitting parameters to be overcome.

The above theoretical models and methodological approaches have been employed to monitor cytochrome c and hemoglobin interactions with bilayer phospholipid membranes. Large unilamellar vesicles composed of zwitterionic lipid phosphatidylcholine and varying amounts of anionic lipid cardiolipin were used as model membranes. Trace amount of fluorescent lipid derivative, anthrylvinyl-phosphatidylcholine was incorporated into the membranes to serve energy donor for the heme moiety of cytochrome c. Energy transfer efficiency was measured at different lipid and protein concentrations to obtain extensive set of data, which were further analyzed globally in terms of adequate models of protein adsorption and energy transfer on the membrane surface. It has been found that cytochrome c association with membranes containing 10 mol% of cardiolipin can be described in terms of a number of equilibrium binding models combined with FRET model assuming random acceptor distribution at the membrane surface with a distance of 3.4-3.6 nm between the bilayer center and the heme moiety of cytochrome c. However, increasing the cardiolipin content to 20 or 40 mol% (at low ionic strength) resulted in a different behavior of FRET profiles, inconsistent with the concepts of equilibrium adsorption of cytochrome c at the membrane surface and/or random acceptor distribution. To explain this fact, several possibilities are analyzed, including cytochrome c-induced formation of non-bilayer structures or clusters of charged lipids, changes in the lipid packing and bilayer elastic properties, which make the depth of cytochrome c penetration into the bilayer dependent on the protein surface density. Quantitative analysis of hemoglobin binding to model phospholipid membranes suggested the existence of two types of hemoglobin-lipid complexes with distinct binding parameters and level of transverse protein localization in the bilayer. In the first type of complex hemoglobin is irreversibly bound to the membrane via partial insertion into the bilayer. In the second type of complex the protein is loosely bound to the surface of the bilayer.

Keywords: energy transfer, FRET, membranes, lipid-protein interactions, cytochrome с, hemoglobin, anthrylvinyl, liposomes.

Размещено на Allbest.ur