Спектральні прояви взаємодії ціанінових барвників у водних розчинах та на поверхні ДНК

Размещено на http://www.allbest.ru/

КИЇВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ІМЕНІ ТАРАСА ШЕВЧЕНКА

АВТОРЕФЕРАТ

СПЕКТРАЛЬНІ ПРОЯВИ ВЗАЄМОДІЇ ЦІАНІНОВИХ БАРВНИКІВ У ВОДНИХ РОЗЧИНАХ ТА НА ПОВЕРХНІ ДНК

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана на кафедрі експериментальної фізики фізичного факультету Київського національного університету імені Тараса Шевченка

Науковий керівник: доктор фізико-математичних наук, професор Ящук Валерій Миколайович, Київський національний університет імені Тараса Шевченка, завідувач кафедри експериментальної фізики фізичного факультету

Офіційні опоненти:

доктор фізико-математичних наук, професор Остапенко Ніна Іванівна, Інститут фізики НАН України, провідний науковий співробітник відділу фотоактивності;

кандидат фізико-математичних наук, доктор біологічних наук, професор Говорун Дмитро Миколайович, Інститут молекулярної біології і генетики НАН України, заступник директора з наукової роботи, завідувач відділу молекулярної біофізики.

Провідна установа: Інститут фізики напівпровідників ім. В.Є. Лашкарьова НАН України, м. Київ

З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Київського національного університету імені Тараса Шевченка за адресою: 01033, м. Київ, вул. Володимирська, 58.

Автореферат розісланий " 21" квітня 2005 року.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради Д 26.001.23, доктор фізико-математичних наук, професор Поперенко Л.В.

Загальна характеристика роботи

Актуальність роботи. Ціанінові барвники широко застосовуються в багатьох галузях науки та техніки, зокрема як флюоресцентні зонди для детекції біологічних об'єктів, сенсибілізатори у фотографії, пасивні затвори й активні середовища для лазерів. У більшості випадків застосування ціанінів визначається їх спектральними властивостями, що пов'язані з електронними переходами в цих барвниках, зокрема значеннями довжини хвилі максимуму та напівширини спектрів поглинання і флюоресценції, оптичної густини поглинання та інтенсивності флюоресценції. Тому природно, що процеси утворення агрегатів ціанінів, що можуть викликати зміни вищезазначених властивостей, характер цих змін та умови, за яких такі процеси відбуваються, а також природа та механізми агрегації потребують детального вивчення.

Утворення агрегатів ціанінових барвників найсильніше проявляється у водних розчинах. А оскільки саме у водних розчинах здійснюються дослідження біологічних молекул, зокрема ДНК, то вплив агрегації ціанінових флюоресцентних зондів на чутливість детекції ДНК за допомогою цих зондів може бути значним. Якщо спектральні прояви взаємодії окремих молекул ціанінових барвників з ДНК є достатньо вивченими, то утворення агрегатів ціанінових барвників на ДНК досліджено недостатньо. Окрім того, хоча вплив агрегації на спектри поглинання ціанінів у водному розчині досить добре відомий, недостатньо вивченим є прояв агрегації ціанінів у спектрах флюоресценції, особливо в присутності ДНК. Також недостатньо дослідженим є вплив агрегації барвників у розчині на чутливість детекції ДНК.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота є результатом досліджень фотофізичних властивостей ціанінових барвників, які проводились на кафедрі експериментальної фізики Київського національного університету імені Тараса Шевченка у співробітництві з Інститутом молекулярної біології і генетики НАН України. Тема роботи пов'язана з розробками держбюджетної теми Кабінету міністрів України №01БФ051-12ДП “Розробка фізичних основ створення і дослідження функціональних матеріалів для фотоніки та наноелектроніки”.

Мета роботи полягала у вивченні спектральних проявів агрегації деяких ціанінових барвників у водному середовищі та в присутності ДНК, з'ясуванні просторової будови агрегатів, структури їх електронних рівнів та електронних переходів, а також впливу процесу агрегації на чутливість визначення ДНК ціаніновими барвниками.

Для досягнення поставленої мети необхідно було вирішити такі завдання:

Дослідити спектри поглинання, флюоресценції та збудження флюоресценції деяких ціанінових барвників у водному розчині та в органічних розчинниках за різних значень концентрації та температури. На основі проведених вимірів визначити природу окремих центрів поглинання та флюоресценції, структуру пакування мономерів у агрегаті, зробити висновки про систему електронних енергетичних рівнів та переходів між ними.

Дослідити спектральні властивості барвників у присутності ДНК при різних співвідношеннях концентрацій барвника та нуклеїнової кислоти (НК); визначити природу окремих центрів поглинання та флюоресценції, структуру пакування мономерів у агрегаті, та зв'язок агрегатів з ДНК.

Шляхом аналізу спектрів поглинання та флюоресценції, а також дослідження поляризації та часу затухання флюоресценції J-агергатів, утворених на полінуклеотиді poly(dA)-poly(dT), зробити висновки про структуру пакування мономерів в агрегаті, систему його енергетичних електронних рівнів та переходів між ними, визначити розмір делокалізації електронного збудження.

Об'єкт дослідження - оптичні спектри монометинових ціанінових барвників тіазолового оранжевого (ТО), Cyan 13 та Cyan 40, бісціанінового (К-6) та трисціанінового (К-Т) монометинових барвників, триметинціанінового барвника Cyan iPr у водних розчинах та в присутності ДНК і полінуклеотидів poly(dA)-poly(dT) та poly(dG-dC)-poly(dG-dC).

Предмет дослідження - вплив процесів агрегатоутворення ціанінових барвників у водних розчинах та в присутності НК на оптичні спектри барвників.

Методи дослідження - спектрофотометричні методи; спектролюмінесцентні методи (спектри флюоресценції та збудження флюоресценції, поляризаційні та часові вимірювання); комп'ютерне (зокрема, квантовохімічне) моделювання.

Наукова новизна дослідження. Вперше показано, що довгохвильова флюоресценція досліджуваних ціанінів у водних розчинах належить їх H-агрегатам. Вперше вивчено флюоресцентні властивості H-агрегатів досліджуваних ціанінів, утворених на ДНК. Вперше досліджено структуру електронних енергетичних рівнів та електронні переходи J-агрегату з давидівським розщепленням спектра поглинання, селективно утвореного на АТ-послідовностях ДНК.

Практичне значення одержаних результатів. Отримані результати, що стосуються умов формування та спектральних властивостей агрегатів ціанінових барвників, утворених у водному середовищі та на поверхні ДНК, є важливими для розуміння процесів, що відбуваються в системах ДНК-барвник, зокрема, при детектуванні ДНК, і можуть бути використані як безпосередньо при дослідженні ДНК, так і при розробці нових процедур детектування. Так, результати спектральних досліджень умов агрегації барвників дають можливість встановити оптимальні концентрації барвників - зондів для детектування НК, що вже застосовуються для двофотонно індукованого флюоресцентного зображення внутрішньоклітинних об'єктів, які містять НК [1]. ціаніновий барвник водний

Особистий внесок здобувача. Основний обсяг експериментальної роботи, обробка та аналіз отриманих результатів, формулювання висновків дисертаційної роботи виконані пошукувачем. Частину спектральних досліджень проведено у співпраці з Огульчанським Т.Ю, Лукашовим С.С, Ковальською В.Б. і Погребняком М.Л. Постановка задачі, обговорення й узагальнення результатів проведені з науковим керівником Ящуком В.М. та з основним консультантом з хімічних та біологічних аспектів роботи Ярмолюком С.М.

Апробація результатів дисертації. Матеріали роботи були представлені на Студентській науковій конференції з фізики (Львів, 1999), 8 Європейській конференції зі спектроскопії біологічних молекул (Голандія, Енсхеде, 1999), ХV Науковій конференції з біоорганічної хімії та нафтохімії (Київ, 2000), Міжнародній конференції молодих науковців "Наукові проблеми оптики в XXI сторіччі" (Київ, 2000), 7 Конфренції з методів та застосування флюоресценції: спектроскопія, зображення та зонди (Голандія, Амстердам, 2001), Другій міжнародній конференції молодих науковців "Наукові проблеми оптики та сучасного матеріалознавства" (Київ, 2001), 4 Міжнародній конференції з електронних процесів в органічних матеріалах (Львів, 2002), 5 Міжнародній конференції з електронних процесів в органічних матеріалах (Київ, 2004).

Публікації. Основний зміст роботи відображено у 8 статтях у наукових фахових журналах, 1 -- у збірнику наукових праць, та 4 тезах доповідей на наукових конференціях.

Об'єм та структура роботи. Дисертація складається зі вступу, огляду літератури, експериментальної частини, обговорення результатів, висновків та переліку використаних літературних джерел (139 найменувань). Дисертація викладена на 160 сторінках друкованого тексту і містить 3 таблиці та 66 рисунків.

Основний зміст роботи

У першому розділі наведено теоретичні пояснення спектральних особливостей та передумов утворення барвниками агрегатів різної будови, а також проаналізовано літературні результати експериментальних досліджень агрегації ціанінових барвників у водних розчинах та в присутності НК.

У другому розділі описано процедури приготування розчинів барвників та нуклеїнових кислот; методики досліджень спектрів поглинання, флюоресценції, збудження флюоресценції та анізотропії флюоресценції; також наведено методики проведення температурних вимірювань, розрахунків параметрів, вимірювання часової залежності інтенсивності флюоресценції та проведення комп'ютерного моделювання.

У третьому розділі подано результати експериментальних досліджень та їх обговорення.

Агрегати ціанінових барвників у водному розчині

Досліджено спектри електронного поглинання, флюоресценції та збудження флюоресценції розчинів ціанінових барвників TO, Cyan 13 та Cyan 40 різної концентрації у водному розчині (ТРІС-HCl буфері, pH = 7,5), а також в органічних розчинниках. У спектрах поглинання ТО та Cyan 13 у буфері підвищення концентрації барвника призводить до появи та зростання додаткової смуги, розміщеної з короткохвильового боку відносно максимума, пов'язаного з поглинанням мономерних молекул відповідних барвників. Залежність від концентрації вказує на те, що вищезгадана короткохвильова смуга не пов'язана з суто мономерними, зокрема конформаційними, властивостями молекули барвника.

При підвищенні температури розчину внесок короткохвильового максимуму зменшується. Для розчинів у органічних розчинниках цей короткохвильовий максимум не спостерігається. Наведені вище факти свідчать на користь того, що цей максимум відповідає поглинанню агрегатів молекул барвника. Короткохвильовий зсув агрегатного максимуму відносно мономерного вказує на те, що утворені в буфері агрегати ТО та Cyan 13 є H-агрегатами та мають т.зв. “сендвічеву” структуру, коли напрямки дипольних моментів переходу окремих молекул паралельні, а кут між віссю трансляції та напрямком дипольного моменту переходу молекули лежить між 54,7⁰ та 90⁰ [2]. Поглинання агрегатів ТО спостерігалось також в [3].

У спектрах флюоресценції розчинів ТО та Cyan 40 можна виділити довгохвильову та короткохвильову смуги (у спектрах Cyan 13 вони значною мірою перекриваються). При цьому короткохвильова смуга проявляється сильніше при менших концентраціях та збудженні на довжині хвилі поглинання мономерів барвника, а довгохвильова смуга - при більших концентраціях та збудженні на довжині хвилі поглинання агрегатів. Це дає підстави припустити, що довгохвильова флюоресценція є випромінюванням H-агрегатів барвника. Таке припущення підтверджується спектрами збудження флюоресценції: спектри збудження довгохвильового випромінювання збігаються зі спектрами поглинання H-агрегатів відповідних барвників. В спектрах флюоресценції та збудження флюоресценції проявляються також агрегати барвника Cyan 40, тоді як спектр поглинання його агрегатів складно виділити з загального спектра.

Стоксів зсув для агрегатів перевищує 100 нм, що значно більше, ніж для ціанінових барвників у мономерній формі, і це явище є спільним для трьох досліджуваних барвників. Цей факт може бути частково пов'язаний з переходом агрегату в збудженому стані з вищого на нижчий розщеплений електронний рівень. Проте також можливо, що в збудженому стані в досліджуваних H-агрегатах відбуваються певні процеси, які зумовлюють зниження енергії збудженого електронного стану. Широка безструктурна смуга флюоресценції агрегатів вказує на можливість утворення молекулами агрегату ексимерного стану (що можливе внаслідок, наприклад, (а) зміни в збудженому стані відстані між мономерами, (б) зміни кута між ними чи між віссю молекули та віссю трансляції, або ж (в) внутрішньомолекулярного обертання мономерів на певний кут), причому стан, в якому знаходився агрегат до цього, можна розглядати як передексимерний.

Агрегати ціанінових барвників, утворені за участі ДНК

У результаті проведених досліджень у спектрах поглинання, флюоресценції та збудження флюоресценції монометинових ціанінових барвників ТО, Cyan 13 та Cyan 40 у присутності ДНК виявились деякі спільні риси. По-перше, взаємодія мономерної молекули барвника з ДНК (при малому співвідношенні концентрацій барвника до ДНК) призводить до значного (на 2-3 порядки) підвищення інтенсивності флюоресценції барвника. Це підвищення зумовлене фіксацією молекули барвника в макромолекулі ДНК, що спричиняє значне зменшення імовірності безвипромінювальної дезактивації енергії електронного збудження.

По-друге, при підвищенні концентрації барвників у присутності сталої концентрації ДНК для всіх трьох досліджуваних барвників спостерігається поява в спектрах поглинання максимумів, зсунутих у короткохвильовий бік відносно мономерних. Концентраційна залежність їх вказує на агрегаційну природу, а оскільки для розчинів вільного барвника тих же концентрацій подібні максимуми не спостерігаються, то ці нові максимуми належать не агрегатам, утвореним вільними молекулами барвника, а зв'язаним з ДНК агрегатам. Поступове утворення цих агрегатів, викликане підвищенням концентрації барвника, супроводжується гасінням флюоресценції зв'язаних з ДНК мономерних молекул барвника. Цей факт дає змогу припустити, що агрегат не утворюється в розчині з подальшим зв'язуванням із ДНК цілого агрегату, а відбувається агрегація вільної молекули барвника з іншою, що вже є зв'язаною з ДНК. Взаємодія агрегованих молекул призводить до зміни спектральних властивостей агрегату порівняно з мономером, що й пояснює гасіння мономерної флюоресценції.

Що стосується структури пакування мономерів в агрегаті, то тут слід звернути увагу на те, що спектр поглинання агрегату складається, в основному, з однієї смуги, зсунутої відносно мономерного спектра поглинання у короткохвильовий бік. Це вказує на те, що напрямки дипольних моментів переходу молекул барвника (які практично збігаються з довгою віссю молекули барвника) в агрегаті є паралельними, і кут між напрямком дипольного моменту переходу барвника та віссю трансляції знаходиться в інтервалі між 54,7^о та 90^о [2]. Тобто, як і у випадку агрегатів, утворених вільними молекулами досліджуваних барвників у водному розчині, ми маємо справу з так званою "сендвічевою" структурою.

Як вже зазначалося вище, агрегати монометинових ціанінів, зв'язані з ДНК, утворюються внаслідок взаємодії вільного барвника зі вже зв'язаним з ДНК в мономерній формі. Крім того, з літератури відомо, що всі розглянуті в даній роботі монометини взаємодіють з ДНК відповідно до моделі напівінтеркаляції, яка передбачає таке зв'язування мономера барвника з ДНК, коли один з гетероциклічних залишків барвника розташований між парами нуклеотидних основ, тоді як інший фіксується в борозенці ДНК. Беручи до уваги наведені вище факти, структура агрегату монометинового ціаніну, утвореного за участі ДНК, уявляється наступним чином. Одна з молекул барвника, що входять до складу агрегату, зв'язана з ДНК через механізм напівінтеркаляції, тобто один з гетероциклічних залишків цієї молекули розташований між парами основ ДНК, в той час як інший залишок міститься в борозенці. Залишок, розташований в борозенці, може взаємодіяти з іншою молекулою барвника, і саме з ним, на нашу думку, взаємодіє один з гетероциклів вільного барвника. Тому значення кута між напрямком дипольного моменту переходу барвника та віссю трансляції (що лежить між 54,7^о і 90^о) має бути помітно меншим за 90^о.

Сили, що утримують молекули барвника в агрегаті, - це, на нашу думку, (1) Ван-дер-Ваальсове притягання р-електронних хмаринок гетероциклів, (2) так звані гідрофобні взаємодії, і, крім того, (3) кулонівське притягання позитивно заряджених молекул барвника до негативно зарядженого цукрово-фосфатного кістяка ДНК. Ми вважаємо, що саме негативний заряд ДНК та “гідрофобні взаємодії” є причиною того, що надлишок вільних молекул барвника утворює агрегати саме зі зв'язаними з ДНК мономерами, а не з іншими вільними молекулами. Так, для барвника Cyan 13 утворення незв'язаних з ДНК агрегатів в присутності 910^-6 M п.о. ДНК спостерігалось, починаючи з концентрації барвника 2,510^-5 М (при співвідношенні близько 3 молекул барвника до 1 пари основ ДНК), тобто вже після того, як, на наш погляд, було вже зайнято більшість місць на ДНК, де вільна молекула барвника могла б утворити агрегат зі зв'язаним з ДНК мономером.

Слід зазначити, що короткохвильовий зсув максимумів спектрів поглинання агрегатів, утворених за участі ДНК, відносно максимуму мономерного спектра є більшим, ніж відповідний зсув у випадку агрегатів, утворених вільними барвниками. Для пояснення цього факту в межах припущення, що агрегати, утворені як на ДНК, так і в розчині, є димерами, проаналізовано вираз для величини розщеплення 2M^f₁₂ енергетичних збуджених рівнів при утворенні димера [4].

Аналіз виразу показує, що збільшення розщеплення може бути пов'язано зі (1) збільшенням дипольного моменту переходу молекули при її взаємодії з ДНК, (2) зменшенням відстані між молекулами R₁₂ при утворенні агрегату на ДНК порівняно з незв'язаним агрегатом чи (3) збільшенням кута .

Нами встановлено, що при зв'язуванні з ДНК дипольний момент переходу Cyan 13 практично не змінюється, а дипольний момент TO і Cyan 40 дещо зменшується. Збільшення кута мало імовірне, оскільки одна з молекул, з яких утворено агрегат, зв'язана з ДНК через механізм напівінтеркаляції, а інша розташована в борозенці. Причиною збільшення розщеплення може бути зменшення відстані між молекулами R₁₂, оскільки взаємне відштовхування позитивних зарядів молекул барвника при утворенні агрегату на ДНК компенсується їх взаємодією з негативними зарядами цукрово-фосфатного кістяку ДНК. Величина розщеплення залежить від третього ступеню R₁₂, тому для збільшення розщеплення вдвічі (що спостерігається, зокрема, для TO та Cyan 13) необхідне зменшення відстані лише в 1,26 раза. Проте не слід виключати також того, що на ДНК утворюються агрегати, які складаються з трьох чи більше молекул, що також призвело б до більшого розщеплення, ніж для димера.

Спектри флюоресценції агрегатів монометинових ціанінів, зв'язаних з ДНК, як і спектри агрегатів вільних барвників, характеризуються значним довгохвильовим зсувом відносно спектрів поглинання. Наявність такого великого Стоксового зсуву, на нашу думку, свідчить про те, що за час перебування у збудженому стані в агрегаті відбувається внутрішній процес (наприклад, утворення ексимеру), що спричиняє помітне зниження енергії збудженого стану.

Гомобіс- та гомотрисціанінові барвники: посилення процесів агрегації внаслідок ковалентного з'єднання хромофорів

Нами досліджено спектральні прояви агрегаційних процесів у водних розчинах та в присутності ДНК бісціанінового К-6 та трисціанінового К-Т барвників, що містять відповідно 2 та 3 барвники Cyan 40. Порівнявши їх спектральні властивості з властивостями барвника Cyan 40, можна зробити наступні висновки.

Об'єднання двох чи трьох хромофорів алкільним ланцюжком (лінкером), що практично не впливає на -електронні системи окремих хромофорів, значно посилює процеси агрегації цих барвників як у водному розчині, так і в присутності ДНК. Так, для водних розчинів К-6 та К-Т найменшої з досліджених концентрацій 10^-6 М смуга поглинання агрегатів домінує в спектрі, тоді як мономерна смуга слабко проявляється у вигляді плеча. Ймовірно, причиною тому є те, що для біс- чи трисціаніну може мати місце утворення агрегату між хромофорами однієї молекули, що може відбуватись за як завгодно малої концентрації барвника. Можливо також, що для біс- та трисціанінових барвників посилюються процеси утворення агрегатів між різними молекулами за рахунок (1) більшого загального розміру молекули, що посилює так звані гідрофобні взаємодії, та (2) більшої загальної площі -електронних систем, що посилює Ван-дер-Ваальсові взаємодії.

На відміну від Cyan 40, для К-6 та К-Т у спектрах поглинання спостерігаються дві смуги (близько 400-408 та 425 нм), зсунуті в короткохвильовий бік відносно мономерної (452 нм), які пов'язані, як нами показано, з поглинанням агрегатів. При цьому, якщо смуга при 425 нм, як і для Cyan 40, відповідає димерним агрегатам, то найбільш короткохвильова агрегатна смуга (як це описано для інших барвників в [3]) відповідає агрегатам вищого порядку, що не спостерігалось для Cyan 40. Ці агрегати утворюються за участі кількох молекул і складаються з трьох чи більше хромофорів.

Як і для барвника Cyan 40, агрегати К-6 та К-Т, як утворені у водному розчині, так і зв'язані з ДНК, мають "сендвічеву" структуру, що випливає з короткохвильового зсуву максимумів спектрів поглинання агрегатів відносно відповідних максимумів мономерних спектрів. Крім того, агрегати К-6 і К-Т, подібно до агрегатів Cyan 40, характеризуються надзвичайно великим, порівняно з мономерами, довгохвильовим зсувом спектрів флюоресценції. Тому можна припустити, що в збудженому стані агрегатів К-6 та К-Т відбуваються такі ж процеси, як і в агрегатах Cyan 40, які призводять до зниження енергії збудженого стану агрегату. Таке припущення є можливим, оскільки агрегати К-Т, К-6 і Cyan 40 утворені з однакових хромофорів і мають "сендвічеву" структуру.

Нами також досліджені спектральні властивості триметинціанінового барвника Cyan iPr у водному буфері та в присутності ДНК, а також у присутності полінуклеотидів poly(dA)-poly(dT) та poly(dG-dC)-poly(dG-dC).

В той час як у спектрах поглинання та флюоресценції вільного барвника проявляється в основному мономерна смуга (максимум спектра поглинання близько 542 нм), у спектрах Cyan iPr у присутності ДНК поряд з мономерною з'являється чітко виражена довгохвильова смуга поглинання, розташована близько 583 нм. Відносна інтенсивність цієї довгохвильової смуги також залежить від концентрації барвника, що свідчить про її агрегаційну природу. Довгохвильовий зсув смуги поглинання агрегатів відносно мономерної смуги свідчить про те, що агрегатна смуга відповідає J-агрегатам молекул Cyan iPr. Утворення незв'язаних з ДНК агрегатів за рахунок "виштовхування" молекул барвника в агрегати молекулами ДНК є малоймовірним, оскільки концентрація ДНК у розчині (610^_5 M п.о.) є занизькою для цього і, крім того, гідратовані молекули ДНК та барвника є різноіменно зарядженими. Отже, присутність ДНК у водному розчині Cyan iPr призводить до утворення зв'язаних з ДНК J-агрегатів молекул барвника.

Спектри поглинання розчинів барвника в присутності poly(dG-dC)-poly(dG-dC) є близькими до спектрів поглинання розчинів вільного Cyan iPr. В той же час, якщо для розчину Cyan iPr у присутності poly(dA)-poly(dT) при концентрації барвника 10^-6 M обриси спектра поглинання є близькими до обрисів спектра розчину барвника в буфері, то при підвищенні концентрації барвника до 10^-5 M у спектрі з'являються смуги з максимумами близько 603 та 574 нм, а при концентрації барвника 310^-5 M ці смуги домінують в спектрі. Специфічність саме до АТ-послідовностей ДНК указує на те, що агрегати утворені в борозенці ДНК [5]. Довгохвильовий зсув смуг J-агрегату, утвореного на poly(dA)-poly(dT), порівняно зі смугами агрегату, утвореного на ДНК, може бути пояснений більшою однорідністю структури борозенки синтетичного полінуклеотиду. Ми вважаємо, що більш однорідна порівняно з ДНК структура борозенки полінуклеотиду призводить, з одного боку, до кращої впорядкованості структури J-агрегату і, як наслідок, до підсилення взаємодії між окремими молекулами Cyan iPr в агрегаті, та, з іншого боку, до збільшення розмірів агрегату.

З метою дослідження структури J-агрегатів Cyan вiPr, утворених на poly(dA)-poly(dT), було вивчено спектри поглинання розчинів барвника різних концентрацій у присутності 3,5·10^-5 M п.о. poly(dA)-poly(dT). При найменшій з-поміж досліджених концентрацій барвника 1,25·10^-6 M (тобто при співвідношенні одна молекула барвника до 28 пар основ полінуклеотиду) в спектрі поглинання спостерігається смуга з максимумом при 550 нм, що відповідає поглинанню зв'язаних з poly(dA)-poly(dT) мономерів Cyan вiPr.

При збільшенні концентрації барвника внесок у спектр поглинання мономерної смуги зменшується, натомість зростає внесок J-агрегатів з максимумами при 574 нм (смуга J1) та 603-606 нм (смуга J2). Хоча чітка ізобестична точка відсутня, близько 563 нм значення молярного коефіцієнту екстинкції всіх спектрів є досить близькими. Цей факт може вказувати на те, що на полінуклеотиді утворюються агрегати однакової геометричної структури, проте різного розміру, спектр кожного з яких містить обидві смуги J1 та J2. У цьому випадку можна припустити, що агрегати, які містять різну кількість молекул барвника, мають близькі значення молярного коефіцієнту екстинкції на довжині хвилі 563 нм. Існування агрегатів різного розміру підтверджується також і тим, що збільшення концентрації барвника з 1,5·10^-5 M до 4·10^-5 M призводить до зсуву агрегатної смуги J2 з 603 до 606 нм. Крім того, агрегатна смуга J1 проявляється для концентрацій барвника, починаючи з 1,25·10^-5 M (тоді як J2 з'являється, починаючи з 5·10^-6 M). Усі вищенаведені факти дають змогу припустити, що збільшення концентрації барвника при сталій концентрації полінуклеотиду призводить до збільшення кількості молекул барвника в агрегаті, що проявляється в довгохвильовому зсуві та звуженні смуги J2, появі розташованої на 574 нм смуги J1 та кращому розділенні цих двох агрегатних смуг.

Таким чином, з усього зазначеного вище можна зробити висновок, що положення агрегатної смуги поглинання J1 (574 нм) не залежить від розміру агрегату, тоді як смуга J2 зсувається в довгохвильову область спектра при збільшенні числа молекул в агрегаті.

Якщо спектр поглинання J-агрегатів Cyan вiPr складається з двох добре розділених смуг, то агрегатний спектр флюоресценції містить лише одну смугу, форма якої не залежить від довжини хвилі збудження. Це означає, що обидва поглинальні переходи викликають один і той же флюоресцентний перехід. Спектр флюоресценції є дзеркально-симетричним до смуги поглинання J2. Отже, флюоресценція J-агрегату є випромінюванням зі збудженого рівня енергії, що відповідає переходу J2.

Згідно з нашим припущенням, наявність двох розділених смуг у спектрі поглинання J-агрегатів може бути пов'язана з давидівським розщепленням екситонної зони агрегату. Тобто, обидві смуги J1 та J2 відповідають одному агрегату, в якому перші (найнижчі) збуджені синглетні рівні молекул Cyan вiPr утворюють унаслідок колективізації не одну, а дві екситонні зони, причому з верхньої збудження безвипромінювально передається на нижню. Щоб перевірити це припущення, було проведено дослідження поляризації флюоресценції J-агрегатів.

При збудженні флюоресценції на довжині хвилі, що відповідає максимуму смуги J2, анізотропія (r) має значення 0,16, в той час як при збудженні на довжині хвилі, що відповідає максимуму смуги J1, маємо r = - 0,04. Значення кута б між напрямками дипольного моменту поглинального переходу, якому відповідає смуга J1, та дипольного моменту флюоресцентного переходу (останній, як ми припустили, паралельний напрямку дипольного моменту поглинального переходу, якому відповідає смуга J2) можна оцінити за формулою

де r₅₇₄ та r₆₀₇ - значення r при збудженні флюоресценції на довжині хвилі 574 та 607 нм відповідно, звідки отримуємо б = 66^o. Проте цілком можливо, що на значення анізотропії при збудженні флюоресценції на 574 нм впливає також смуга J2, а отже, б є насправді більшим за 66^o. Можна припустити, що взаємна орієнтація векторів дипольних моментів поглинальних переходів у екситонні зони агрегату близька до перпендикулярної. Наявність значного кута між напрямками дипольних моментів поглинальних переходів характерна для випадку давидівського розщеплення. Каша [6], розглядаючи теоретично випадок агрегатів спіральної структури, дійшов висновку, що вектор дипольного моменту одного з дозволених поглинальних переходів такого агрегату орієнтований паралельно до осі спіралі, тоді як іншого (інших) - перпендикулярно. Отримані нами результати узгоджуються з передбаченнями структури електронних енергетичних рівнів агрегату спіральної форми, зробленими Каша [6].

Таким чином, можна зробити припущення про те, що особливості структури пакування мономерів у J-агрегатах триметинціанінового барвника Cyan вiPr, утворених у борозенці poly(dA)-poly(dT), зумовлюють давидівське розщеплення структури збуджених електронних рівнів агрегату. Поглинальні переходи з основного рівня можливі на два розщеплені рівні (що належать двом розщепленим екситонним зонам), проте флюоресцентні переходи відбуваються лише з нижнього, в той час як збудження з вищого рівня переходять на нижчий внаслідок безвипромінювальних процесів..

На основі отриманих результатів ми припустили, що J-агрегати Cyan iPr мають спіральну структуру й утворюються у малій борозенці полінуклеотиду. Крім того, в спектрах поглинання агрегату проявляються два поглинальних електронних переходи, причому вектор дипольного моменту більш довгохвильового з них паралельний осі спіралі, а більш короткохвильового - перпендикулярний їй. Ці дипольні моменти є сумами відповідних проекцій дипольних моментів переходу окремих молекул. На основі цього можна припустити, що проекції дипольних моментів переходу молекул агрегату на вісь спіралі являють собою класичний J-агрегат структури “голова до хвоста”. Тому утворений у борозенці полінуклеотиду J-агрегат можна уявити, на нашу думку, як звичайний J-агрегат структури “голова до хвоста”, “скручений” у спіраль.

В програмі HyperChem нами було побудовано та оптимізовано геометрію двох J-агрегатів різної структури (“вертикальної” та “горизонтальної”), утворених в малій борозенці poly(dA)-poly(dT) з шести молекул Cyan iPr згідно з висловленим вище припущенням. Наведені гіпотетичні структури відрізняються одна від іншої кутом, який утворює довга вісь окремої молекули барвника в агрегаті з віссю спіралі. Для “вертикальної” та ”горизонтальної” моделей цей кут становить 37^o та 70^o відповідно. Разом з тим, для обох моделей на один оберт спіралі припадає близько шести молекул барвника.

Щоб оцінити розмір делокалізації збудження в J-агрегатах барвника Cyan вiPr, виміряно час життя збудженого електронного синглетного стану (час затухання флюоресценції) J-агрегату, а також зв'язаного з полінуклеотидом мономера Cyan вiPr. Обчислення показали, що час затухання становить для зв'язаного з полінуклеотидом мономера ^m = 0.8 нс, а для агрегату ^J = 0.15 нс. Відомо, що число молекул барвника в агрегаті, на яких делокалізоване збудження (N), можна оцінити з відношення радіаційних часів життя флюоресценції мономера (^m_rad) та J-агрегату (^J_rad) [7].

Нами визначено, що величини квантового виходу флюоресценції мономера та агрегату Cyan вiPr є одного порядку, тому для оцінки розміру делокалізації можна вважати, як це зазвичай роблять, що відношення радіаційних часів життя дорівнює відношенню часів затухання флюоресценції. Знаходимо розмір делокалізації N 7.

Для порівняння з отриманим вище результатом нами було також зроблено оцінку розміру делокалізації збудження N з відношення напівширин спектральних смуг агрегату та мономера.

Значення напівширин для мономерів та агрегатів Cyan вiPr становлять відповідно _0.5^m = 1260 см^-1 та _0.5^J = 470 см^-1. Обчисливши розмір делокалізації, отримуємо N 11.

Таким чином, різні методи оцінки розміру делокалізації збудження в J-агрегаті (за напівширинами смуг поглинання та за часом життя флюоресценції) показали результати одного порядку. Отже, для досліджених концентрацій барвника та полінуклеотиду розмір делокалізації становить близько N 7-11. Такий результат відповідає нашим уявленням про геометричну будову J-агрегату та структуру його електронних рівнів. Так, згідно з наведеною вище моделлю, агрегат має спіральну структуру, причому на один оберт спіралі припадає близько шести молекул барвника. Таким чином, якщо розмір делокалізації становить щонайменше сім молекул, то електронне збудження агрегату охоплює принаймні один цілий оберт спіралі. З іншого боку, саме зі спіральною структурою агрегату, на нашу думку, пов'язане давидівське розщеплення в спектрі поглинання агрегату. Отже, розмір делокалізації збудження, більший за оберт спіралі, відповідає розщепленому спектру поглинання барвника (а також іншим результатам, зокрема результатам поляризаційних досліджень). Проте слід зауважити, що, оскільки зі збільшенням розміру агрегату спостерігається довгохвильовий зсув смуги J2, то розмір делокалізації збудження залежить від геометричного розміру агрегату.

Висновки

Методами спектрофотометрії та флюорометрії вперше досліджено процеси утворення агрегатів низки ціанінових барвників у водному розчині та в присутності ДНК. Зроблено висновки про просторову будову агергатів, структуру їх електронних рівнів та процеси переходу між ними.

Доведено, що довгохвильова флюоресценція ціанінових барвників TO, Cyan 13 та Cyan 40 у водних розчинах зумовлена їхніми H-агрегатами. Висловлено припущення про те, що завеликий як для ціанінових барвників Стоксів зсув для H-агрегатів пов'язаний з процесами перебудови агрегатів в збудженому електронному стані.

Встановлено, що на ДНК барвники TO, Cyan 13 та Cyan 40 утворюють агрегати H-типу. Вони утворюються через взаємодію незв'язаних молекул барвника зі зв'язаними з ДНК у вигляді мономера.

Виявлено, що триметинціаніновий барвник Cyan вiPr селективно утворює в борозенці AT-ділянок ДНК J-агрегати, у спектрах електронного поглинання яких проявляється давидівське розщеплення енергетичних рівнів. Показано, що спектральні прояви цих J-агрегатів узгоджуються з моделлю Каша для енергетичних рівнів агрегатів спіральної форми.

Результати досліджень можуть бути використані та вже застосовуються для розробки новітніх методів детекції ДНК флюоресцентними зондами, зокрема при встановленні оптимальних концентрацій зондів, а також для специфічної детекції ділянок ДНК, збагачених на АТ-пари.

Подяка

Автор висловлює щиру подяку кандидату хімічних наук Ярмолюку С.М. (Інститут молекулярної біології і генетики НАН України) за люб'язно надані барвники та цінні консультації з хімічних і біологічних аспектів роботи.

Перелік цитованої літератури

1. Ohulchanskyy T.Y., Pudavar H.E., Yarmoluk S.M., Yashchuk V.M., Bergey E.J, Prasad P.N. A monomethine cyanine dye Cyan 40 for two-photon excited fluorescence detection of nucleic acids and their visualization in live cells // Photochemistry and Photobiology. - 2003. - Vol.77, №2. - P.138-145.

2. Nygren J., Svanvik N., Kubista M. The Interactions Between the Fluorescent Dye Thiazole Orange and DNA // Biopolymers. - 1998. - Vol.46. - P.39-51.

3. Herz A.H. Dye-Dye Interactions of Cyanines in Solution and at AgBr Surfaces // Photographic Science and Engeneering. - 1974. - Vol.18, №3. - P.323-335.

4. Поуп М., Свенберг Ч. Электронные процессы в органических кристаллах. - М.: Мир, 1985. - Т.1. - 543 с.

5. Kumar C.V., Turner R.S., Asuncion E.H. Groove binding of a styrylcyanine dye to the DNA double helix: the salt effect // Journal of Photochemistry and Photobiology A. - 1993. - Vol.74. - P. 231-238.

6. Kasha M. Energy transfer mechanisms and the molecular exciton model for molecular aggregates // Radiation Research. - 1963. - Vol.20. - P.55-71.

7. Малышев В.А. Длина локализации одномерного экситона и температурная зависимость излучательного времени жизни замороженных растворов красителей с J-агрегатами // Оптика и cпектроскопия. - 1991. - Т.71, №6. - С.873-875.

8. Bakalis L.D., Knoester J. Linear absorption as a tool to measure the exciton delocalization length in molecular assemblies // Journal of Luminescence. - 2000. -Vol.87-89. - P.66-70.

Перелік наукових праць, опублікованих за темою дисертації

9. Ogul'chansky T.Yu., Yashchuk V.M., Losytskyy M.Yu., Kocheshev I.O., Yarmoluk S.M. Interaction of cyanine dyes with nucleic acids. XVII. Towards an aggregation of cyanine dyes in solutions as a factor facilitating nucleic acid detection // Spectrochimica Acta Part A. - 2000. - Vol.56, №4. - P.805-814.

10. Огульчанський Т.Ю., Ящук В.М., Ярмолюк С.М., Лосицький М.Ю. Взаємодія ціанінових барвників з нуклеїновими кислотами. 14. Спектральні особливості деяких монометинових бензотіазолових ціанінових барвників та їхньої взаємодії з ДНК // Біополімери і клітина. - 2000. - Т.16, №5. - С.345-355.

11. Лукашов С.С., Лосицький М.Ю., Сломінський Ю.Л., Ярмолюк С.М. Взаємодія ціанінових барвників з нуклеїновими кислотами. 7. Карбоціанінові барвники, заміщені в поліметиновому ланцюзі, як можливі зонди для флюоресцентної детекції нуклеїнових кислот // Біополімери і клітина. - 2001. - Т.17, №2. - С.169-177.

12. Ogul'chansky T.Yu., Losytskyy M.Yu., Kovalska V.B., Yashchuk V.M., Yarmoluk S.M. Interactions of cyanine dyes with nucleic acids. XXIV. Aggregation of monomethine cyanine dyes in presence of DNA and its manifestation in absorption and fluorescence spectra // Spectrochimica Acta Part A. - 2001. - Vol.57, №7. - P.1525-1532.

13. Ogulchansky T.Yu., Losytskyy M.Yu., Kovalska V.B., Lukashov S.S., Yashchuk V.M. , Yarmoluk S.M. Interaction of cyanine dyes with nucleic acids. XVIII. formation of the carbocyanine dye J-aggregates in nucleic acid grooves // Spectrochimica Acta Part A. - 2001. - Vol.57, №13. - P.2705-2715.

14. Yarmoluk S.M., Losytskyy M.Yu., Yashchuk V.M. Nonradiative deactivation of the electronic excitation energy in cyanine dyes: influence of binding to DNA // Journal of Photochemistry and Photobiology B. - 2002. - Vol.67, №1. - P.57-63.

15. Losytskyy M.Yu., Yashchuk V.M., Lukashov S.S., Yarmoluk S.M. Davydov Splitting in Spectra of Cyanine Dye J-Aggregates, Formed on the Polynucleotide // Journal of Fluorescence. - 2002. - Vol.12, №1. - P.109-112.

16. Losytskyy M.Yu., Yashchuk V.M., Yarmoluk S.M. The Electronic Transitions in the Cyanine Dye J-Aggregates, Formed on the Poly(dA)-Poly(dT) Polynucleotide // Molecular Crystals and Liquid Crystals. - 2002. - Vol.385. - P.27-32.

17. Ogul'chansky T.Yu., Yarmoluk S.M., Yashchuk V.M., Losytskyy M.Yu. The spectral response on DNA interaction with some monomethyne cyanine dyes // Spectroscopy of Biological Molecules: New Directions. - Dordrecht/Boston/London: Kluwer academic publishers, 1999. - P.309-310.

18. Losytskyy M.Yu., Yarmoluk S.M., Yashchuk V.M., Ogul'chanskyy T.Yu., Lukashov S.S. Davydov Splitting in Spectra of Cyanine Dye J-Aggregates, Formed on the Polynucleotide // International Young Scientists Conference “Scientific Problems in Optics in XXI Century”, Abstracts book. - Kyiv, 2000. - P.43-44.

19. Losytskyy M.Yu., Yarmoluk S.M., Yashchuk V.M., Ogul'chanskyy T.Yu., Lukashov S.S. Davydov Splitting in Spectra of Cyanine Dye J-Aggregates, Formed on the Polynucleotide // 7^th Conference of Methods and Applications of Fluorescence: Spectroscopy, Imaging and Probes, Book of Abstracts. - Amsterdam (The Netherlands), 2001. - P.122.

20. Losytskyy M.Yu., Yashchuk V.M., Yarmoluk S.M., Ogul'chanskyy T.Yu., Lukashov S.S. The Cyanine Dye J-Aggregates, Formed on the Polynucleotide // 4^th International Conference on Electronic Processes in Organic Materials, Abstracts book. - Lviv, 2002. - P. 94-95.

21. Losytskyy M.Yu., Yashchuk V.M., Yarmoluk S.M., Malyukin Yu.V., Pogrebnjak M.L. Study of the geometry structure and excitation delocalization size of cyanine dye J-aggregates formed on polynucleotide // 5^th International Conference on Electronic Processes in Organic Materials, Abstracts book. - Kyiv, 2004. - P.135.

Анотація

Лосицький М.Ю. Спектральні прояви взаємодії ціанінових барвників у водних розчинах та на поверхні ДНК. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата фізико-математичних наук за спеціальністю 01.04.05 - оптика, лазерна фізика. Київський національний університет імені Тараса Шевченка, Київ, 2005.

Дисертацію присвячено експериментальному дослідженню спектральними методами процесів агрегації низки ціанінових барвників у водних розчинах, а також процесів утворення зв'язаних з ДНК агрегатів цих барвників. Встановлено, що довгохвильова флюоресценція досліджуваних монометинових ціанінових барвників у водних розчинах, а також у присутності ДНК належить H-агрегатам цих барвників. Утворення агрегатів H-типу досліджуваних монометинціанінових барвників у присутності ДНК відбувається шляхом взаємодії незв'язаної молекули барвника з іншою, що вже зв'язалась з ДНК у вигляді мономера. Виявлено, що триметинціаніновий барвник Cyan вiPr селективно утворює в борозенці AT-ділянок ДНК J-агрегати, у спектрах поглинання яких проявляється давидівське розщеплення. Дослідженням спектрів поглинання, флюоресценції та поляризації флюоресценції показано, що результати, отримані для J-агрегатів Cyan вiPr, узгоджуються з моделлю Каша для електронних енергетичних рівнів агрегатів спіральної форми.

Аннотация

Лосицкий М.Ю. Спектральные проявления взаимодействия цианиновых красителей в водных растворах и на поверхности ДНК. - Рукопись.

Диссертация на соискание научной степени кандидата физико-математических наук по специальности 01.04.05 - оптика, лазерная физика. Киевский национальный университет имени Тараса Шевченко, Киев, 2005.

Диссертация посвящена экспериментальному исследованию спектральными методами процессов агрегации ряда цианиновых красителей в водных растворах, а также процессов образования связанных с ДНК агрегатов этих красителей. Установлено, что длинноволновая флуоресценция исследованных монометиновых цианиновых красителей в водных растворах, а также в присутствии ДНК принадлежит H-агрегатам этих красителей. Образование агрегатов H-типа исследованных монометинцианинових красителей в присутствии ДНК происходит путем взаимодействия несвязанной молекулы красителя с другой, связанной с ДНК в виде мономера. Обнаружено, что триметинцианиновый краситель Cyan вiPr селективно образовывает в бороздке AT-участков ДНК J-агрегаты, в спектрах поглощения которых проявляется давыдовское расщепление. Исследование спектров поглощения, флуоресценции и поляризации флуоресценции показало, что полученные для J-агрегатов Cyan вiPr результаты согласовываются с моделью Каша для электронных энергетических уровней агрегатов спиральной формы.

Abstract

Losytskyy M.Yu. Spectral manifestations of the interaction of the cyanine dyes in water solutions and on the DNA surface. - Manuscript.

Thesis submitted for the scientific degree of Candidate of Sciences in Physics and Mathematics on the speciality 01.04.05 - optics and laser physics. Kyiv National Taras Shevchenko University, Kyiv, 2005.

Thesis is devoted to the experimental study by the spectral methods of cyanine dyes aggregation processes in aqueous solutions, as well as formation of these dyes aggregates bound with DNA. It was established that the long-wave fluorescence of the studied monomethine cyanines in water solutions as well as in the presence of DNA belongs to the H-aggregates of these dyes. The abnormally big as for cyanine dyes Stokes shift of H-aggregates, as well as their wide unstructured fluorescence spectrum is believed to be connected with the transformation process that happens in an excited state of an aggregate. It was supposed that during this transformation an excimer state is formed between aggregate monomers. It is possibly, that the excimer state formation process is preceded by the excited aggregate nonradiative transition from the upper splitted excited level to the lower one. It was first established that the studied dyes TO, Cyan 13 and Cyan 40 form H-aggregates on DNA. The aggregates are formed by the interaction of the unbound dye molecule with the one already bound to DNA in monomeric form.

It was first revealed that the trimethinecyanine dye Cyan вiPr selectively forms J-aggregates in the groove of DNA AT-sequences. In J-aggregates absorption spectra the davydov splitting is manifested. The spectrum of fluorescence excitation polarization revealed the different polarization of the electronic transitions corresponding to the two splitted J-aggregate bands. The study of absorption, fluorescence and fluorescence polarization spectra showed that the results obtained for Cyan вiPr J-aggregates are consistent with the Kasha model of electronic energy levels for helical aggregates. The long- and short-wave electronic transitions to the splitted J-aggregate excited levels are considered to be directed respectively parallel and perpendicular to the J-aggregate helix axis. The study of the fluorescence intensity time dependence, as well as the study of the spectral band width of monomers and J-aggregates showed that the electronic excitation in Cyan вiPr J-aggregates is delocalized over about 7-11 dye monomer units.

The results of the study could be used and already partially do for the development of the DNA detection procedures, as well as for the specific detection of double-stranded AT-sequences of DNA.

Размещено на Allbest.ru