Cпектроскопія та лазерна фотохімія провітаміну D

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Cпектроскопія та лазерна фотохімія провітаміну D

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеню доктора фізико-математичних наук

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Застосування лазерів до дослідження біологічних процесів, що відбуваються в природі під дією сонячного випромінювання, є важливим розділом лазерної фізики - актуальної області досліджень, яка знаходиться на перетині ряду наукових дисциплін - оптики і спектроскопії, хімічної фізики, біофізики і біохімії. Протягом останніх трьох десятиліть перехід від використання лазерів з наносекундною тривалістю імпульсу до піко- і фемтосекундного діапазону та розвиток різноманітних методів лазерної спектроскопії спричинив відкриття численних надшвидких фотохімічних реакцій, швидкість яких у деяких випадках перевищує швидкість коливальної релаксації.

З цієї точки зору дослідження поширених в природі фотохімічних реакцій органічних молекул з полієновим хромофором - від простих дієнів та триєнів аж до зорового хромофору ретіналю, - що відбуваються із синглетних збуджених станів, час життя яких не перевищує одиниць пікосекунд, є надзвичайно актуальними. До числа таких біологічно важливих реакцій належить і синтез вітаміну D, який відбувається в рослинах і в шкірі людини під дією сонячної ультрафіолетової (УФ) радіації.

Процес синтезу вітаміну D складається з двох основних стадій - фотохімічної, на якій з провітаміну D утворюється превітамін D шляхом УФ індукованого розкриття гексадієнового кільця, і термохімічної стадії, на якій превітамін D пере-творюється у вітамін D шляхом внутрішньомолекулярного переносу протона [1].

Дослідження розгалуженого ланцюга фотохімічних реакцій, що лежать в основі синтезу вітаміну D, зіграли важливу роль в розвитку молекулярної фотохімії. Протягом багатьох років вітамін D, створюваний самою природою, його ізомери та їх характерні реакції є джерелом інформації для розвитку нових ідей і продовжують бути відправною точкою для фундаментальних досліджень аж до сьогодні. Особливо важливим є принцип конформаційного контролю фотопродуктів [1,2], який пояснює різноманітність фотоперетворень превітаміну D, згідно з яким геометрія молекули (конформація триєнової системи р-електронів), що підлягає фотоактивації, обумовлює структуру і стереохімію фотопродуктів.

Завдяки низькому енергетичному бар'єру внутрішньомолекулярного обертання навколо одинарного зв'язку С5-С6 конформери превітаміну D знаходяться в динамічній рівновазі, а їх співвідношення визначається будовою молекули (стеричний фактор) і взаємодією з оточенням (температура, в'язкість, полярність розчинника). У той же час участь цих конформерів в основних фотореакціях (рис. 1) різна. Так, вважається [2], що фотоциклізація Pre > Pro, Pre > L (а також термореакція Pre > D) відбувається при збудженні первинної cZc-Pre конформації превітаміну D, тоді як цис-транс ізомеризація в тахістерин є найбільш ефективною з розгорнутої конформації tZc-Pre.

При ламповому ініціюванні збудження молекул превітаміну D завжди відбувається в конформаційно рівноважному стані. При ініціюванні ж фотосинтезу превітаміну D короткими лазерними УФ імпульсами перед дослідником виникає ціла низка запитань фундаментального характеру: яким чином такий режим опромінення відіб'ється на кінетиці фотореакції? Чи буде однаковим концентраційний склад фотопродуктів при одній і тій же дозі опромінення та чи виконується при цьому закон взаємозамінності Бунзена-Роско?

Тому дослідження динаміки встановлення конформаційної рівноваги превітаміну D за умов збудження фотореакції короткотривалими інтенсивними лазерними імпульсами і розробка адекватної математичної моделі фотореакції, яка враховує специфіку інтенсивного лазерного опромінення, також є актуальною задачею.

Незважаючи на те, що гексатриєновий хромофор превітаміну D є одним із найпростіших полієнів, до цього часу все ще залишається невизначеним, який із багатьох можливих каналів його фотоперетворень буде найбільш ефективним. Це зу-мовлює актуальність пошуку шляхів цілеспрямованого впливу на канали фоторе-акції як за рахунок властивостей ініціюючого лазерного випромінювання, так і шля-хом впливу реакційного середовища на конформаційний розподіл превітаміну D.

Застосування лазерів для ініціювання фотореакцій є важливим ще й з точки зору оптимізації ряду фотохімічних процесів, які використовуються в хімічній і фармацевтичній промисловості. Тому з появою лазерних джерел УФ діапазону у 80-х роках минулого сторіччя з'явились роботи [3-6], спрямовані на оптимізацію стадії фотосинтезу превітаміну D.

Головна практична проблема полягає в тому, що на стадії УФ опромінення провітаміну D (рис. 1) поряд з потрібним фотопродуктом - превітаміном D, - туво-рюються продукти його побічних фотореакцій. Оскільки співвідношення цільового й побічних фотопродуктів залежить від спектрального складу УФ випромінювання, практично важливим завданням є детальне дослідження цієї залежності від довжини хвилі ініціюючого опромінення за допомогою перестроюваного лазера. Можна очікувати, що таке дослідження буде корисним і для розробки УФ ламп з оптимальним спектром випромінювання.

Крім того, актуальність теми дисертаційної роботи зумовлена ще й нагальною екологічною проблемою вимірювання біологічно активної УФ сонячної радіації тоді, коли витончення озонового шару призводить до підвищення її інтенсивності на земній поверхні, а, з іншого боку, зростання забруднення атмосфери стримує проникнення життєво важливої УФ радіації в біосферу.

Зв'язок з науковими програмами, планами, темами. Робота виконувалась у відділі оптичної квантової електроніки Інституту фізики НАН України в рамках відомчих тем НАН України: «Розробка нових лазерних і голографічних принципів керування параметрами когерентних світлових пучків і розробка на їх основі спектроскопії збуджених середовищ і лазерної метрології», № держреєстрації 01840017277 (1984-1989); «Динамічна голографія конденсованих середовищ і фізика перестроюваних лазерів», № держреєстрації 01900029482 (1990-1993); 1.4.1.В/55 «Динамічна голографія і лазерна фізика нелінійних середовищ та біооб'єктів», № держреєстрації 0194U024082 (1994-1997); 1.4.1.В/40 «Нелінійна лазерна динаміка оптичних вихорів, фоторефрактивних взаємодій і біосистем», №01198U002138 (1998-2000); 1.4.1.В/66 «Фізична оптика когерентних світлових полів, утворених за допомогою багатохвильових взаємодій в нелінійних середовищах і біооб'єктах», №0101U000352 (2001-2003); 1.4.1.В/107 «Структура складних світлових полів і світлоіндуковані процеси в конденсованому стані», №0104U003218 (2004-2006).

Робота була підтримана наступними проектами, виконаними під науковим керівництвом автора: ДКНТ України №4/664 «Новий підхід до фотосинтезу превітаміну D: від спектрального до конформаційного контролю фотопродуктів» (1992-1993); Міжнародного наукового фонду U63000 и U63200 (разом з Урядом України) «Лазери в фотохімії провітаміну D: конформаційні та спектральні ефекти» (1994-1996); Європейської комісії з Програми DG12 «Розробка біологічних дозиметрів для моніторингу впливу сонячної УФ радіації на біосферу та здоров'я людини», шифр «BIODOS» (1997-1998); УНТЦ Гр-50 «Eкологічний моніторинг біологічно активної «антирахітної» сонячної УФ радіації в Kиєві і в Антарктиді та розробка «ВітаD» біодозиметру» (2002-2005). Частина досліджень виконувалась в рамках НДР з Ленінградським хім.-фарм. об'єднанням «Октябрь»: «Розробка методу двоступеневого опромінення ергостерину в технології виробництва вітаміну D₂» (договір №172/90-16а від 18.05.1990) та «Розробка аналітичних методів контролю процесу фотосинтезу вітаміну D₂» (договір №270/91-16 від 07.12.1991).

Метою роботи є визначення закономірностей впливу параметрів лазерного випромінювання (довжини хвилі, інтенсивності, тривалості імпульсу) на фотофізичні та фотохімічні процеси в реакції фотосинтезу превітаміну D для пошуку шляхів цілеспрямованого впливу на його конформаційний розподіл та канали фотоперетворень у різних середовищах. Практична мета роботи полягала у розробці методу спектрофотометричного аналізу багатокомпонентної суміші фото-ізомерів провітаміну D з урахуванням її фотодеградації, пошуку шляхів оптимізації стадії фотосинтезу превітаміну D, а також розробці дозиметру біологічно активної сонячної УФ радіації на основі фотосинтезу превітаміну D (in vitro).

Для досягнення поставленої мети необхідно було вирішити такі завдання:

1. Розробити метод спектрального концентраційного аналізу багатокомпонентної суміші фотоізомерів для дослідження кінетики фотореакції в реальному часі (розділ 2);

2. За допомогою перестроюваного лазера дослідити вплив довжини хвилі УФ випромінювання на кінетику фотореакції і вихід фотопродуктів (розділ 3);

3. Дослідити вплив інтенсивності опромінювання на кінетику фотосинтезу превітаміну D при ініціюванні пікосекундними лазерними імпульсами і розробити адекватну математичну модель фотореакції (розділ 4);

4. Дослідити вплив реакційного середовища на конформаційну рівновагу превітаміну D, ефективність каналів його фотоперетворень і механізм фотореакції (розділ 5);

5. На основі даних, отриманих за допомогою перестроюваного лазеру, визначити шляхи оптимізації стадії фотосинтезу в технології виробництва вітаміну D з використанням лампових джерел УФ випромінювання різного спектрального складу (розділ 6);

6. Дослідити можливості дозиметрії біологічно активної УФ радіації Сонця та штучних джерел, використовуючи реакцію фотоізомеризації провітаміну D in vitro (розділ 7).

Об'єктом дослідження є реакція фотосинтезу превітаміну D (in vitro), що лежить в основі природного процесу синтезу вітаміну D.

Предмет дослідження - фотофізичні і фотохімічні процеси, які відбуваються при лазерному ініціюванні фотосинтезу превітаміну D в різних середовищах, та їх вплив на кінетику фотореакції і формування кінцевих фотопродуктів.

Методи дослідження. В роботі експериментальні спектральні дослідження кінетики фотореакції поєднувались з її математичним моделюванням за допомогою системи кінетичних диференційних рівнянь, а також залучались спрощені моделі, що наочно демонструють виявлення досліджуваних ефектів. Абсорбційна УФ спектроскопія була основним методом слідкування за ходом фотореакції, а для концентраційного спектрального аналізу було развинуто оригінальний метод, який враховував незворотну фотодеградацію утворюваної багатокомпонентної суміші фотоізомерів. Для дослідження впливу довжини хвилі лазерного УФ випромінювання на кінетику фотореакції було розвинуто методи прецизійного вимірювання довжини хвилі та підвищення спектральної яскравості перестроюваних лазерів на розчинах органічних барвників (ЛРОБ)

Наукова новизна одержаних результатів полягає в тому, що вперше

1. На відміну від загальноприйнятого хроматографічного аналізу, застосовано новий методологічний підхід до систематичних досліджень кінетики фотоізомеризації провітаміну D в умовах імпульсного лазерного опромінення, який полягає в поєднанні УФ абсорбційної спектроскопії з математичним моделюванням кінетики фотореакції та застосуванні спеціально розвинутого експресного спектрофотометричного аналізу сумішей фотоізомерів вітаміну D із урахуванням їхньої фотодеградації.

2. При дослідженні впливу довжини хвилі опромінювання на кінетику фотореакції виявлено новий спектральний ефект, а саме, різке підвищення ефективності необоротного каналу, яким звичайно нехтували, при опроміненні провітаміну D на червоному крилі його смуги поглинання (л>300 нм). Числовими розрахунками доведено неадекватність загальноприйнятого фотостаціонарного наближення при ініціюванні фотореакції в цій спектральній області та експериментально доведено необхідність врахування фотодеградації фотоізомерної суміші при концентраційному аналізі.

3. За допомогою теоретичного аналізу кінетики розгалужених фотореакцій з конформаційно рухливим інтермедіатом виявлено залежність виходу кінцевих фотопродуктів від інтенсивності опромінення, що пов'язано із збудженням нерівно-важних конформерів. Експериментально встановлено, що таке порушення закону взаємозамінності відбувається не за рахунок нелінійних ефектів, а при більш низь-кій інтенсивності I << 1/уф, ніж потрібно для насичення поглинання (де ф ~ 10^-13c - час життя збудженого синглетного стану провітаміну D, а у - переріз поглинання).

4. Виявлено вплив інтенсивності на квантові виходи і канали фотоперетворень превітаміну D внаслідок збудження його нерівноважних конформерів, і реалізовано конформаційно селективну фотохімію із суттєвим зниженням виходу побічного транс-ізомеру тахістерину при опроміненні провітаміну D з інтенсивністю I 1/₂, де ₂ 125 пс - час встановлення конформаційної рівноваги превітаміну D.

5. Спостережено нетривіальний ефект уповільнення фотоізомеризації провітаміну D зі зростанням інтенсивності опромінення в межах 1/ > I >1/₁, де ₁ 5 пс - час термалізації (коливальної релаксації) утворюваного превітаміну D. При цьому збудження «гарячої» молекули превітаміну D спричинює зростання імовірності зворотного замикання гексадієнового кільця, що проявляється як ефект «молекулярної пам'яті».

6. Виявлено вплив реакційного середовища не тільки на ефективність, але й на механізм цис-транс ізомеризації превітаміну D. Так, адсорбція на поверхні кремнезему знижує її ефективність через зсув конформаційної рівноваги превітаміну D. В той же час ефективність цис-транс ізомеризації значно збільшується при розчиненні провітаміну D в нематичному рідкому кристалі (РК), що зумовлено проявом її некласичного (hula-twist) механізму.

Практичне значення отриманих результатів.

1. На основі проведеного аналізу деструктивного впливу необоротного каналу в умовах лампового опромінення розчинів провітаміну D з високими технологічними концентраціями (0,1-0,2%), видано практичні рекомендації щодо зміни режиму опромінення, що дозволило суттєво знизити фотодеградацію в умовах виробництва і підвищити вихід превітаміну D.

2. Вперше запропоновано нетрадиційне використання фоточутливих молекул стероїдів для безконтактного методу фотоорієнтації нематичних рідких кристалів, актуального в технології виробництва різноманітних рідкокристалічних приладів.

3. Запропоновано і розроблено новий спектрально селективний метод дозиметрії біологічно активної УФ радіації (D-дозиметр), в основу якого закладено спектральний контроль фотосинтезу превітаміну D (in vitro), а також шляхом розчинення провітаміну D в РК матриці розроблено персональний біодозиметр УФ радіації з візуальною оцінкою поглинутої УФ біодози.

Особистий внесок здобувача. Усі результати, які включені до дисертації, одержано за визначальної особистої участі здобувача. В роботах з перестроюваних лазерів (1* - 7*) автор приймав участь в експериментальних вимірюваннях, інтер-претації отриманих результатів і підготовці публікацій. Розробка спектральної методики досліджень з лазерного ініціювання фотоізомеризації провітаміну D (8* - 10*, 12* - 14*, 28*, 30*, 47*) належить автору, який особисто проводив всі спектральні вимірювання. Постановка задачі спектрофотометричного концентраційного аналізу і участь в розробці алгоритму програми (23*) належить автору. Розробка адекват-них теоретичних моделей фотореакції (17*, 18*, 21*, 29*, 40*) проводилась за ініціа-тивою автора і його безпосередній участі. Розрахунки кінетики фотореакції і її дослідження з метою оптимізації лампової технології (19* - 20*) виконані автором, а співавтори проводили хроматографічний аналіз і виробничі випробування. Автору належить ідея і постановка задачі досліджень фотореакції в гетерогенних середо-вищах (11*, 15*, 22*, 26*) і рідких кристалах (33*, 35*, 41*, 43* - 45*, 53* - 54*, 56*), які виконані аспірантами під його керівництвом. Автору належить ідея дозиметрії біоактивного сонячного УФ випромінювання за допомогою спектрального спосте-реження за кінетикою фотосинтезу превітаміну D (23*, 24*, 31*, 51*, 55*), а також ідея рідкокристалічного персонального УФ біодозиметру з візуальною оцінкою отриманої дози (33*, 37*, 39*, 42*, 50*, 52*), які досліджені в рамках наукових проектів під керівництвом автора. Всі експерименти з тестування D-дозиметра (32*, 36*), опроміненню ексимерними лампами (38*) і лазерами (47*) виконані автором особисто на обладнанні, наданому зарубіжними колегами.

Апробація результатів дисертації. Основні результати дисертації доповідались і обговорювались на багатьох конференціях, симпозіумах і нарадах, основні з яких вказані нижче: IV, V і VI Всесоюзні конференції «Оптика лазеров», Ленінград (1984, 1987, 1990); V і VI Всесоюзні наради з фотохімії: Суздаль (1985), Новосибірськ (1989); Міжнародні конференції з когерентної і нелінійної оптики: XIII КіНО'88, Мінськ і XIV КіНО'91, Ленінград; VII Всесоюзна конференція із взаємодії оптичного випромінювання з речовиною, Ленінград (1988); XVI, XVIII, XX IUPAC Symposia on Photochemistry: Finland (1996), Germany (2000), Spain (2004); International Conferences «Laser Applications in Life Sciences»: Moscow (1990), Minsk (1994), Finland (1997), Lithuania (2002); 8^th, 9^th, 12th Vitamin D Workshops: France (1991), USA (1994), The Netherlands (2003); SPIE Conference on Biomedical Optics, USA (1994); 15^th International Conference on Coherent and Nonlinear Optics ICONO'95, Russia; International Conferences on Photochemistry: England (1995); Poland (1997); Russia (2001), Japan (2003); 2^nd International Workshop on Biological UV-Dosimetry, Hungary (1996); European Conference on Atmospheric UV Radiation, Finland (1998); International Conference «Physics of Biologic Systems», Ukraine (1998); International Conferences «Biologic Effects of Light»: Switzerland (1999), USA (2001); International Conferences on Liquid Crystals: United Kingdom (2002), Slovenia (2004); Міжнародні конференції з атмосферної радіації: МСАР-2002, MCAP-2004, Росія; 2nd International Congress on Ultraviolet Technologies, Austria (2003); International Congress on Biometeorology, Germany (2005).

Публікації. Основні результати дисертаційної роботи опубліковано в 51 статті у фахових наукових виданнях, багатьох тезах міжнародних конференцій, одному авторському свідоцтві і двох патентах України.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається із вступу, 7 розділів та висновків обсягом 308 сторінок, містить 129 рисунків і 19 таблиць. Перелік використаної літератури включає 258 найменувань і займає 24 сторінки.

Основний зміст роботи

випромінювання фото реакція ультрафіолетовий вітамін

У вступі міститься загальний огляд теми дослідження, обґрунтовано її актуальність, сформульовано мету та задачі досліджень, відображено новизну, наукове і практичне значення отриманих результатів, методи досліджень, зв'язок роботи з науковими темами, особистий внесок здобувача у вирішення проблеми, а також коротко наведено зміст розділів дисертації.

В першому розділі відображено сучасні уявлення про механізми фотохімічних реакцій на основі розгляду багатомірних поверхонь електронної потенціальної енергії в основному S₀ і збудженому S₁ станах в залежності від ядерних координат. Систематичні дослідження молекулярних деформацій показали, що поверхні S₁ і S₀ в багатьох випадках мають реальні перетини з розмірністю (n-2) в формі перевернутого конуса. Саме наявність конічних перетинів (КП), які досягаються без суттєвих бар'єрів, забезпечує неперервну траєкторію молекули з S₁ в S₀ та може пояснити надшвидкі фотореакції (піко- і фемтосекундного діапазону) та внутрішню конверсію. Крім того, КП також діє як точка розгалуження траєкторії відносно декількох реакційних каналів з формуванням різноманітних фотопродуктів [7].

Застосування лазерних джерел світла відкриває нові можливості керування хімічними реакціями. Поєднання таких властивостей лазерного випромінювання, як висока інтенсивність, монохроматичність, поляризація, когерентність, перестроюваність частоти дозволяє впливати на швидкості і перерізи фотореакцій. З іншого боку, лазери дозволяють детектувати та ідентифікувати продукти реакції і аналізувати їх внутрішній стан з надзвичайно високою чутливістю.

Багаторічні дослідження фотоізомеризації провітаміну D [1] виявили суттєву залежність концентраційного складу фотоізомерної суміші, утворюваної при УФ опроміненні провітаміну D, від довжини хвилі. Це демонструє рис. 3, на якому приведено кінетики фотореакції, розраховані за допомогою системи кінетичних диференційних рівнянь [8] для двох різних довжин хвиль.

Тому перші роботи з лазерного ініціювання фотоізомеризації провітаміну D [3-5], які з'явились на початку 80-х років минулого століття, мали на меті підвищення виходу превітаміну саме завдяки вибору довжини хвилі та режиму лазерного опромінювання.

Але цим роботам, на нашу думку, притаманний ряд недоліків. Так, в усіх роботах автори нехтували наявністю слабкого (=0.039) необоротного каналу фотоперетворень Pre>Tox [9], тобто при концентраційному аналізі сумма концентрацій 4-х основних фотоізомерів завжди вважалась рівною 100%. Саме за таких умов було виявлено [5] різку (dramatic) зміну розрахованого квантового виходу Pre>L в межах вузького спектрального діапазону 300-305 нм. При порівнянні результатів робіт [3,5] незрозумілою є значна відмінність складу сумішей при опроміненні різними типами лазерів на близьких довжинах хвиль 305 і 308 нм, при цьому, однак, автори вказують тільки середню енергію лазерних імпульсів, тоді як важливою є густина потужності (інтенсивність) в опромінюваному об'ємі. Ще одним недоліком можна вважати те, що при дослідженні співвідношення Pre/T в залежності від тривалості лазерного імпульсу в роботі [5] велика різниця в інтенсивності піко- і наносекундного випромінювання залишилась поза увагою авторів, а в запропонованій моделі не враховувалась конформаційна рухливість молекул превітаміну D. Ці недоліки було враховано при виконанні систематичних досліджень в рамках дисертаційної роботи.

Другий розділ носить методичний характер. Він містить відомості про розроблені способи підвищення спектральної яскравості випромінювання імпульсних ЛРОБ шляхом переключення добротності зв'язаних резонаторів [1*, 4*, 6*] та прецизійного електронного перестроювання довжини хвилі випромінювання ЛРОБ за допомогою акустооптичного дефлектора на кристалі TeO₂ [2*, 5*, 7*]. При цьому керування довжиною хвилі генерації шляхом зміни частоти f високочастотного генератора, який живить акустооптичну комірку, дозволяє синтезувати спектр випромінювання лазера, структура якого корелює з особливостями спектра поглинання досліджуваної речовини і, таким чином, імітує спектральну маску при кореляційному спектральному аналізі багатокомпонентних сумішей [3*].

Однак, відсутність характерної структури в спектрах поглинання фотоізомерів провітаміну D унеможливлює застосування кореляційного аналізу суміші фотоізомерів вітаміну D. Як правило, з цією метою застосовують хроматографічний аналіз (HPLC), недоліком якого є значні витрати часу, пов'язані з необхідністю маніпуляцій з розчином.

На нашу думку, незважаючи на те, що спектри поглинання основних 4-х фотоізомерів перекриваються в одному спектральному діапазоні (рис. 4), якісні висновки щодо кінетики фотореакції та формування основних фотопродуктів можна робити на основі спостережень за зміною УФ спектру поглинання розчину провітаміну D в процесі УФ опромінення. Очевидно, що накопичення тахістерину повинно супроводжуватись поміт-ним зростанням оптичної густини (ОГ). В той же час наслідком переважного накопичення превітаміну D буде зниження ОГ на л = 282 нм і зростання на л = 260 нм, яка відповідає максиму-му поглинання превітаміну D. Стабілізація спектру протягом деякого періоду УФ опромінювання свідчить про встановлення динамічної рівноваги поміж основними фотоізомерами, так званого фотостаціонарного стану, а наступне зниження ОГ на стадії «переопромінення» зумовлено необоротними фотоперетвореннями превітаміну в токсистерини Pre>Тох (оскільки їх спектр поглинання є зсунутим в короткохвильову область по відношенню до спектрів основних фотоізомерів Pro, Pre, T і L).

Для кількісного аналізу суміші фотоізомерів вітаміну D спектрофотометричний метод з використанням методу найменших квадратів вперше було запропоновано в роботі [10] без урахування незворотної фотодеградації суміші фотоізомерів. Тобто сумарна процентна частка фотопродуктів, які утворювалися при УФ опроміненні, по відношенню до концентрації вихідного провітаміну D завжди приймалася рівною 100%. Додатковим недоліком [10] була систематична поява від'ємних концентрацій компонентів, присутніх в малій кількості, або відсутніх зовсім, що не має фізичного сенсу.

«Штрафна» функція контролює відмінність сумарної концентрації 4-х основних фотоізомерів від одиниці (100%) в межах невизначеності ?_с << 1, тобто при суттєвому зменшенні їх сумарної концентрації внаслідок фотодеградації досягнення мінімального значення функціонала (2.1) стає неможливим в заданому інтервалі довжин хвиль.

Тестування розробленого методу аналізу включало в себе перевірку його адекватності шляхом порівняння з результатами хроматографічного аналізу, а також відтворюваності і стійкості результатів аналізу по відношенню до початкових умов [20*, 34*]. Розкид вимірюваних концентрацій Pre і T не перевищував ± 1,5%, а для люмістерину і провітаміну D він був вищим (до 4%), що зумовлено подібністю спектрів поглинання Pro і L (див. рис. 4).

У третьому розділі наведено результати досліджень кінетики фотоізомеризації провітаміну D в умовах наносекундного лазерного опромінення другою гармонікою ЛРОБ в широкому спектральному діапазоні 260-305 нм, а також ексимерними KrF і XeCl лазерами, які генерують на = 248 нм і = 308 нм.

Розчин 7-дегідрохолестерину (7-ДГХ, провітаміну D₃) в етанолі (С = 10^-5моль/л) опромінювався в кварцевій кюветі товщиною 1 см. Перед опроміненням для видалення кисню через розчин борботували аргон, потім кювету герметизували. В процесі опромінення розчин перемішу-вався магнітною мішалкою. Потужність лазерного випромінювання контролювалась приладом ІМО-2. Для спостереження за ходом фотореакції перед початком опромінення і після фіксованих доз реєструвались УФ спектри поглинання на приладі «Specord UV-VIS».

Перший же експеримент з опроміненням ексимерним XeCl лазером (л = 308 нм, Р_ср ~ 300 мВт, ф_імп ~15 нс, f = 20 Гц) і спостере-женням за трансформацією спектра 7-ДГХ виявив неочікувані особи-вості (Рис. 5): із зростанням дози опромінення не спостерігалось стабілізації УФ спектра, характерної для фотостаціонарного стану [9*, 10*], а падіння оптичної густини в області поглинання 7-ДГХ з одночасним її зростанням в короткохвильовій області на л=252 нм свідчило про необоротне перство-рення вихідного 7-ДГХ в фото-продукт, відмінний від основних 4-х фотоізомерів (порівняти спектр 16 на рис. 5 із спектрами рис. 4).

Непричетність двоквантових процесів до незвичайної кінетики фотоізомеризації 7-ДГХ було доведено при варіюванні інтенсивності лазерного випромінювання в діапазоні 10²ч10⁸ Вт/см².

З іншого боку, опромінення розчину 7-ДГХ за допомогою перестроюваного ЛРОБ із інтенсивністю 10⁴ч10⁶ Вт/см² виявило суттєву різницю в кінетиці фотореакції в залежності від довжини хвилі. При збудженні в межах 248-295 нм фотореакція відбувалась в повній відповідності до традиційної схеми, тоді як при збудженні на довгохвильовому краю (л>305 нм) спостерігався «аномальний» хід фотореакції без встановлення фотостаціонарного стану.

Як довів теоретичний аналіз, основною причиною зростання ефективності необоротного каналу є перерозподіл співвідношення коефіцієнтів поглинання Pro і Pre з довгохвильового боку від точки їх перетину на л=300 нм (див. рис. 4), внаслідок чого різко зростає швидкість необоротних фотореакцій Рre>Тох по відношенню до швидкості утворення превітаміну D (Рrо> Рre).

Цей висновок підтверджують чисельні розрахунки кінетики фотореакції при опроміненні на довжинах хвиль л_опр= 295 нм і 308 нм, проведені за двома схемами: одна включає тільки оборотні фотореакції, а друга доповнена каналом необоротних фотоперетворень Рre> Тох і описується наведеною нижче системою рівнянь [13*, 14*].

Тут N_i(t) - концентрації фотоізомерів, i = 1…5 відповідає Pro, Pre, T, L і Tox, f_kj - передаточна функція (в сек^-1): f_kj = 0.38·10^-20_akjе_j(л), де Ц_а - густина падаючого потоку фотонів (фотон /см²с); ц_kj - квантовий вихід перетворення j>k, і е_j(л) - молярний показник поглинання фотоізомеру (j) на довжині хвилі л.

Із співставлення рис. 7а) і б) з в) і г) очевидним є слабкий вплив необоротного каналу Рre>Тох при опроміненні на 295 нм. Однак, для л_опр= 308 нм врахування реакцій Рre>Тох кардинально змінює кінетику фотореакції: швидке зменшення сумарної концентрації 4-х фотоізомерів (Sum) внаслідок накопичення токси-стеринів починається з самої ранньої стадії фотолізу, внаслідок чого суттєво (майже в два рази) знижується максимальна концентрація Рre і Т, а сумарна концентрація 4-х основних фотоізомерів у цей момент зменшується майже до 80%!

Результати цих розрахунків було експерименттально підтверджено (Рис. 8) при опроміненні розчину 7-ДГХ в етанолі XeCl лазером (л=308 нм, _імп=16 нс) з інтенсивністю ~ 3.5·10⁶ Вт/см² [47*] і, таким чином, було доведено, що існуюче уявлення про несуттєвість необоротного каналу є хибним при довгохвильовому опроміненні, і використання схеми фотореакції, яка містить тільки оборотні фотоперетворення, і концен-траційного аналізу, який не враховує фото-деградацію суміші основних 4-х фотоізомерів, є некоректним. На нашу думку, саме неадекватний концентраційний аналіз і є причиною виявлених в роботі [5] «драматичних змін» квантових виходів в області 300-305 нм, розрахованих за виміряними концентраціями.

У розділі 4 приведено результати досліджень кінетики фотореакції при високоінтенсивному пікосекундному лазерному опроміненні, оскільки, як відомо, інтенсивність ініціюючого випромінювання відноситься до числа факторів, які контролюють канали фотохімічних реакцій. Відомо, що при інтенсивному лазерному опроміненні внаслідок двоступеневого поглинання з'являються нові канали фотоперетворень з високозбуджених станів, які приводять до появи нетрадиційних фотопродуктів. В цьому випадку, змінюючи єдиний параметр - інтенсивність опромінення, можна стимулювати якісно різні типи фотоперетворень і селективно утворювати фотохімічні продукти з високим квантовим виходом.

Нами на прикладі простої моделі розгалуженої фотореакції з конформаційно рухливим проміжним фотопродуктом (Рис. 9) проаналізовано вплив інтенсивності на вихід кінцевих фо топродуктів [21*]. Поглинання світла переводить молекули А, В₁ і В₂ в електронно збуджені стани зі швидкістю, пропорційною відповідним перерізам поглинання у_i, см² і густині потоку фотонів n, фотон·cм^-2с^-1. Релаксація збуджених молекул відбувається або в основний вихідний стан з константами k_i, c^-1, або в основний стан фотоізомеру з константами г_i, c^-1, при цьому з_i = г_i / (k_i + г_i) - квантова ефективність фотохімічної реакції. Оборотні темнові перетворення конформерів В₁-В₂ характеризуються константами q₊ і q _- (с^-1), при цьому важливо, що q₊ і q _- << г_i, k_i [11].

Цей висновок є важливим для органічного синтезу, оскільки відкриває можливість підвищення виходу кінцевого фотопродукту С, вихід якого при ламповому опроміненні є низьким внаслідок низької імовірності стерично напруженої конформаціі В₁ в рівноважному конформаційному розподілі_..

Оцінки показують, що для типових значень у = 10-¹⁷ см² і констант конформаційних переходів q = 10¹⁰с^-1 [12] необхідної інтенсивності (густини потоку фотонів) n>10²⁷фотон·см^-2с^-1 можна досягти при пікосекундному лазерному опроміненні. При цьому імовірність двоступеневого збудження буде незначною, оскільки швидкості релаксації збуджених станів суттєво перевищують швидкості конформаційних перетворень [12].

Експериментальні дослідження впливу інтенсивності на кінетику фотоізомеризації 7-ДГХ при її ініціюванні пікосекундними лазерними імпульсами виконувались в Інституті спектроскопії РАН. Джерелом високоінтенсивного УФ випромінювання був YAG: Nd³⁺-лазер з перетворенням частоти генерації в четверту гармоніку (л = 266 нм), тривалістю імпульсу ~23 пс при частоті повторення 1Гц і середній енергії в імпульсі ~1ч2 мДж. В процесі опромінення енергія кожного лазерного імпульса вимірювалась каліброваним піроелектричним фотоприймачем, до якого відводилась частина світлового пучка і сигнал з якого потрапляв на цифровий осцилограф С9-8, з'єднаний з комп'ютером для контролю заданої дози. Зміна інтенсивності лазерного випромінювання в об'ємі розчину відбувалась за допомогою довгофокусної кварцевої лінзи (F =102 см), при цьому варіювання розміру світлової плями на передній стінці кювети від 0.3 до 0.003 см² і застосуванні ослаблюючих фільтрів дозволяло змінювати інтенсивність опромінення в межах 10¹¹ч10¹⁴ Вт/м².

Розчини 7-ДГХ в етанолі (V=2 см³, С=5^.10^-5 моль/л) опромінювались в герметизованих кварцевих кюветах товщиною 1 см. Перед опроміненням розчини борботувались аргоном і в процесі опромінення ефективно перемішувались завдяки вібрації від звукового генератора з частотою ~20Гц. Періодично після опромінення заданими дозами (100-200мДж) кювету з розчином переносили для реєстрації УФ спектрів поглинання на спектрофотометрі «Specord М400». Було проведено декілька серій таких експериментів з різною інтенсивністю ініціюючого випромінювання.

Як згадувалось раніше, при короткохвильовому УФ опроміненні накопичується значна кількість тахістерину, що приводить до підвищення оптичної густини зразка з часом опромінення аж до досягнення фотостаціонарного стану. Перші ж експерименти [12*] виявили суттєву залежність максимального приросту оптичної густини від інтенсивності при однаковій дозі лазерного опромінення.

Зниження приросту оптичної густини при більш високій інтенсивності опромінення посередньо свідчить про зниження накопичення тахистерину, що узгоджується з результатом роботи [5], проте, не знаходить пояснення в рамках запропонованої там моделі. З урахуванням послідовності процесів, що відбуваються при розкритті гексадієнового кільця [11], нами було запропоновано і проаналізовано модель [29*], яка враховує конформаційну рухливість молекули превітаміну D, пояснює отриманий нами результат і не протирічить результатам роботи [5]. Розкриття гексадієнового кільця Pro відбувається у збудженому електронному стані 2А₁ (Рис. 11), і молекула Pre утворюється в коливально-збудженому основному стані. Первинна конформація cZc-Pre з'являється через ф₁=5.2 пс [12], а потім шляхом внутрішньомолекулярного обертання навколо зв'язку С5-С6 встановлюється конформаційна рівновага Pre протягом часу ф₂ = 125 пс.

Виходячи із схеми на рис. 11 з урахуванням умови насичення поглинання I > (уф)^-1, можна очікувати, що при опроміненні Pro лазерними імпульсами тривалістю ф_імп (ф₁<ф_імп<ф₂) в міру підвищення інтенсивності опромінення I спочатку буде зростати імовірність збудження нерівноважних конформерів новоутворюваних молекул Pre, в той час як для двоступеневого збудження Prо потрібна більш висока інтенсивність. А оскільки цис-транс ізомеризація найбільш ефективна із tZc-Pre конформеру [6], то, підвищуючи інтенсивність опромінення можна суттєво знизити вихід тахістерину за рахунок переважного збудження cZc-Pre конформерів. Модельні розрахунки [21*] і наступні експерименти [28*] підтвердили це припущення, що демонструє Рис. 12. Неважко побачити, що з більш високою інтенсивністю опромінення накопичення T суттєво зменшується, однак, максимально досяжна концентрація Pre збільшується не так помітно, як передбачали чисельні розрахунки. В той же час спостерігається новий непередбачуваний ефект суттєвого сповільнення розпаду Prо.

Одна з гіпотез, яка могла б пояснити цей ефект, припускає можливість виникнення наведеного поглинання етанолу під час високоінтенсивного опромінення. Як результат, ефективне число фотонів, що впливають на молекули 7-ДГХ, може суттєво зменшитися (за рахунок поглинання розчинником), наслідком чого і буде спостережене уповільнення фотореакції. Для перевірки цієї гіпотези було досліджено залежність пропускання етанолу і розчину 7-ДГХ від інтенсивності лазерного випромінювання в кюветах різної товщини.

Виявилось, що, дійсно, з підвищенням інтенсивності в кюветах товщиною 1 см пропускання етанолу суттево знижується, при цьому ефект слабшає в міру зменшення товщини шару розчиннику. Тому, щоб звести до мінімуму вплив двофотонного поглинання розчиннику, було проведено додаткові дослідження фотореакційної кінетики в тонких (1 мм) кюветах (С = 5^.10^-4моль/л), в яких, однак, також виявилось сповільнення фотореакції [28*].

Механізм спостереженого явища, - ефект «молекулярної пам'яті», - можна пояснити на основі сучасних уявлень про фотоізомеризацію провітаміну D [7,12]. Після поглинання фотона молекула переходить на поверхню збудженого стану, рухається у напрямі до збудженої cZc* конформації превітаміну D, а потім через конічний перетин (КП) переходить в основний стан превітаміну D. В міру просування молекули цим маршрутом збільшується відстань поміж атомами вуглецю С9 і С10, що, нарешті, призводить до розриву цього зв'язку. Можна уявити, що внаслідок високої інтенсивності опромінення I ? 1/уф₁ стає можливим збудження «гарячої» молекули превітаміну (cZc⁺* - Pre) ще до проходження воронки КП, коли її геометрія ще не зазнала радикальної зміни (атоми вуглецю С9 і С10 ще не надто віддалені один від одного). Тоді при її збудженні буде велика імовірність зворотного замикання гексадієнового кільця, тобто квантовий вихід зворотного фотоперетворення «гарячої» молекули превітаміну D cZc* - Pre>Pro може бути набагато більшим за той, який виміряно для фотоперетворення Pre>Pro в основному стані під час конформаційної рівноваги.

Для адекватного опису кінетики фотореакції при високоінтенсивному пікосекундному опроміненні в розрахункову модель фотореакції було введено «гарячий» стан молекули превітаміну D (B_hot). При цьому проведений розрахунок максимально досяжної концентрації превітаміну D (Pre_max) з підвищенням інтенсивності опромінення виявився близьким до результатів експерименту і підтвердив уповільнення розпаду Pro із зростанням інтенсивності [40*].

Таким чином, виявлено порушення закону взаємозамінності Бунзена-Роско, згідно з яким величина фотобіологічного ефекту пропорційна до дози опромінення. Ми показали, що кінетика фотоізомеризації провітаміну D залежить від інтенсивності опромінення без участі нелінійних ефектів, і що ця особливість властива всім розгалуженим фотореакціям з конформаційно рухливим інтермедіатом.

В п'ятому розділі приведено результати досліджень впливу реакційного середовища на органічні фотореакції з конформаційно рухливими проміжними фотопродуктами. Молекулярні конформації, які в звичайних розчинах в основному стані швидко переходять одна в одну, можуть стати «замороженими» в конкретному конформаційному розподілі, внаслідок чого вихід кінцевих фотопродуктів може суттєво змінитись.

Дослідження фотоізомеризації 7-ДГХ в синтетичних ліпідних бішарах [13] показали, що вихід фотопродуктів в таких системах суттєво відрізняється від випадку гомогенного розчину внаслідок обмеження конформаційної рухливості молекули превітаміну D і зміщення її конформаційної рівноваги на користь cZc-Pre конформації.

Подібний ефект спостерігався нами при дослідженні фотоізомеризації 7-ДГХ у міцелярних системах на основі водно-етанольних сумішей з різним спів-відношенням води і етанолу [15*]. В подальших дослідженнях для обмеження конформаційної рухливості превітаміну D було застосовано адсорбцію на поверхні дисперсного діоксиду кремнію, який широко використовується як носій лікарських препаратів. Дисперсні системи силікагель-розчинник (етанол чи гексан) містили ~2г кремнезему в 1 мл розчинника і були приготовані таким чином, що частинки SiO₂ були щільно спаковані, так що оптична густина суспензії не змінювалась у часі.

Відсутність зміщень і появи додаткових смуг в УФ спектрах поглинання провітаміну D свідчили про те, что р-електрони дієнового хромофору не приймають участі у взаємодії з поверхнею, а його адсорбція на гідроксильованій поверхні SiO₂, ймовірно, обумовлена водневим зв'язком периферійної полярної ОН-групи з гідроксилами поверхні. Саме цей фактор, а також орієнтація молекули на поверхні визначають її фотохімічну поведінку в адсорбованому стані. Значний вплив адсорбції на вихід фотопродуктів випливає з порівняння трансформації спектрів поглинання 7-ДГХ в розчині і гетерогенних матрицях.

Як видно, в системі силікагель-етанол приріст оптичної густини, який характеризує накопичення тахістерину, помітно нижчий, ніж в розчині, а в силікагель-гексановій системі такий приріст зовсім відсутній, що свідчить про зниження вмісту транс-ізомеру Т в реакційній суміші.

Пояснення цього ефекту випливає із принципу конформаційного контролю і запропонованої моделі адсорбції превітаміну D (Рис. 15). Гідрофобні і електростатичні взаємодії обмежують внутрішньомолекулярні обертання навколо з'вязку С5-С6, що обумовлює переважний стан молекули превітаміну D в первинній cZc-Pre конформації, менш схильної до цис-транс ізомеризації.

Підтвердженням наданого вище механізму адсорбції є виявлена здатність адсорбованого шару молекул 7-ДГХ гомеотропно орієнтувати нематичний рідкий кристал. Більш того, за допомогою зміни конфігурації адсорбованих молекул, внаслідок їх фотоперетворень під час УФ опромінення (розкриття гексадієнового кільця з наступною цис-транс ізомеризацією), вдалося впливати на їх орієнтучу здатність (Н>Р перехід з гомеотропної до планарної орієнтації) [41*, 43*], а за допомогою електричного поля контролювати оборотні Р>Н переходи [54*].

Цікаво також було дослідити фотоізомеризацію 7-ДГХ в рідкокристалічній (РК) матриці, особливо тому, що дослідження фотореакцій в упорядкованих середовищах є актуальним напрямком сучасної фотохімії. У якості РК матриць ми використовували прозорі в УФ діапазоні нематичні рідкі кристали РК-805 (НІОПІК, Росія) та ZLI-1695 (Merck). Було виявлено, що розчинення хіральних молекул 7-ДГХ у нематичному РК приводить до індукування холестеричної фази із закрученою направо макроспіраллю, величина кроку якої залежить від концентрації 7-ДГХ [33*, 44*, 45*].

Спектр 7-ДГХ у РК матриці зазнає червоного зміщення на 1.5 нм по відношенню до етанолу, яке зростає до 4 нм по мірі УФ опромінення і накопичення тахістерину. Як відомо, батохромний зсув спектру поглинання відбувається, коли хромофор стає більш пласким, що приводить до збільшення спряження -електронів. Можна припустити, що шарувата структура холестеричного РК справляє деякий «ефективний тиск» на молекули домішки. При цьому очевидно, шо вплив РК мікрооточення на молекули Pro з жорсткою структурою повинен бути меншим, ніж на конформаційно рухливі молекули Prе і Т.

Дослідження спектральної кінетики фотоізомеризації провітаміну D₃ в нематичному РК виявили, що приріст оптичної густини під час опромінення залежить від кроку індукованої холестеричної спіралі Р: з його зменшенням приріст оптичної густини суттєво збільшується, що свідчить про зростання концентрації утворюваного тахістерину.

Таке підвищення квантового виходу цис-транс ізомеризації в більш в'язкому середовищі важко зрозуміти в рамках класичного уявлення про її механізм, згідно з яким цис-транс ізомеризація відбувається внутрішньомолекулярним поворотом на 180⁰ навколо подвійного С₆=С₇ зв'язку. Можна припустити, що в умовах обмеження конформаційної рухливості шарувата структура РК більш сприятлива для некласичного, так званого «hula-twist» механізму цис-транс ізомеризації, який полягає в одночасному повороті на 90⁰ сусідніх одинарної С₅-С₆ і подвійної С₆=С₇ зв'язків і «ковзного» руху двох частин молекули 7-ДГХ в площині триєнової системи. Як згадувалось в Розділі 1, такий механізм було запропоновано [14] для цис-транс ізомеризації полієнів в умовах обмеженого об'єму.

Те, що ефективність цис-транс ізомеризації зростає при зменшенні кроку холестеричної спіралі, є наслідком пригнічення торсійних коливань молекули превітаміну D за рахунок зростання в'язкості РК, оскільки саме такі коливання являють собою основний канал безвипромінювальної релаксації. Таким чином, на відміну від адсорбції, зсув конформаційної рівноваги превітаміну в РК матриці не приводить до пригнічення його цис-транс ізомеризації.

Шостий розділ присвячено дослідженню шляхів оптимізації лампової технології фотосинтезу превітаміну D, який є класичним прикладом реалізації у виробництві природного біологічно важливого фотопроцесу. Основним завданням на стадії фотосинтезу є досягнення максимального виходу превітаміну D за високого ступеню конверсії провітаміну D та відсутності побічних фотопродуктів. Але накопиченню превітаміну D перешкоджають його побічні фотоперетворення, і на практиці це змушує припиняти фотореакцію на ранній стадії опромінення лише при 20-30-відсотковій конверсії провітаміну D і відокремлювати неперетворений провітамін D перекристалізацією для повторного УФ опромінення, що призводить до його втрат і подорожчання виробництва.

Виходячи із співвідношення коефіцієнтів поглинання Рrо і Рre (рис. 4), очевидно, що оптимальним для підвищення виходу превітаміну D є опромінення на довжині хвилі 295 нм. Завжди вважалось, що лише короткохвильове випромінювання в області 254 нм є несприятливим, бо підвищує вихід тахістерину. Цим пояснюється застосування люмінесцентних (ерітемних) ламп із випромінюванням в діапазоні 280-350 нм.

Нами досліджено роль каналу необоротних фотореакцій Рre > Тох при опроміненні провітаміну D ерітемною лампою в умовах існування так званого «film» - ефекту, який виникає внаслідок неоднорідності опромінення по товщині шару розчину з високою концентрацією 7-ДГХ. Чисельними розрахунками доведено, що в цьому випадку значно підвищується незворотна фотодеградація фотоізомерної суміші, і важливого значення набуває ефективне перемішування розчину [18*].

Крім того, експериментально підтверджено [20*], що при опроміненні оптично товстого шару розчину навіть при ефективному перемішуванні необоротні фотореакції призводять до значної зміни кінетики фотореакції у порівнянні з оптично тонким шаром, коли довгохвильове випромінювання ( > 300 нм) майже не поглинається розчином. Видно, що максимальна концентрація Рre помітно знижена і, що особливо важливо, досягається при значно меншій конверсії вихідного Pro. Видно також, що подальше опромінення не приводить до зростання виходу Рre, а тільки сприяє фотодеградації фотоізомерної суміші внаслідок активного накопичення Тох.

Таким чином, доведено, що кінетика фотореакції в оптично товстих шарах суттєво залежить від умов опромінення і тільки в оптично тонкому шарі існує однозначний зв'язок між спектральним складом ініціюючого випромінювання і кінетикою фотореакції, який дозволяє за зміною ступеню конверсії вихідного Pro достовірно прогнозувати концентрації компонент фотоізомерної суміші. Крім того, з урахуванням необоротного каналу Рre > Тох [19*] доведено відсутність реальних переваг методу двоступеневого опромінення провітаміну D, запропонованого в роботах [4,5].

...