Розшифровка і віднесення сигналів протонів у спектрах ЯМР водних розчинів досліджуваних ароматичних молекул і фрагментів ДНК.

Вивчення закономірностей і особливостей процесів самоасоціації олігомерів ДНК різної довжини, складу і послідовності основ у ланцюзі.

Розробка методик визначення структурних і термодинамічних параметрів комплексоутворення ароматичних лігандів з олігомерами ДНК різної структурної організації.

Об'єкт дослідження - дезоксиолігонуклеотиди: дезокситетрануклеотиди 5-d(TpGpCpА) і 5-d(GpApApG), дезоксигексануклеотиди 5-d(GpCpApTpGpС) і 5-d(CpGpTpApCpG), дезоксигептануклеотид 5-d(GpCpGpApApGpC); ароматичні біологічно активні сполуки: синтетичне феноксазонове з'єднання, аналог антипухлинного антибіотика актиноміцину D, - актиноцил-біс - (2-диметиламіноетил) амід (ActII), фенантридиновий барвник бромистий етидій (ЕВ) і антрацикліновий антипухлинний антибіотик дауноміцин (DAU).

Предмет дослідження - молекулярні механізми самоасоціації ароматичних біологічно активних молекул і олігомерів ДНК, комплексоутворення БАС із фрагментами ДНК різної вторинної структури у водно-сольовому розчині.

Методи дослідження - одномірна і двомірна (2М-TOCSY/2M-COSY, 2М-NOESY/2М-ROESY) гомоядерна 1H і гетероядерна 1H-31P (НМВС) ЯМР спектроскопія (500 МГц) - для одержання структурних і термодинамічних параметрів комплексоутворення молекул, побудови структур комплексів молекул, аналізу динамічної рівноваги молекулярних асоціатів і зв'язування ароматичних БАС із фрагментами ДНК у розчині; спектрофотометрія - для визначення концентрації молекулярних компонентів у водному розчині.

Наукова новизна отриманих результатів. Вперше досліджена специфіка комплексоутворення синтетичного феноксазонового з'єднання актиноцил-біс - (2-диметиламіноетил) аміду (ActII) з дезокситетрануклеотидом 5' - d(TрGрCрА) у водно-сольовому розчині. Побудовані найбільш імовірні структури комплексів ActII з дуплексом тетрануклеотид на основі даних двомірної (2M NOESY) ЯМР спектроскопії. Методом 1Н ЯМР спектроскопії досліджена самоасоціація гексамера d(GCATGC) у водно-сольовому розчині. Виявлена компактна складчата (типу шпильки) структура одноланцюгової послідовності самокомплементарного олігонуклеотиду d(GCATGC) у водному розчині. Зроблено висновок, що наявність термінальних d(GC) - сайтів у сполученні з центральними d(AT) - сайтами в самокомплементарних дезоксиолігонуклеотидних послідовностях створює умови для формування неканонічних компактних структур (подібних до шпильки) навіть у досить коротких одноланцюгових фрагментах ДНК. Вперше досліджено комплексоутворення антрациклінового антипухлинного антибіотика дауноміцину з дезоксигексануклеотидом d(GCATGC). На основі даних одномірної і двомірної ЯМР спектроскопії визначені структурні і термодинамічні параметри різних типів комплексів, побудована найбільш імовірна структура комплексу DAU з дуплексом гексамеру ДНК. Показано, що хромофор дауноміцину вбудовується з боку малої борозенки в термінальний сайт d(GрС) гексамера, і триплетні ділянки переважного зв'язування ліганду можна розташувати в наступному порядку: 5-d(GCA)>5-d(CGT)>5-d(CGC)>5-d(TAC). Показано, що положення резонансів протонів в олігомері ДНК дозволяє зробити цілком визначені висновки про особливості конформаціїних станів молекул ДНК, виявити структури, маючі відхилення від стандартної геометрії подвійної спіралі. Вперше показано, що одноланцюгові несамокомплементарні олігонуклеотиди одинакового нуклеотидного складу з петлею шпильки, можуть бути використані як модельні системи для дослідження комплексоутворення ароматичних лігандів зі шпильковими структурами у водному розчині.

Практичне значення отриманих результатів. Отримані в роботі експериментальні і теоретичні результати поглиблюють існуючі уявлення про взаємодію біологічно активних низькомолекулярних речовин із фрагментами молекул нуклеінових кислот різної просторової організації. Запропоновані в дисертаційній роботі методи дозволяють визначити типи та особливості вторинної структури олігонуклеотидів за положеннями резонансів протонів, а також проводити аналіз структур комплексів БАС з різними олігонуклеотидними послідовностями на основі даних одномірної і двомірної 1Н-ЯМР спектроскопії.

Отримані дані про специфіку комплексоутворення антипухлинних антибіотиків із фрагментами ДНК різної структурної організації можуть бути використані при синтезі нових біологічно активних речовин і лікарських препаратів із заданими медико-біологічними властивостями.

Особистий внесок здобувача: у наукових працях, опублікованих зі співавторами, особистий внесок здобувача полягає в наступному: у роботах [2,3,5,6,8,10-13,16,17] - участь у розробці моделей самоасоціації олігонуклеотидів і їх комплексоутворення з ароматичними біологічно активними сполуками, проведення розрахунків по запропонованим моделям, визначення структурних і термодинамічних параметрів комплексоутворення молекул; у роботах [1,3-7,9,10,11,13,15,17] - участь у розшифровці і віднесенні сигналів необмінюючихся протонів у двомірних спектрах 2M-NOESY/2M-ROESY і 2M-TOCSY/2M-COSY розчинів молекул, визначення найбільш імовірних структур комплексів по знайденим міжмолекулярним контактам; у роботах [2,5,6,7,9,11,14,15] - аналіз літературних даних, проведення розрахунків, аналіз і обговорення отриманих результатів, написання наукових статей.

Апробація отриманих результатів. Основні результати досліджень, що ввійшли в дисертацію, були представлені та обговорені на: III-му з'їзді Українського біофізичного товариства, Львів, Україна, 2002; 16-й Міжнародній школі-семінарі «Спектроскопія молекул і кристалів», Севастополь, Україна, 2003; 3-й і 4-й міжнародних конференціях молодих учених «Проблеми практичної фізики», Київ, Україна, 2003 і 2004 р., відповідно; Міжнародних наукових конференціях студентів, аспірантів і молодих учених «Ломоносов-2003» і «Ломоносов-2004», Чорноморська філія МДУ, Севастополь, Україна, 2003 і 2004 р. відповідно; 16ій Міжнародній конференції по ЯМР спектроскопії, Кембридж, Великобританія, 2003; I українській науковій конференції «Проблеми біологічної і медичної фізики», Харків, Україна, 2004 р., об'єднаній 17-ійа Європейській конференціі по експериментальній ЯМР-спектроскопії (EENC) та 32-ій Амперівській конференції (AMPERE), Лілль, Франція, 2004 р. Тези перерахованих доповідей опубліковані.

Публікації. За результатами досліджень, що ввійшли в дисертацію, опубліковано 17 наукових праць, у тому числі 7 статей у наукових журналах і 10 тез доповідей на міжнародних та національних наукових конференціях.

Структура дисертації. Робота складається із вступу, шести розділів, висновків і додатка. Повний обсяг дисертації складає 188 стор., з них додаток займає 18 стор., список використаних джерел - 208 найменувань - 19 стор. Дисертація містить 49 рис. і 20 табл., у тому числі на 15 окремих сторінках.

Основний зміст роботи

олігомери самоасоціація термодинамічний ланцюг

У вступі обґрунтована актуальність теми, визначена мета і задачі дослідження, показані новизна, а також наукова і практична значимість отриманих результатів.

У першому розділі проведено аналіз літературних даних за темою дисертації. Обґрунтовано важливість дослідження комплексоутворення ароматичних біологічно активних речовин із фрагментами ДНК різної структурної організації. Проведено огляд основних параметрів вторинної структури ДНК із використанням прийнятої зараз номенклатури. Розглянуто неканонічні форми вторинної структури ДНК і особливості їхньої взаємодії з ароматичними речовинами, включаючи фенантридиновий барвник бромистий етидій, феноксазоновий антибіотик актиноміцин D і його похідні, антрацикліновий антибіотик дауноміцин. Ці біологічно активні речовини зв'язуються в ДНК шляхом інтеркаляції.

У другому розділі розглянуто фізичні основи одномірної і двомірної ЯМР-спектроскопії. Коротко описано основні експериментальні параметри ЯМР-експерименту. Розглянуто методики двомірної гомоядерної спектроскопії, які виявляють взаємодії між ядрами через хімічні зв'язки (2М-COSY/2М-TOCSY) і через простір (2М-NOESY/2М-ROESY). Описано засоби готування розчинів експериментальних зразків і умови проведення експериментів.

Зразки спокул розчиняли в D2O з ізотопною чистотою 99.95% і ліофілізували. Розчини готували шляхом додавання зваженої кількості ліганду в дейтерированій 0.1 M фосфатний буфер (pD 7.1). Концентрацію молекул DAU, ЕВ і похідних AMD визначали спектрофотометрично за відомими молярними коефіцієнтами екстинкції для дауноміцину =11500 М-1см-1 (л=477 нм), для Act II-Act IV =36700 М-1см-1 (л=450 нм) і =5860 М-1см-1 (л=480 нм) для бромистого етидію. Концентрації, визначені спектрофотометрично, знаходилися у відповідності з концентраціями, знайденими за масовим розведенням. Зразки дезоксинуклеозидфосфатів (5'd(TGCA), 5' - d(CGTACG), 5' - d(GCATGC), 5' - d(GCGAAGC), 5' - d(GAAG)) синтезовані компанією «Oswel DNA Service» (Великобританія). Їх також ліофілізовули з D2O і розчиняли у дейтерированому 0.1 M фосфатному буфері.

Одномірні і двомірні 1H ЯМР спектри вимірювали на спектрометрах з резонансною частотою 500 МГц («JEOL GSX 500», «Bruker DRX 500»), і 600 МГц («Bruker AMX 600»). Температурні залежності хімічних зсувів протонів визначалися при постійному складі розчину. Концентраційні виміри протонних хімічних зсувів проводили при двох температурах при фіксованій концентрації однієї з сполук. У процесі вимірів температура зразка стабілізувалася з похибкою 1 К за допомогою терморегулятора BVT-3000 чи «JEOL NM GVT 3». Протонні хімічні зсуви вимірялися відносно внутрішнього стандарту - ТМА (бромід тетраметиламонію), тому що його сигнал практично не залежить від рН і температури у водних розчинах нуклеотидів, а потім перераховувалися відносно DSS.

У третьому розділі при ототожненні сигналів протонів досліджених дезоксиолігонуклеотидів проведений порівняльний аналіз положення резонансів ?_е(Н_i) протонів різних триплетних послідовностей у залежності від їхнього розташування в олігонуклеотидному ланцюзі. Отримані результати свідчать про те, що належність триплету до тієї чи іншої досліджуваної дезоксиолігонуклеотидної послідовності, його місце розташування в ланцюзі, а також довжина дезоксиолігонуклеотиду суттєво впливають на значення протонних хімічних зсувів. На основі подібних досліджень можна зробити цілком однозначні висновки про особливості конформаційних станів молекул ДНК, виявити структури, які мають відхилення від стандартної геометрії подвійної спіралі (зокрема, це стосується одноланцюгових і шпилькових структур ДНК), а також провести аналіз впливу плавлення кінцевих нуклеотидних пар в коротких фрагментах ДНК на геометрію подвійної спіралі.

Розділ 4 присвячений дослідженню специфіки комплексоутворення синтетичного феноксазонового антибіотика ActII (актиноцил-біс - (2-диметиламиноэтил) аміду) із самокомплементарним дезокситетрануклеотидом 5' - d (TpGpCpА) у водному розчині. Для цього, у відповідність із загальною схемою досліджень, спочатку були визначені параметри самоасоціації даного феноксазонового антибіотика на основі концентраційних і температурних залежностей хімічних зсувів протонів ActII з використанням нескінченомірної некооперативної моделі самоасоціації молекул. Для того, щоб визначити імовірність утворення агрегатів антибіотика більш високого порядку, ніж димери, експериментальні результати були проаналізовані за допомогою нескінченомірної кооперативної моделі самоасоціації. Отримано наступні значення термодинамічних параметрів самоасоціації ActII у водно-сольовому розчині: K = (2.81.1)?103 л/моль, = 1.250.01, G0 = - (19.71.0) кДж/моль, H0 = - (29.73.6) кДж/моль, S0 = - (32.49.5) Дж/(мольК).

Віднесення сигналів необмінюючихся протонів дезокситетрануклеотиду 5' - d(TpGpCpA) у водно-сольовому розчині (0.1M NaCl) проводилося на основі даних 2М-TOCSY і 2М-NOESY спектроскопії. Для даної молекулярної системи сигнали NOE між сахарними протонами Н1' і Н2'' дезоксирибози виявилися більш інтенсивними в порівнянні з крос-піками Н1' - Н2', що свідчить про переважну S-конформацію (C2' - ендо) дезоксирибозних залишків у ланцюзі дезокситетрануклеотиду, а, отже, дуплекс тетрамера знаходиться в конформації, близької до В-форми.

В досліджених у даній роботі 2М-NОЕSY спектрах змішаних розчинів, отриманих при різних концентраціях ліганду (1 ммоль/л і 2 ммоль/л) і тетрамеру (2 ммоль/л) у розчині, спостерігається досить велика кількість міжмолекулярних крос-піків (табл. 1), що має місце при різних співвідношеннях концентрацій взаємодіючих молекул і часу змішування в 2М-NОЕ-експерименті.

Аналіз крос-піків NOE дозволяє зробити висновок, що феноксазоновий антибіотик ActII переважно взаємодіє з термінальним d(TG) - сайтом дуплексу дезокситетрануклеотиду. З урахуванням експериментальних міжмолекулярних NOE-контактів були побудовані просторові структури комплексів d(TGCA) - ActII (рис. 1), де представлені дві можливі, взаємо-протилежні орієнтації хромофора антибіотика (а) і (б).

Таблиця 1. NOE-контакти між необмінюючимися протонами дезокситетрануклеотиду 5 - d(TpGpCpА) і актиноцил-біс - (2-диметиламіноетил) аміду (ActII)

На рис. 2а наведені концентраційні залежності хімічних зсувів деяких необмінюючихся протонів (СН₃(Т4) і Н6 (С2)) дезоксигексануклеотиду d(G1C2A3T4G5C6), отримані при температурах 298 К та 308 К. Там же для порівняння наведені криві титрування для аналогічних протонів основ в ізомернім дезоксигексануклеотиді d(C1G2T3A4C5G6) при температурах 303 і 313 K. Звертає на себе увагу дуже незначні зміни хімічних зсувів протонів d(GCATGC) у дослідженому діапазоні концентрацій (0,02 - 3,1 ммоль/л) у порівнянні з кривими титрування для гексамеру d(CGTACG) в аналогічних умовах розчинника. При цьому спостерігається якісно різний хід кривіх титрування ізомерних послідовностей в межах малих концентрацій при зміні температури: зокрема, при підвищенні температури розчину для протонів CH₃(T4) гексамеру d(GCATGC) має місце більш виражена залежність хімічного зсуву від концентрації (N₀), а для аналогічних протонів CH₃(T3) ізомерного дезоксигексануклеотиду d(CGTACG) спостерігається зворотня картина - цей ефект виявляється при зниженні температури (рис. 2а). Аналогічна картина має місце і для інших необмінюючихся протонів ізомерних дезоксигексануклеотидів. У той же час температурні залежності протонних хімічних зсувів дезоксигексануклеотиду d(GCATGC), як видно з рис. 2б, мають виражену S-образну форму, характерну для плавлення дуплекса, і добре корелюють з аналогічними залежностями хімічних зсувів протонів гексамера d(CGTACG). Можна припустити, що причиною розходження в ході концентраційних залежностей гексамерів при низьких температурах є формування одноланцюговим дезоксигексануклеотидом d(GCATGC) у розчині компактної складчатої структури (шпилькоподібної), магнітне екранування протонів у якій близько до магнітного екранування в дуплексі гексамеру. Таке припущення можна вважати виправданим у зв'язку з підвищеною конформаційною гнучкістю гексамера на ділянці d(ApТ).

Для визначення рівноважної константи і термодинамічних параметрів реакції утворення дуплекса гексамеру d(GCATGC) використані температурні залежності протонних хімічних зcувів, отримані при максимальній у даних дослідженнях концентрації (рис. 2б). При цьому для опису експериментальних кривих була використана модель двох станів, у припущенні, що внесок компактної структури мономера дезоксигексануклеотиду відіграє суттєву роль лише в області малих концентрацій і при порівняно низьких температурах. Відповідно до такої моделі результуючий хімічний зсув i-го протона гексамеру при температурі T може бути представлений у виді:

, (1)

де _mi(T), _di і f_m(T), f_d(T) - протонні хімічні зсуви і рівноважні мольні частки гексамеру при температурі T у мономерній і дуплексній формах відповідно.

У виразі (1) враховано, що значення mi(T) монотонно змінюється зі збільшенням температури за рахунок конформаційних перебудов мономера, обумовлених змінами внутрішньомолекулярного стекингу основ. Розрахунок термодинамічних параметрів (ентропії і ентальпії) проводився з використанням співвідношення:

(2)

припускаючи, що величини H і S практично не залежать від температури в дослідженому температурному діапазоні.

Для того, щоб узгоджити результати температурних і концентраційних залежностей протонних хімічних зсувів молекул гексамеру d(GCATGC) (див. рис. 2а, б) в адитивній моделі (1) для аналізу кривих концентраційного титрування (рис. 2а) був додатково врахований внесок від компактної форми мономеру, магнітне екранування протонів у яких може суттєво відрізнятися від екранування в «розгорнутій» одноланцюговій послідовності:

(3)

де _i (N₀) і _сi - результуючий хімічний зсув i-го протона гексамеру і протонний хімічний зсув в компактної одноланцюговій структурі, f_m(N₀), f_d(N₀) і f_c(N₀) - рівноважні мольні частки дезоксигексануклеотиду в мономерній, дуплексній і компактній (шпильковій) формах, відповідно. Розрахункові значення K, H⁰, S⁰ (при стандартних умовах, T=298 К) і величина T_m, розраховані по температурним залежностям хімічних зсувів протонів гексамеру d(GCATGC), представлені в табл. 2.

Таблиця 2. Рівноважні параметри реакції самоасоціації дезоксигексануклеотиду 5-d(GpCpApTpGpС) у 0.1 М Na-фосфатному буфері, pD 7.1 при Т=298 К

У результаті розрахунку за моделею (3) були отримані значення рівноважної константи утворення компактної структури гексамеру при двох температурах: K_с(298)?3.0, K_с(308)?0.8, що знаходяться в гарній згоді з величиною рівноважної константи утворення шпилькової структури дезоксигептануклеотиду d(GCGAAGC) у водному розчині.

Розрахунок просторової структури компактної (шпилькоподібної) форми одноланцюгової послідовності гексамеру d(GCATGC) виконаний методами молекулярної механіки з використанням програми X-PLOR (версія 3.851). Одна з можливих компактних одноланцюгових структур дезоксигексануклеотиду d(GpCpApTpGpС) у розчині у вигляді шпильки, що містить стебло з двох GC пар, наведена на рис. 3.

Дослідження комплексоутворення дезоксигексануклеотиду 5' - d(GpCpApTpGpC) з дауноміцином проводилося на основі даних одномірних і двомірних спектрів змішаних розчинів. Аналіз експериментальних даних дозволив зробити висновок, що DAU переважно інтеркалює у термінальний d(GС) - сайт гексануклеотидного дуплекса d(GpCpApTpGpС)₂.

Для визначення рівноважних констант комплексоутворення DAU з дезоксигексануклеотидом і граничних значень хімічних зсувів у складі комплексів антибіотика з одно- і дволанцюговими формами гексамеру були отримані залежності протонних хімічних зсувів ліганду від концентрації олігонуклеотиду N₀ і температури T змішаного розчину. Розрахунок параметрів комплексоутворення DAU з дезоксигексануклеотидом проводився з використанням наступної моделі молекулярної рівноваги в розчині:

(4)

де D і N - мономери DAU і гексамера, KA і KD - рівноважні константи димеризації антибіотика і гексануклеотиду, K1 K4 - рівноважні константи утворення 1:1 (DN), 1:2 (DN2), 2:1 (D2N) і 2:2 (D2N2) комплексів, відповідно. За умовами експерименту константи димеризації DAU прийнято рівними 234 і 153 (л/моль) при 308 K і 318 K, відповідно. Відповідно до схеми реакцій (4) хімічний зсув спостерігаємих протонів антибіотика DAU може бути наведений у виглязі:

дDAU (дM + 2дAKAD + д1K1N + д2K2KDN 2 + 2д3K3K1ND + 2д4K4K2KDN 2D) (5)

де д_M і д_A - протонні хімічні зсуви антибіотика в мономерній і асоційованій (димерній) формах, д₁ д₄ - граничні значення хімічних зсувів протонів дауноміцину в складі комплексів DN, DN₂, D₂N і D₂N₂, відповідно; D₀ - вхідна концентрація ліганду. Результати розрахунку значень рівноважних констант K_i утворення різних типів комплексів DAU з гексамером d(GCATGC) і значень д_i (i=1,2,3,4) наведені в табл. 3.

Таблиця 3. Розрахункові значення параметрів (i, млн-1 і Ki·103, л/моль) комплексоутворення дауноміцина з дезоксигексануклеотидом d(GCATGC) у 0,1 М фосфатному буфері, pD 7.1, Т=298 K

Розрахунок просторової структури інтеркальованого 1:2 комплексу DAU-d(GCATGC)2 виконаний методами молекулярної механіки на основі повного атомного представлення з використанням програм X-PLOR і силового поля CHARMM 22. При визначенні структур комплексів DAU+d(GCATGC)2 враховувалися також розрахункові значення граничних хімічних зсувів i протонів антибіотика в складі 1:2 комплексу. Найбільш ймовірна просторова структура фрагментів 1:2 комплексу DAU з дуплексом дезоксигексануклеотиду d(GCATGC)2, що відповідає інтеркаляції антибіотика в d(GpС) - сайт гексамеру, наведена на рис. 4. Інтеркальований комплекс DAU+d(GCATGC)2 характеризується наступними конформаційними параметрами подвійної спіралі: DZ=0,64 нм, =29,5, =-4,5, DX=-0,18 нм, DY=-0,05 нм, =0,6, =-6,0, =7,0. Розрахунки показали, що хромофор антибіотика орієнтований під кутом 120 до подовжньої осі нижньої пари основ інтеркальованого комплексу в подвійній спіралі гексамерного дуплекса, що добре узгоджується з даними рентгеноструктурних досліджень подібних систем.

У шостому розділі на основі даних 1Н ЯМР спектроскопії (500/600 МГц) проведений порівняльний аналіз параметрів взаємодії фенантридинового барвника бромистого етидія з дезоксигептануклеотидом d(GpCpGpApApGpC), здатним утворювати в розчині шпилькову структуру, і одноланцюговим дезокситетрануклеотидом d(GpApApG), що входить як складовий елемент у структуру гептамера.

Аналіз структур комплексів бромистого етидію з тетрамером d(GAAG) виконували на підставі розрахованих граничних значень протонних хімічних зсувів. При побудові структури 1:1 комплексу була запропонована наступна методика: використовувалися перетворення координат нуклеотидних пар в подвійній спіралі, для чого в процесі обчислень до одноланцюгового тетрануклеотиду d(GAAG) добудовували другу нитку дуплекса з комплементарних основ d(CTTC). Однак при розрахунку екранування протонів барвника враховували підстави тільки однієї нитки спіралі, а комплементарні основі другої (добудованої) нитки виключали з розгляду. Екранування протонів бромистого етидію сусідніми основами в 1:1 комплексах розраховували при варіації конформаційних параметрів подвійної спіралі. У розрахунках вважали, що GA-сайт є переважним місцем посадки барвника в 1:1 комплексі. На рис. 5 наведена розрахована найбільш ймовірна структура комплексу 1:1 бромистого етидію з некомплементарним тетрануклеотидом 5' - d(GAAG).

Термодинамічні параметри комплексоутворення ЕВ з олігонуклеотидами були розраховані з використанням експериментальних температурних залежностей хімічних зсувів протонів і моделі динамічної рівноваги між різними конформаційними формами олігомерів у розчині. Зокрема, у випадку гептамера розглядали утворення мономерної, шпилькової і димерної форм у водному розчині.

Як видно з таблиці 4, розрахункові значення ентальпії комплексоутворення ЕВ з одноланцюговим тетрануклеотидом d(GAAG) у межах похибки збігаються з Н утворення комплексу барвника з петлею шпильки d(GAAG) дезоксигептануклеотиду d(GpCpGpApApGpC).

Таблиця 4. Термодинамічні параметри G, H (кДж/моль) і S (Дж/(мольK)) комплексоутворення бромистого етидію з дезоксигептануклеотидом 5' - d(GpCpGpApApGpС) і дезокситетрануклеотидом 5' - d(GpApApG) у 0.1 М фосфатному буфері, pD 7.1

Висновки

1. Показано, що положення резонансів протонів в олігомері ДНК дає цілком однозначну інформацію про особливості конформаційних станів молекул ДНК, дозволяє виявити структури, які мають відхилення від стандартної геометрії подвійної спіралі (зокрема, це відноситься до одноланцюгових та шпилькових структур ДНК).

2. Уперше досліджено комплексоутворення синтетичного феноксазонового з'єднання актиноцил-біс - (2-диметиламіноетил) аміду (ActII) із самокомплементарним дезокситетрануклеотидом 5' - d(TрGрCрA) у водно-сольовому розчині методом двомірної ЯМР спектроскопії. Побудовані найбільш імовірні структури комплексів ActII з дуплексом тетрануклеотиду на основі даних 2M NOESY спектрів і визначені фізичні фактори, відповідальні за специфіку зв'язування антибіотика з ДНК.

3. Виявлено компактну складчасту (типу шпильки) структуру одноланцюгової послідовності самокомплементарного олігонуклеотиду d(GCATGC) у водному розчині при дослідженні самоасоціації гексамера методом 1Н ЯМР спектроскопії. Показано, що наявність термінальних d(GC) - сайтів у сполученні з центральними d(AT) - сайтами в самокомплементарних дезоксиолігонуклеотидах створює умови для формування неканонічних компактних структур (подібних до шпильки) у досить коротких одноланцюгових послідовностях ДНК.

4. Показано, що аналіз даних одномірної ЯМР спектроскопії - концентраційних і температурних залежностей протонних хімічних зсувів - молекулярних систем у водно-сольовому розчині за певних умов експерименту (діапазон концентрацій і температур, типи і послідовність основ в олігонуклеотидному ланцюзі, вид вторинної структури ДНК і т. п.) може бути використаний для визначення особливостей просторових структур олігомерів ДНК (шпилькові структури, одноланцюгові послідовності ДНК).

5. Вперше досліджено комплексоутворення антрациклінового антипухлинного антибіотика дауноміцина з дезоксигексануклеотидом d(GCATGC). На основі даних одномірної і двомірної ЯМР спектроскопії визначені структурні і термодинамічні параметри різних типів комплексів, побудована найбільш імовірна структура комплексу DAU з дуплексом гексамера ДНК. Показано, що триплет d(GCA) є сайтом переважної посадки DAU на олігонуклеотидну послідовність ДНК.

6. На основі порівняльного аналізу комплексоутворення фенантридинового барвника бромистого етидію з одноланцюговою послідовністю d(GpApApG) і петлею шпилькової структури d(GpCpGpApApGpC) однакового нуклеотидного складу показано, що одноланцюгові несамокомплементарні олігонуклеотиди однакового нуклеотидного складу з петлею шпильки можуть бути використовани як модельні системи для дослідження взаємодії ароматичних лігандів зі шпильковими структурами у водному розчині.

Список опублікованих праць за темою дисертації

1. A) с синтетическими производными актиномицина D // Доповіді I Українськой науковой конференції «Проблеми біологічної і медичної фізики». - ХаВеселков А.Н., Итон Р.Дж., Лантушенко А.О., Рогова О.В., Эрнандес Сантьяго А., Дэвис Д.Б. 2М 1H-ЯМР анализ комплексообразования феноксазонового антибиотика актиноцил-бис - (2-диметиламиноэтил) амида с дезокситетрануклеотидом 5-d(TpGpCpA) в водном растворе // Биополимеры и клетка. - 2003. - Т.19. - №5. - С. 377-386.

2. Барановский C.Ф., Рогова О.В., Эрнандес Сантьяго А.А., Завьялова О.С., Веселков А.Н. Термодинамика комплексообразования ароматического лиганда с одноцепочечной последовательностью и петлей шпилечной структуры одинакового нуклеотидного состава // Биополимеры и клетка. - 2004. - Т.20. - №3. - С. 215-223.

3. Pahomov V.I., Rogova O.V., Volynkin V.S., Veselkov K.A., Hernandez Santiago A.A., Semanin A.V., Djimant L.N., Veselkov A.N. Distinctive features of complexation of anthracycline antibiotic daunomycin with deoxyhexanucleotide d(GCATGC) in aqueous solution: 1D - and 2D-NMR analysis // SPIE Proceedings. - 2004. - V.5507. - P. 333 - 341.

4. Веселков А.Н., Лантушенко А.О., Рогова О.В., Веселков Д.А., Дэвис Д.Б. Термодинамический анализ самоассоциации антибиотика актиноцил-бис - (2-диметиламиноэтил) амида в водном растворе методом 1H ЯМР спектроскопии // Журн.органич. химии. - 2003. - T. 39, вып. 1. - C. 96-100.

5. Пахомов В.И., Итон Р.Дж., Веселков К.А., Рогова О.В., Дымант Л.Н. Структурні та термодинамічні параметри комплексів дауноміцина з дезоксигексануклеотидами за даними ЯМР - спектроскопії // Вестник СевГТУ (Физика и математика). - 2003. - №43. - C.29-38.

6. Рогова О.В., Волынкин В.С., Рыбакова К.А., Пахомов В.И. 1Н-ЯМР анализ самоассоциации самокомплементарного дезоксигексануклеотида 5-d(GpCpApTpGpC) в водном растворе // Вестник СевГТУ (Физика и математика). - 2004. - №59. - C. 22-30.

7. Завьялова О.С., Рогова О.В., Печенкина А.И., Барановский С.Ф. Анализ особенностей вторичной структуры коротких фрагментов ДНК по экспериментальным значениям протонных химических сдвигов // Вестник СевГТУ (Физка и математика). - 2004. - №59. - C. 39-48.

8. Eaton R.J., Davies D.B., Pahomov V.I., Rogova O.V., Hernandez Santiago A.A., Veselkov A.N. 1D - and 2D-1H NMR analysis of the distinctive features of the self-association of the deoxyhexanucleotide, d(GpCpApTpGpC), and its complexation with daunomycin in aqueous solution // Proceeding of 16th International meeting on NMR spectroscopy. - Cambridge. - 2003. - P.156.

9. Lantushenko A.O., Rogova O.V., Davies D.B., Veselkov A.N. 1H NMR analysis of self-association of synthetic phenoxazone antibiotics in aqueous solution // III съезд УБФО. - Львів - 2002. - Р. 42.

10. Рогова О.В., Волынкин В.С., Веселков К.А., Пахомов В.И. Особенности процесса самоассоциации дезоксигексануклеотидов в водном растворе: 1H ЯМР анализ // Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2003». - Севастополь, ЧФ МГУ. - 2003. - С. 80.

11. D.B. Davies, L.N. Djimant, O.V. Rogova., D.N. Ermolaev, A.N. Veselkov. 1H NMR analysis and MM calculations of a distinctive single-stranded, folded structure of the self-complementary deoxyhexanucleotide, 5-d(GpCpApTpGpC) // 17th EENC/32nd Ampere Conference. - Lille. - 2004. - ID PO287.

12. Davies D.B., Eaton R.J., Pahomov V.I., Volynkin V.S., Rogova O.V., Veselkov K.A., Hernandez Santiago A.A., Veselkov A.N. 1H NMR analysis of the stability of self-complementary deoxyhexanucleotides in aqueous solution // Abstracts of XVI International School-Seminar on Spectroscopy of Molecules and Crystals. - Sevastopol. - 2003. - P.248.

13. Pahomov V.I., Rogova O.V., Volynkin V.S., Veselkov K.A., Hernandez Santiago A.A., Semanin A.V., Djimant L.N., Veselkov A.N. Distinctive features of complexation of anthracycline antibiotic daunomycin with deoxyhexanucleotides, d(GCATGC) and d(TACGTA), in aqueous solution: 1D - and 2D-NMR analysis // Abstracts of XVI International School-Seminar on Spectroscopy of Molecules and Crystals. - Sevastopol. - 2003. - P.303.

14. Rogova O.V., Volynkin V.S., Zavyalova O.S., Veselkov A.N. Comparative analysis of complexation of phenanthridine dye with single-stranded deoxyoligonucleotide and a hairpin loop of the same nucleotide content // Proceeding of 4th international young scientists conference on applied physics. - Kyiv. - 2003. - P.154-155.

15. Завьялова О.С., Рогова О.В., Печенкина А.И., Барановский С.Ф. Анализ особенностей вторичной структуры коротких фрагментов ДНК по экспериментальным значениям протонных химических сдвигов // Доповіді I Українськой науковой конференції «Проблеми біологічної і медичної фізики». - Харьків. - 2004. - C. 55.