Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ФІЗІОЛОГІЇ ІМ. О.О. БОГОМОЛЬЦЯ

03.00.02 - біофізика

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Маслов Віталій Юрійович

Київ 2005

Дисертацією є рукопис

Роботу виконано у Інституті фізіології ім. О.О. Богомольця Національної Академії Наук України

Наукові керівники:доктор біологічних наук, професор, академік НАН України Скок Володимир Іванович Інститут фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України, завідувач відділом фізіології вегетативної нервової системи

доктор біологічних наук Фєдулова Світлана Анатоліївна Інститут фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України, завідувач лабораторією синаптичної передачі

Офіційні опоненти:доктор біологічних наук Костюков Олександр Іванович Інститут фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України завідувач відділом фізіології рухів

кандидат біологічних наук, доцент Пасічніченко Олег Михайлович Київський Національний Університет імені Тараса Шевченка, біологічний факультет, доцент кафедри фізіології людини та тварин

Провідна установа:Інститут біохімії ім. О.В.Палладіна НАН України, м. Київ

Захист відбудеться " 21 " червня 2005 р. о " 14 " годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.198.01 при Інституті фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України за адресою: вул. Богомольця, 4, Київ 01024.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України за адресою: вул. Богомольця, 4, Київ 01024.

Автореферат розісланий 19.05.2005 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

доктор біологічних наукЗ.О. Сорокіна-Маріна

нейрон ганглій внутрішньоклітинний шийний

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Дослідження синаптичної передачі та нейронної організації вегетативних гангліїв є важливим не лише у зв'язку з їх роллю у регуляції діяльності внутрішніх органів та серцево-судинної системи, але і представляє великий інтерес для нейрофізіології у цілому. Вегетативні ганглії, у першу чергу симпатичні паравертебральні, є системами з відносно простими нервовими зв'язками, що робить їх зручними моделями при дослідженні процесів передачі інформації у нервовій системі. Це перш за все стосується таких фундаментальних закономірностей будови нервової системи як конвергенція та дивергенція пресинаптичних аксонів.

Вегетативні нейрони, що іннервують різні органи-мішені, відрізняються за своїми електрофізіологічними, фармакологічними, нейрогістохімічними властивостями, а також за характеристиками фонової активності (Janig, McLachlan, 2003). Найвиразніше фармакологічна специфічність проявляється у різній чутливості синаптичної передачі у симпатичних та парасимпатичних гангліях до дії ряду речовин. Одна з таких сполук, N-децилтропін бромід, має високу селективність блокування у парасимпатичних шляхах (Skok et al., 1991). Інтерес до специфічних парасимпатолітиків викликаний у першу чергу тим, що підвищення парасимпатичного тонусу є однією з основних причин розвитку різних захворювань, наприклад, виразкової хвороби шлунка та дванадцятипалої кишки (Okumura et al., 1990). У зв'язку з цим було важливим з'ясувати з якою саме частиною молекули цієї речовини пов'язана її специфічна дія, що має значення як для дослідження механізмів гангліоблокуючої дії, так і для можливості створення нових селективних гангліоблокаторів.

Багато припущень щодо функціональної ролі гангліїв у передачі імпульсації грунтуються на результатах, отриманих на ізольованих препаратах при синхронному подразненні усіх волокон, що конвергують на нейронах. Проте це не давало можливості дослідити особливості передачі імпульсації через ганглії у природніх умовах. У першу чергу це стосується поодинокого та множинного входів до нейронів симпатичних гангліїв (Skok, Ivanov, 1983). Хоча постсинаптичні процеси у нейронах гангліїв добре відомі, але характер активності та організація цих входів залишаються дослідженими недостатньо.

Відомо, що фонова активність нейронів симпатичних гангліїв, що іннервують різні органи-мішені, відрізняється за своїми характеристиками (Скок, Іванов, 1989; Janig, 1995), проте даних, отриманих за умов прямої ідентифікації симпатичних нейронів, у літературі небагато.

Усе вищезгадане і визначило необхідність дослідження організації фоновоактивних прегангліонарних входів нейронів симпатичного ганглія, найзручнішим об'єктом для якого є верхній шийний ганглій (ВШГ). Це зумовлено можливістю відводити активність його нейронів у гострих дослідах на наркотизованих тваринах, відносно простою нейронною організацією ганглія та можливістю контролювати протягом експерименту його вхідні та вихідні шляхи.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Роботу було виконано у рамках наукових тем відділу фізіології вегетативної нервової системи Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України: "Функціональна організація і хімічна чутливість нейронів симпатичних та парасимпатичних гангліїв", "Дослідження хемокерованих каналів нейронів вегетативних гангліїв", "Нейронні та хімічні механізми передачі збудження у вегетативних гангліях", "Дослідження клітинних та молекулярних механізмів дії гангліоблокаторів з метою пошуку нових лікарських засобів для корекції діяльності вегетативної нервової системи".

Мета і завдання дослідження. Мета дослідження полягала у з'ясуванні механізмів нейронної організації та характеристик фонової активності поодинокого та множинного прегангліонарних входів, що конвергують на нейроні симпатичного ганглія, а також чутливості синаптичної передачі до дії специфічних гангліоблокаторів. Було поставлено наступні завдання.

Зареєструвати методом внутрішньоклітинного мікроелектродного відведення активність поодинокого та множинного прегангліонарних входів, що конвергують на одному нейроні ВШГ кроля, та провести її статистичний аналіз.

2. Для нейронів з фоновоактивними поодиноким та множинним прегангліонарними синаптичними входами проведено аналіз вкладу цих входів в пульсову модуляцію активності окремого нейрона ВШГ та сумарну активність постгангліонарного нерва. Результати кількісно характеризують впорядковану конвергенцію фоновоактивних входів до нейронів симпатичного ганглія та дають можливість припустити, що множинний вхід до даних нейронів не утворено окремою популяцією прегангліонарних нейронів.

3. Вперше проведено внутрішньоклітинне відведення та визначено характеристики фонової активності антидромно ідентифікованих нейронів ВШГ, що іннервують підщелепну залозу щура.

4. Встановлено, що селективність гангліоблокуючої дії парасимпатолітика N-децилтропін броміду пов'язана з наявністю у його молекулі децильного аліфатичного радикала, а симпатолітична активність збільшується при заміні децильного радикала на гексильний.

Теоретичне та практичне значення роботи

Теоретичне значення отриманих результатів полягає у з'ясуванні механізмів формування фонової активності нейронів симпатичних гангліїв ссавців. На базі отриманих даних конкретизуются уявлення про організацію передачі імпульсації у гангліях. На симпатичному нейроні відбувається впорядкована конвергенція різних по організації прегангліонарних входів (поодинокого та множинного), які, вірогідно, не утворені окремими групами прегангліонарних нейронів. Значення розробленої методики відведення від ідентифікованих нейронів ВШГ, що іннервують підщелепну залозу щура, полягає у тому, що дані нейрони являють собою зручну модель для дослідження специфічності функціонально різних шляхів у вегетативній нервовій системі. Порівняння гангліоблокуючої активності N-децилтропін броміду та його похідних дозволило встановити, що селективна дія даної речовини визначається децильним аліфатичним радикалом. Ці дані можуть бути використані для пошуку нових фармакологічних засобів вибіркового блокування синаптичної передачі у вегетативних шляхах.

Особистий внесок здобувача. При виконанні роботи здобувачем самостійно освоєна методика внутрішньоклітинного відведення від нейронів ВШГ ссавців in situ та розроблена методика антидромної ідентифікації нейронів, що іннервують підщелепну залозу щура, виконано експериментальні дослідження та проведено аналіз отриманих результатів.

Апробація результатів дисертації. Дані, наведені у дисертації, доповідались на поточних наукових семінарах відділу фізіології вегетативної нервової системи та сектору нейрофізіології Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України, XIV з'їзді Українського фізіологічного товариства (Київ, 1994); VII міжнародній науковій конференції ім. М. Кравчука (Київ, 1998); школі для молодих науковців "Мембрани та сигнали" (Київ, 2000); IV конференції Чеського товариства нейронаук (Прага, 2001), XVI з'їзді Українського фізіологичного товариства (Вінниця, 2002), III конференції Українського товариства нейронаук (Донецьк, 2005).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 10 друкованих робіт (4 статті у наукових фахових журналах та тези 6 доповідей).

Структура та обсяг роботи. Робота викладена на 136 сторінках машинописного текту. Дисертація складається з вступу, огляду літератури, опису об'єкта та методів досліджень, результатів досліджень, обговорення результатів, висновків та списку використаних джерел з 238 найменувань. Робота містить 17 рисунків.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ ДИСЕРТАЦІЇ

Об'єкт та методи досліджень

Об'єктом досліджень у даній роботі був верхній (краніальний) шийний ганглій (g. cervicale superius) кроля та щура. Гострі досліди проводили на самцях кролів масою 1.5-2.0 кг та щурах обох статей масою 200-250 г. Досліди по вивченню фонової активності нейронів ВШГ було проведено на кролях (7 тварин) та щурах (18 тварин). Вплив гангліоблокаторів на проведення збудження через ВШГ було досліджено на щурах (12 тварин). Тварин наркотизували введенням уретану в дозі 1-1.2 г/кг маси тварини внутрішньовенно (кролі) або внутрішньочеревно (щури). Доступ до ВШГ виконували за методикою, що принципово не відрізнялась від описаної раніше (Шевелева, 1961). Для усунення механічних рухів ганглія використовували спеціальний плексигласовий фіксатор. У частині дослідів по відведенню фонової активності нейронів ВШГ кроля та у дослідах по дослідженню дії гангліоблокаторів на синаптичну передачу у ВШГ щура постгангліонарний нерв перерізували та затягували у скляну піпетку з відвідним хлор-срібним електродом. У дослідах по дослідженню дії гангліоблокаторів на передачу у ВШГ щура шийний симпатичний нерв (а при відведенні від ідентифікованих нейронів ВШГ щура - постгангліонарний нерв поблизу підщелепної залози) затягували у піпетку з подразнюючим хлор-срібним електродом. Пре- або постгангліонарний нерви подразнювали імпульсами тривалістю від 0.1 до 0.5 мс та амплітудою від 2 до 5 В, частота подразнення складала 0.5 с^-1.

Через операційну рану пропускали фізіологічний розчин наступного складу (мМ): NaCl -117; KCl - 4.7; CaCl₂ - 2.5; MgCl₂ - 1.2; KH₂PO₄ - 1.2; NaHCO₃ - 25; глюкоза - 11; рН - 7.2-7.4.

Досліджувані речовини вводили внутрішньовенно. У дослідах використовували гексаметоній бромід ("Rocher", Франція). N-децилтропін бромід (ІЕМ-1556), N-гексилтропін йодид (ІЕМ-1848), N-метилтропін йодид (ІЕМ-1893) були синтезовані В.Є.Гміро в Інституті експериментальної медицини Російської Академії Медичних Наук (Санкт-Перебург, РФ). Хімічна структура ІЕМ-1556 представлена на рис.1. Структури ІЕМ-1848 та ІЕМ-1893 відрізнялись коротшим аліфатичним радикалом (відповідно гексильним та метильним).

Для відведення фонової активності нейронів ВШГ кроля та щура використовували стандартну методику мікроелектродного внутрішньоклітинного відведення без фіксації потенціала клітини. Мікроелектроди виготовляли з боросилікатних скляних капілярів з філаментом та заповнювали розчином хлористого калію у концентрації 2М. Опір мікроелектродів становив від 40 до 90 МОм. Після проколювання нейрона різницю потенціалів подавали на вхід підсилювача УПТ-2. Реєстрували фонову активність лише тих нейронів, абсолютна величина мембранного потенціалу яких була не нижчою за 40 мВ та залишалась стабільною протягом відведення. Для підсилення активності постгангліонарного нерва використовували спеціально виготовлений підсилювач змінного струму (коефіцієнт підсилення 20 000; смуга пропускання 3-1000 с^-1; шум на закороченому вході 6 мкВ). Електрокардіограму (ЕКГ) відводили за допомогою електродів, які розташовували підшкірно на лівій передній та правій задній лапі тварин. Фонову активність окремого нейрона ВШГ, цілого постгангліонарного нерва та ЕКГ реєстрували на магнітну плівку багатоканального магнітографа НО67, а потім відцифровували та записували у файл на жорсткому диску персонального комп'ютера або безпосередньо вводили у комп'ютер під час досліду. Для реєстрації та подальшого аналізу даних використовували персональний комп'ютер, оснащений 12-ти розрядним аналого-цифровим перетворювачем (АЦП), який забезпечував одночасний запис до чотирьох різних сигналів з частотою дискретизації кожного з них 10⁴ с^-1. Запис активності нейрона з високою частотою дискретизації полегшував процедуру розділення ПД на типи. АЦП та програма запису були розроблені інженером відділу фізіології вегетативної нервової системи Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця О.В. Ріхальським.

Аналіз фонової активності нейронів ВШГ проводили з допомогою спеціально написаної програми, яка давала можливість переглянути вміст файла даних та виміряти параметри імпульсів активності нейрона та ЕКГ. За цими параметрами проводився автоматизований пошук імпульсів, вимірювання та запис у файл послідовності міжімпульсних інтервалів (МІІ) фонової активності нейрона та інтервалів між R-зубцями ЕКГ и ПД (пост-R інтервалів), а також усереднення фрагментів запису активності постгангліонарного нерва синхронно з внутрішньоклітинними ПД. Розділення ПД на типи проводили за формою фази зростання.

Для послідовностей МІІ та пост-R інтервалів (окремо для ПД двох типів) визначали середнє значення та дисперсію тривалості інтервалів і будували гістограми МІІ. Гістограми пост-R интервалів використовували для оцінки синхронізації фонової активності нейронів з пульсовим ритмом. Відповідність розподілень тривалості МІІ (гістограм) теоретичним розподіленням перевірялось з використанням критерія ч², а різниця середніх значень - за допомогою t-критерія Стьюдента. Відмінності розглядались як статистично значимі при Р < 0.05.

Для виділення з активності цілого постгангліонарного нерва сигналів, синхронних з ПД нейрона ВШГ, використовували метод одноканального когерентного (кореляційного) відведення (Тихонов, 1966). Даний метод раніше використовувався для оцінки кількості нейронів, що активуються в умовах фонової активності та при стимуляції прегангліонарних волокон (Скок, Іванов, 1989; 1992). Фрагменти запису активності цілого постгангліонарного нерва тривалістю 40 мс накопичували синхронно з ПД обох типів у запису активності нейрона ВШГ та усереднювали. Проводили 100 накопичень (що відповідає 10-кратному збільшенню відношення сигналу до шуму), цього було, як правило, достатньо для виділення з активності нерва чітко вираженого сигналу, синхронного з внутрішньоклітинним ПД. Для визначення відносного вкладу в активність постгангліонарного нерва розрядів, синхронних с ПД нейрона, виділені сигнали нормували на потужність активності нерва. Для контролю проводили 100 несинхронних накопичень.

Гангліоблокуючу активність досліджуваних речовин визначали за ступенем пригнічення ПД цілого постгангліонарного нерва ВШГ щура in situ, що виникав при подразненні шийного симпатичного нерва. В якості характеристики активності речовин використовували значення ED₅₀ - дози, при введенні якої значення амплітуди ПД становило половину від контрольного.

Результати досліджень та їх обговорення

Вплив N-децилтропін броміду та його похідних на синаптичну передачу у вегетативних гангліях. У серії гострих дослідів було досліджено вплив N-децилтропін броміду (ІЕМ-1556) та його похідних, що мають коротший аліфатичний радикал - гексильний (N-гексил тропін йодид, ІЕМ-1848) та метильний (N-метилтропін йодид, ІЕМ-1893) - на синаптичну передачу через ВШГ щура in situ. При внутрішньовенному введенні ІЕМ-1556 пригнічував амплітуду ПД у внутрішньому сонному нерві, що викликали подразненням шийного симпатичного нерва (рис. 2). Середнє значення ED₅₀, для ІЕМ-1556 склало 7.3 ± 0.5 мг/кг (n=4). Максимальне пригнічення спостерігали на 3-4 хвилині після введення, а відмивання - через 20 хвилин.

Дію ІЕМ-1556 на синаптичну передачу у ВШГ було порівняно з дією класичного гангліоблокатора гексаметонія, який активніше пригнічував ПД. Середне значення ED₅₀ для гексаметонія склало 3.2 ± 0.3 мг/кг (n=3). Максимальне пригнічення відповіді спостерігалось вже на другій, а відмивання на 10-й хвилині після введення препарату. Середні значения ED₅₀ для гексаметонія та ІЕМ-1556 відрізнялись статистично достовірно.

Заміна децильного радикала (ІЕМ-1556) коротшим, гексильним, аліфатичним радикалом призводила до збільшення блокуючої дії речовини на синаптичну передачу через ВШГ. Середнє значення ED₅₀ для ІЕМ-1848 склало 2.0 ± 0.2 мг/кг (n=3). Дія даного препарату починалась одразу після введення, досягала максимума на першій хвилині та закінчувалась через 8-10 хвилин після введення. ІЕМ-1893, що має метильний радикал, також блокував синаптичну передачу через ганглий, але його активність була помітно нижчою аніж у описаних вище препаратів. Середнє значення ED₅₀ для ІЕМ-1893 склало 17.9 ± 2.0 мг/кг (n=3). Максимальне пригнічення ПД спостерігали через 30-40 с, а відновлення відповіді - через 4-5 хв після введення.

Таким чином, відмінності у гангліоблокуючій активності N-децилтропін броміда та його похідних визначаються довжиною аліфатичного радикала, що входить до складу молекул даних речовин.

Вплив даних речовин на синаптичну передачу у парасимпатичних інтракардіальних гангліях щура при внутрішньовенному введенні оціновали за зміною негативного хронотропного ефекту (Ремізов та ін., 1995), при цьому ІЕМ-1556 виявився більше ніж у 40 разів активнішим за гексаметоній. Це підтверджує отримані раніше дані про те, що ІЕМ-1556 є достатньо селективним парасимпатолітиком (Skok et al., 1991). Заміна децильного радикала коротшим гексильним радикалом призводила до зниження парасимпатолітичної активності речовини та підсилювала його симпатолітичні властивості. Таким чином, селективність дії ІЕМ-1556 у якості гангліоблокатора зумовлена наявністю у його структурі децильного радикала. Заміна децильного радикала коротким метильним радикалом призводила до зниження гангліоблокуючої активності. Ці результати можна пояснити наявністю двох механізмів: 1) тривалим, вірогідно незворотнім, зв'язуванням молекули блокатора з рецептором поблизу його каналу через аліфатичний ланцюг та 2) повільним оберненим блокуванням відкритого каналу аммонієвою головкою молекули (Kurenny et al., 1994).

Селективні блокатори синаптичної передачі у парасимпатичних шляхах викликають великий інтерес у зв'язку з тим, що при терапії виразкової хвороби шлунка та дванадцятипалої кишки заживлення виразок проходить успішніше при використанні гангліоблокаторів разом з симпатоміметиками (Лосєв, Кузнецова, 1992). В якості одного з селективних блокаторів-парасимпатолітиків може використовуватись N-децилтропін бромід (ІЕМ-1556).

Швидка синаптична передача у симпатичних та парасимпатичних гангліях здійснюється через активацію нікотинових холінорецепторів, проте її чутливість до дії блокаторів може суттєво відрізнятись. Це відкриває певні можливості для створення нових селективних фармакологічних препаратів для корекції розладів вегетативної нервової системи. Проте дослідження синаптичної передачі у вегетативних гангліях за умови супрамаксимального подразнення прегангліонарних волокон не може повною мірою відображувати особливості передачі імпульсації у природніх умовах. Це викликано тим, що на нейронах вегетативних гангліїв конвергують різні прегангліонарні входи, що активують постгангліонарні нейрони зверх- та підпорогово. Роль даних входів у передачі гангліями імпульсації досліджується у подальших розділах роботи.

Фонова активність та організація прегангліонарних входів, що конвергують на нейроні симпатичного ганглія. Задовго до виконання перших експериментів з внутрішньоклітинним відведенням від нейронів симпатичних гангліїв було запропоновано так звану стохастичну гіпотезу формування активності цих клітин (Bronk, 1939), згідно якої ПД виникають у них в результаті випадкових збігів збуджень, що надходять до них по незалежним прегангліонарним волокнам. Пізніше за допомогою мікроелектродного відведення у фоновій активності нейронів ВШГ кроля було виділено два типи ПД (першого та дугого), що виникали при активації різних входів, які було названо поодиноким та множинним (Skok, Ivanov, 1983). Було встановлено, що поодинокий вхід утворено одним прегангліонарним волокном, здатним при його активації викликати ПД у постгангліонарному нейроні. Множинний вхід викликав у нейронах ПД лише при синхронній активації кількох (найчастіше трьох) волокон.

Якщо гіпотеза про виникнення ПД першого типу внаслідок збудження одного прегангліонарного волокна була достатньо аргументована експериментальними даними, то генерація ПД другого типу не протирічила стохастичній гіпотезі. Припущення щодо наявності у ЦНС синхронізуючого механізму для активності відповідних прегангліонарних нейронів раніше мали лише якісний характер (Blackman, 1975; Скок, Іванов, 1989; Janig, 1995). Для кількісної перевірки стохастичної гіпотези нами було зареєстровано фонову активність нейронів ВШГ кроля, визначено статистичні характеристики послідовностей ПД двох типів, запропоновано відповідну модель та проведено її теоретичний аналіз.

Для аналізу ефектів, викликаних активацією поодинокого та множинного прегангліонарних входів, нами було відібрано записи фонової активності 20 нейронів ВШГ кроля, у яких спостерігались ПД двох типів. Фрагмент активності одного такого нейрона представлено на рис.3. За допомогою спеціально написаної програми за записами фонової активності формували послідовності МІІ окремо для ПД двох типів. Також для кожного нейрона визначали частоту підпорогових ЗПСП. Середні значення та стандартні похибки частот виникнення ПД першого та другого типу та підпорогових ЗПСП склали відповідно 2.1 + 0.3, 1.9 + 0.2 та 3.4 + 0.3 с^-1, а максимальні їх значення - відповідно 4.8, 3.8 и 17.6 с^-1. Ці значення у подальшому використовували при кількісному аналізі стохастичної моделі. Нами не було виявлено як статистично достовірної різниці середніх частот ПД першого та другого типу, так і кореляції для пар значень частот ПД першого та другого типу у фоновій активності одного нейрона ВШГ кроля.

Для ПД першого та другого типу усіх досліджуваних нейронів були побудовані гістограми МІІ. У 13 з 20 нейронів розподілення тривалості інтервалів між ПД обох типів достовірно не відрізнялось від нормального. У чотирьох нейронів відмінність досягала рівня достовірності для розподілень інтервалів між ПД одного типу (першого або другого), а у трьох нейронів розподілення МІІ відрізнялись від нормального у ПД обох типів.

Для кількісної перевірки стохастичної гіпотези виникнення ПД другого типу у фоновій активності нейронів ВШГ кроля нами було запропоновано модель, що ілюструється рис. 4. На вхід системи надходять n незалежних потоків, імпульси яких сумуються при їх випадкових збігах. Статистичні характеристики послідовностей вхідних імпульсів відповідають визначеним у наших дослідах характеристикам фонової активності. На виході імпульс з'являється лише за умови збігу принаймні трьох вхідних імпульсів.

Стосовно нейрона симпатичного ганглія це означає прийняття наступних припущень: 1) на нейроні ганглія конвергують одинакові за своєю синаптичною ефективністю незалежні прегангліонарні входи, активація кожного з яких викликає у нейроні підпорогові ЗПСП; 2) статистичні характеристики тривалості МІІ вхідних потоків відповідають таким для ПД першого типу; 3) ПД другого типу у постгангліонарному нейроні виникає при сумації трьох ЗПСП. Припущення базуються на літературних даних, отриманих у дослідах з накопиченням сигналу від постгангліонарного нерва синхронно з ЗПСП фонової активності нейрона ВШГ кроля (Skok, Ivanov, 1992). Ці дані свідчать про те, що підпорогові пресинаптичні входи утворені колатералями волокон, активація яких викликає ПД у інших нейронах ганглія. Третє припущення випливає з даних дослідів, у яких фоновоактивні ПД нейронів ВШГ кроля порівнювались з ПД, що викликали подразненням прегангліонарного нерва (Skok, Ivanov, 1983).

Для даної моделі виконуються умови наступної теореми (Седякин, 1965): якщо у процесі співпадіння беруть участь n стаціонарних та незалежних потоків, імпульси кожного з яких не перекриваються у часі, то середня частота f_n,k() збігів k з n імпульсів, обчислена за умови, що тривалість перекривання імпульсів становить не менше , визначається співвідношенням:

Де

_i(t) та _i(t) - щільності розподілення тривалості імпульсів та МІІ для i-го потока, _i - його середня частота, i = 1, 2, ..., n.

Обчислення було проведено для різної кількості входів та різних частот імпульсації вхідних потоків. Розглядався випадок, коли статистичні характеристики послідовностей вхідних імпульсів були однаковими для усіх входів, оскільки у цьому випадку частота збігів буде максимальною. З урахуванням тривалості фаз зростання ПД другого типу та ЗПСП тривалість вхідних імпульсів у моделі склала 10 мс. При обчисленнях враховувались збіги з тривалістю перекривання більше нуля.

На рис. 5 наведено графіки розрахованої залежності середніх частот неефективних подій (А) та потрійних збігів (Б) від частоти імпульсації вхідних потоків у діапазоні від 1 до 5 с^-1 для восьми, десяти та дванадцати входів. Аналіз графіків показує, що для даного діапазону вхідних частот та кількості входів максимальна частота підпорогових ЗПСП, зареєстрована у наших дослідах (17.6 с^-1), досягалась значно швидше аніж середня частота ПД другого типу (1.9 с^-1).

Таким чином, кількісний аналіз процесу генерації ПД в результаті випадкового збігу імпульсів, що надходять по незалежним прегангліонарним входам, дозволяє зробити висновок про неспроможність стохастичної гіпотези пояснити походження ПД другого типу у фоновій активності нейронів ВШГ кроля. З цього випливає правомірність припущення про наявність у ЦНС синхронізуючого механізму для активації прегангліонарних нейронів, що утворюють множинні входи на нейронах симпатичних гангліїв.

Раніше було запропоновано кілька гіпотез щодо функціонального значення множинного входу, які ґрунтувались на морфологічних, електрофізіологічних та нейрохімічних даних (Purves, Lichtman, 1985; Скок, Іванов, 1989; Janig, 1995; Karila, Horn, 2000). Проте, незалежно від цих гіпотез, множинний принцип іннервації має важливу особливість. Очевидно, що найефективніша синхронізація розрядів прегангліонарних нейронів буде відбуватись у разі їх активації спільним аксоном. Такий, на перший погляд парадоксальний, характер іннервації, при якому один центральний нейрон іннервує кілька прегангліонарних, які, в свою чергу, іннервують нейрон ганглія з утворенням "слабких" входів, може бути відповідальним за точність передачі імпульсації до органів-мішеней. Для ілюстрації цієї особливості розглянемо гіпотетичну схему, представлену на рис. 6.

Один з нейронів симпатичного ганглія (нейрон 7 на схемі) отримує лише поодинокий (нейрони 2-5-7), а другий (нейрон 6) - лише множинний вхід (нейрони 1-3,4,5-6). Така організація входів буде забезпечувати передачу нейроном 7 імпульсації, що надходить до прегангліонарного нейрона 5 по обом входам від нейронів 1 та 2. На нейроні 6 відбуватиметься “фільтрація“ імпульсів, що надходять на прегангліонарні нейрони 3-5. Нейрон ганглія 6, що отримує множинний вхід, буде передавати до органів-мішеней імпульсацію, що надходить на прегангліонарні нейрони лише від нейрона 1 (імпульсація від нейрона 2 буде викликати у ньому лише підпорогові ЗПСП).

При такій організації входів один прегангліонарний нейрон може брати участь у формуванні в нейронах ганглія активності з різними характеристиками та, в принципі, з різною рефлекторною реакцією на однакові стимули. Це може мати значення при формуванні нервових зв'язків за умов відносної "нестачі" прегангліонарних нейронів (див., наприклад, Purves, Lichtman, 1985; Janig, 1995) у нейронних одиницях різних розмірів (у різних тварин та, можливо, функціонально різних шляхів одного вегетативного ганглія). Не виключено, що у синхронізації розрядів прегангліонарних нейронів можуть брати участь нещодавно знайдені на зрізах спинного мозку щурів електричні контакти між частиною прегангліонарних нейронів (Nolan et al., 1999).

Одним з механізмів синхронізації розрядів прегангліонарних входів може бути їх зв'язок з різними фізіологічними ритмами, найвираженішим з яких є серцевий ритм. Якщо внесок такого ритму у генерацію ПД другого типу є суттєвим, то слід було чекати вищого ступеня синхронізації з пульсом для ПД другого типу у порівнянні з ПД першого типу. Для аналізу синхронізації розрядів поодинокого та множинного прегангліонарних входів нами було відібрано записи активності 9 нейронів ВШГ кроля, в яких виникали ПД двох типів. Одночасно реєстрували ЕКГ тварин. Фрагменти записів активності такого нейрона та ЕКГ представлені на рис. 7.

За записами активності нейрона та ЕКГ для ПД обох типів формували послідовності пост-R інтервалів та будували відповідні гістограми (пост-R гістограми). Чисельно ступінь пульсової модуляції активності характеризують коефіцієнтом синхронізації, який зазвичай розраховують за наступною формулою (Habler et al., 1998): К_сх = (Fmax - Fmin)*(m/n), де Fmax та Fmin - відповідно максимальна та мінімальна кількість подій у біні даної гістограми, m - кількість бінів, n - об'єм вибірки. Пост-R гістограми, побудовані окремо для ПД двох типів різних нейронів ВШГ кроля представлені на рис. 8.

Синхронізацію або її відсутність спостерігали як для ПД першого, так і другого типу, також синхронно або несинхронно з R-зубцем ЕКГ могли виникати ПД з високою та низькою середньою частотою імпульсації (рис. 9). Для кожної пост-R гістограми було обчислено коефіцієнти синхронізації, середні значення яких для ПД першого, другого типу та сумарної активності склали відповідно 1.6 ± 0.2; 1.7 ± 0.3 та 1.5 ± 0.2. Значення коефіцієнта для пост-R гістограм ПД першого та другого типів фонової активності одного нейрона могли дещо відрізнятись, але для пар їх значень спостерігалась позитивна кореляція (коефіцієнт кореляції 0.85). Значення коефіцієнтів синхронізації для активності різних нейронів ВШГ кроля наведено на рис. 9.

З літературних даних відомо (Скок, Іванов, 1989; Janig, 1995), що пульсова модуляція вазоконстрикторів скелетних м'язів виражена сильніше ніж у вазоконстрикторів шкіри. Таким чином, фонова активність прегангліонарних нейронів, що утворюють поодинокий та множинний прегангліонарні входи має подібний характер модуляції їх активності з пульсовим ритмом, з чого випливає, що відповідні нейрони можуть бути віднесені до функціонально однорідних шляхів передачі імпульсації з ЦНС до органів-мішеней. Раніше при аналізі фонової активності пульсову модуляцію розглядали за принципом "так-ні", вважаючи її відсутньою або сильною при значенні коефіцієнта нижче чи вище певного значення (Habler et al., 1998). Проведений нами у даній роботі аналіз значень коефіцієнта синхронізації з пульсовим ритмом фоновоактивних ПД першого та другого типу у нейронах ВШГ кроля не лише підтвердив запропоновану раніше концепцію впорядкованої конвергенції прегангліонарних входів на нейроні симпатичного ганглія (Скок, Іванов, 1989), але і надав кількісну характеристику такої впорядкованості.Практично недослідженою особливістю нейронної організації симпатичних гангліїв є розподіл імпульсації по різній кількості нейронів ганглія. Синхронні розряди фоновоактивних нейронів ВШГ кроля було нами проаналізовано за допомогою метода когерентного відведення синхронно з внутрішньоклітинними ПД першого та другого типу. Фрагменти записів фонової активності нейрона ВШГ кроля та зовнішнього сонного нерва представлені на рис. 10, А.

В результаті 100 несинхронних накопичень виділявся сигнал, потужність якого була приблизно на порядок меншою потужності сигналу активності постгангліонарного нерва (рис. 10, Б). Після 100 накопичень фрагментів (40 мс) записів активності зовнішнього сонного нерва синхронно з фоновоактивним ПД нейрона ВШГ у більшості випадків виділялись сигнали, які мали вигляд двохфазного або однофазного ПД тривалістю до 20 мс. На рис. 10, В представлені сигнали, отримані в результаті накопичення синхронно з ПД першого та другого типу одного нейрона ВШГ кроля. Площа цих сигналів відображує кількість нейронів ганглія, що активуються синхронно з даними ПД (Ninomia et al., 1992; Скок, Іванов, 1989). У різних дослідах умови відведення від цілого постгангліонарного нерва могли змінюватись, що впливає на оцінку абсолютної кількості синхронно активованих нейронів. Тому ми вимірювали площу сигналів, нормовану на потужність активності цілого нерва. Так ми визначали відносний внесок у активність цілого нерва нейронів, що активуються синхронно з розрядами прегангліонарних входів, що конвергують на одному нейроні ВШГ.

Для досліджених нейронів сигнали, накопичені синхронно з ПД першого та другого типу, могли дещо відрізнятись за формою, але для пар значень їх площ спостерігалась позитивна кореляція (значення коефіцієнта кореляції склало 0.8). Оскільки величина розрядів цілого нерва визначається кількістю синхронно активованих його волокон, то можна стверджувати, що при фоновій активності збільшення кількості нейронів, активованих синхронно з поодиноким входом супроводжується збільшенням кількості нейронів, активованих синхронно з множинним входом, що конвергує на тому ж нейроні ганглія.

Таким чином, отримані нами дані вказують, що впорядкована конвергенція прегангліонарних волокон на нейронах ВШГ проявляється і на рівні кількості нейронів ганглія, які вони активують в умовах фонової активності.

Фонова активність ідентифікованих нейронів ВШГ щура. Для дослідження фонової активності нейронів ВШГ, що іннервують підщелепну залозу щура, нами було розроблено методику їх антидромної ідентифікації у гострих дослідах in situ. В попередніх дослідах безпосередньо біля залози було ідентифіковано постгангліонарний симпатичний нерв, при відведенні від якого реєстрували ПД у віповідь на подразнення шийного симпатичного нерва. У дослідах з внутрішньоклітинним відведенням від нейронів ВШГ цей нерв препарували, перерізували та затягували у піпетку з подразнюючим електродом. У відповідь на подразнення цього нерва у частині нейронів ВШГ реєстрували антидромні ПД, латентний період яких перебував у діапазоні від 10 до 20 мс. Довжина постгангліонарного нерва від місця подразнення до ВШГ становить приблизно 1 см, а відповідний діапазон швидкостей проведення - від 0.5 до 1.0 м/с. За літературними даними швидкість проведення збудження по постгангліонарним волокнам щура становить близько 0.7 м/с (Habler et al., 1994; Bartsh et al., 1996).

Внутрішньоклітинне відведення було проведено від 46 ідентифікованих нейронів ВШГ, що відповідали на антидромне подразнення постгангліонарного нерва поблизу підщелепної залози. У 25 з 46 нейронів (54%) фонова активність була відсутньою протягом усього часу спостереження (від однієї-двох до десяти та більше хвилин). У відповідь на пряме подразнення такі нейрони генерували нормальні ПД. Фонова активність 11 з 46 ідентифікованих нейронів (24%) складалась лише з підпорогових ЗПСП. Більшість досліджених нейронів (9 з 10 протестованих) були фазними - прикладення деполяризуючого імпульса (500 мс) викликало появу ПД тільки на його початку. Лише один нейрон був тонічним - ПД виникали протягом усього деполяризуючого імпульса.

Фоновоактивні ПД ми спостерігали при відведенні від 10 з 46 (22%) ідентифікованих нейронів. Фрагменти записів фонової активності двох різних ідентифікованих нейронів ВШГ, що іннервують підщелепну залозу, представлено на рис.11. ПД в активності більшості даних нейронів мали крутий фронт зростання, їх форма відповідала формі ПД першого типу у фоновій активності нейронів ВШГ кроля. Лише в одному нейроні нами були зареєстровані фоновоактивні ПД другого типу. Частота виникнення ПД у даних нейронах була від 0.15 до 1.43 с^-1, середнє значення склало 0.64 ± 0.17 с^-1. Частота підпорогових ЗПСП варіювала від 0.13 до 3.3 с^-1, середнє значення склало 1.18 ± 0.44 с^-1. Для ПД даних нейронів нами були побудовані пост-R гістограми, аналіз яких показав наявність слабкої модуляції їх активності пульсовим ритмом. Середнє значення коефіцієнта синхронізації склало 1.2 ± 0.2. Такий ступінь модуляції фонової активності пульсовим ритмом характерний для вазоконстрикторів шкіри.

Ми звернули увагу на особливість фонової активності даних нейронів - частота фоновоактивних підпорогових ЗПСП могла суттєво відрізнятись у різних нейронах (рис. 11, А та Б). Це надало нам можливість розділити дані нейрони на дві групи.

В першій групі, яку склали 4 нейрони, спостерігали рідкі підпорогові ЗПСП, амплітуда яких складала кілька мВ. Фрагмент запису фонової активності такого нейрона представлений на рис. 11, А. Середня частота виникнення ПД в нейронах даної групи складала від 0.15 до 0.58 с^-1. Гістограма МІІ для імпульсної активності таких нейронів мала вигляд як на рис. 12, А.

Нейрони другої групи (шість клітин) відрізнялись суттєво вищою частотою підпорогових ЗПСП (рис. 11, Б). Середня частота виникнення ПД в активності нейронів даної групи була від 0.34 до 1.3 с^-1, а розподілення МІІ мало вигляд як на рис. 12, Б. В цих нейронах можна було спостерігати 3-4 градації амплітуди підпорогових ЗПСП, які, вірогідно, виникають при активації різних прегангліонарних волокон, що конвергують на даному нейроні.

В даній роботі нами вперше було проведено внутрішньоклітинне мікроелектродне відведення фонової активності нейронів симпатичного ганглія, ідентифікованих антидромним подразненням постгангліонарного нерва поблизу органа-мішені (підщелепної залози щура). Дослідження даної популяції нейронів викликає інтерес не лише через їх функції, а і як модель для дослідження функціональної специфічності симпатичних нейронів. На даних нейронах виконано велику кількість морфологічних (Voyvodic, 1989; Luebke, Write, 1992) та нейрогістохімічних досліджень (Gibbins, 1992). Проте електрофізіологічних робіт по відведенню фонової активності даних нейронів усього дві (Іванов, 1989; Bartsh et al., 1998).

Розроблена нами методика ідентифікації нейронів має певні переваги перед тими, що використовувались раніше. При відведенні від окремих волокон постгангліонарного нерва (Bartsh et al., 1998) втрачається інформація про фоновоактивні входи, що конвергують на даних нейронах. Так, наприклад середнє значення частоти ПД, отримані у наших дослідах (0.64 с^-1), практично співпало зі значенням, отриманим Бартчем та співавторами (0.67 с^-1). Але при використаній нами методиці внутрішньоклітинного відведення можна було виділити дві групи нейронів, які відрізняються за кількістю підпорогових фоновоактивних входів та, вірогідно, виконують у залозі різні функції. Цей результат, очевидно, було б неможливо отримати при відведенні від постгангліонарного нерва. У порівнянні з методикою, у якій для ідентифікації даних нейронів було використано флуоресцентний барвник (Іванов, 1989), запропонована нами методика не потребує попередньої підготовки піддослідної тварини та використання флуоресцентного мікроскопа.

Отримані у наших дослідах характеристики фонової активності ідентифікованих нейронів ВШГ щура суттєво відрізняються від отриманих у дослідах Іванова, в яких фонова активність ідентифікованих флуоресцентним барвником нейронів складалась лише з низькочастотних ПД та ЗПСП (тобто відповідала першій групі у нашій роботі). Нейрони, що склали другу групу, були "загублені" в дослідах Іванова, але були зареєстровані у дослідах Бартча та співавторів. Найвірогіднішим, на наш погляд, поясненням даної невідповідності є функціональна різниця між вищезгаданими групами нейронів. З літературних даних відомо (Lung, 2003), що симпатичні нейрони іннервують міоепітеліальні клітини слинного протоку залози. Вважається вірогідним, що при використаному Івановим методі введення барвника (розміщення його кристалів між долями залози) він не буде проникати у проток. Ці літературні дані свідчать про те, що дві групи нейронів, які відрізняються частотою підпорогових ЗПСП, виконують у залозі різні функції.

Функціональна роль фоновоактивних підпорогових ЗПСП у вегетативних гангліях залишається нез'ясованою. Чи є вони лише побочним ефектом значної конвергенціїї у вегетативних шляхах, чи мають певну функцію? З літературних даних відомо, що прегангліонарна іннервація, крім генерації ПД у постгангліонарних нейронах, впливає на регуляцію їх метаболізму та функцій: активності тірозин-гідроксилази (Rittenhouse, Zigmond, 1990), ліпідного метаболізму (Скок, 1970), формування синаптичних контактів (Purves, Lichtman, 1985) та їх відновлення після денервації (Maehlen, Nja, 1982). Вірогідно, що підпорогові ЗПСП за умов фонової активності також можуть виконувати аналогічні функції. Також відомо (Trouslard et al., 1993), що канал нікотинового ацетилхолінового рецептора має достатньо високу проникність для іонів кальцію. Можна припустити, що фоновоактивні ЗПСП, частота яких за нашими даними може у кілька разів перевищувати частоту ПД, можуть брати участь у регуляції внутрішньоклітинної концентрації кальція.

Таким чином, нами було розроблено відповідну методику та вперше проведено внутрішньоклітинне відведення від антидромно ідентифікованих нейронів симпатичного ганглія, що іннервують конкретний орган-мішень (підщелепну залозу щура). Нами було виділено дві групи нейронів, що відрізнялись частотою виникнення підпорогових фоновоактивних ЗПСП і, відповідно, кількістю підпорогових прегангліонарних синаптичних входів, що на них конвергують. Порівняння отриманих нами даних з літературними дозволяє припустити, що дані групи нейронів виконують у залозі різні функції. Цей факт свідчить про те, що конвергенція прегангліонарних входів на нейронах гангліїв є одним з факторів, що забезпечує функціональну специфічність вегетативних шляхів.

ВИСНОВКИ

1. Методами внутрішньоклітинного мікроелектродного відведення, відведення від цілого нерва та когерентного усереднення нейрограм постгангліонарного нерва досліджені статистичні характеристики та нейронна організація поодинокого та множинного фоновоактивних прегангліонарних входів, що конвергують на нейроні симпатичного ганглія, а також чутливість синаптичної передачі до дії ряду гангліоблокаторів.

2. Показано, що множинний вхід може функціонувати лише за умови синхронізації розрядів прегангліонарних волокон, що його утворюють. Отримано дані, що підтверджують гіпотезу про те, що прегангліонарні нейрони, що формують поодинокий та множинний входи, не належать до різних популяцій нейронів.

3. Запропоновано функціональну модель організації прегангліонарних входів, згідно якої множинний вхід може виконувати роль "фільтра низьких частот" при передачі ганглієм імпульсації від ЦНС до органів-мішеней.

4. Вперше визначено характеристики фонової активності нейронів симпатичного ганглія, ідентифікованих антидромним подразненням постгангліонарного нерва поблизу органа-мішені. Показано, що функціонально різні нейрони можуть відрізнятись за кількістю фоновоактивних входів, що на них конвергують.

5. Встановлено, що селективність гангліоблокуючої дії парасимпатолітика N-децилтропін броміду (ІЕМ-1556) пов'язана з наявністю у його структурі децильного аліфатичного радикала.

6. Показано наявність кореляції між характеристиками фонової активності поодинокого та множинного входів, що конвергують на одному нейроні ганглія, що свідчить про упорядковану конвергенцію у симпатичних шляхах.

ПЕРЕЛІК ОПУБЛІКОВАНИХ РОБІТ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. И.Н.Ремизов, В.Ю.Маслов, Е.Э.Пурнынь, В.Е.Гмиро, В.И.Скок. Селективное фармакологическое блокирование синаптической передачи в пара-симпатических путях сердца у крысы // Нейрофизиология/Neurophysiology.- 1995.- 27, № 5-6.- С. 323-330.

2. V.Skok, A.Ivanov, L.Tatarchenko, V.Maslov. Ganglionic neuronal mechanisms involved in circulatory control system // Acta Neurobiol. Exp.- 1996.- 56, №1.- P. 107-115.

3. В.Ю.Маслов, А.Я.Иванов, В.И.Скок. Фоновая активность нейронов верхнего шейного ганглия кролика: правомерность стохастической гипотезы ее формирования // Нейрофизиология/Neurophysiology.- 1996.- 28, №1.- С. 47-52.

4. В.Ю.Маслов. Фоновая активность нейронов верхнего шейного ганглия, иннервирующих подчелюстную железу крысы // Нейрофизиология/Neurophysiology.- 2005.- 37, №1.- С. 26-31.

5. И.Н.Ремизов, Е.Э.Пурнынь, С.А.Кошелева, В.Ю.Маслов, В.И.Скок. Селек-тивное фармакологическое блокирование сердечных парасимпатических путей // Тезисы XIV съезда Украинского физиологического общества им. И.П.Павлова.- Киев, 1994.- С. 117-118.

6. В.Ю.Маслов. Стохастична модель генерації потенціалів дії у фоновій активності нейронів вегетативного ганглія // Матеріали VII Міжнародної наукової конференції ім. академіка М.Кравчука.- Kиїв, 1998.- С. 318-320.

7. В.Ю.Маслов. Фоновая активность нейронов верхнего шейного ганглия с одиночным и множественным преганглионарными входами // Материалы школы для молодых ученых "Мембраны и сигналы".- Киев, 2000 // Нейрофизиология/Neurophysiology.- 2000.- 32, №1, С. 208-209.

8. V.Y. Maslov. Neuronal organization of single and multiple preganglionic inputs converging on the same sympathetic ganglion neuron // Abstracts of Forth Conference of the Czech Neuroscience Society.- Prague, 2001.- p. 84.

9. В.Ю.Маслов. Синхронізація активності прегангліонарних входів, що конвергують на одному нейроні верхнього шийного ганглія, з пульсом // Матеріали XVI з'їзду Українського фізіологічного товариства.- Вінниця, 2002 // Фізіологічний журнал.- 2002.- 48, №2.- С. 73-74.

10. В.Ю.Маслов, В.І.Скок. Внутриклеточное отведение от идентифици-рованных нейронов симпатического ганглия in situ // Материалы III конференции Украинского общества нейронаук.- Донецк, 2005 // Нейронауки: теоретические и клинические аспекты.- 2005.- 1, № 1.- с. 37.

АНОТАЦІЯ

Маслов В.Ю. Конвергенція фоновоактивних прегангліонарних входів на нейроні симпатичного ганглія.- Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.02 - біофізика.- Інститут фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України, Київ, 2005.

Досліджено нейронну організацію, фонову активність та чутливість синаптичної передачі до ряду блокаторів нейронів верхнього шийного ганглія (ВШГ). Встановлено, що селективність гангліоблокуючої дії парасимпатолітика N-децилтропін броміду визначається наявністю у його молекулі децильного аліфатичного радикала. Проведено кількісний аналіз стохастичної гіпотези формування активності нейронів симпатичних гангліїв. Показано, що множинний прегангліонарний вхід може бути ефективним за умови синхронізації розрядів волокон, що його утворюють. Визначено характеристики активності антидромно ідентифікованих нейронів ВШГ щура, що іннервують підщелепну залозу. Показано, що функціонально різні нейрони можуть відрізнятись за кількістю фоновоактивних входів, що на них конвергують.

Ключові слова: верхній шийний ганглій, фонова активність, поодинокий та множинний входи, стохастична гіпотеза, антидромна ідентифікація.