Моделювання і прогнозування дії нюхового нанобіосенсора на основі молекули білка типу GPCR

Размещено на http://www.allbest.ru/

Харківський національний університет імені В. Н. Каразіна

УДК 577.322:004.942

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата фізико-математичних наук

Моделювання і прогнозування дії нюхового нанобіосенсора на основі молекули білка типу GPCR

03.00.02 - біофізика

Акімов Володимир Ігорович

Харків - 2011

Дисертацією є рукопис одномолекулярний нюховий нанобіосенсорний

Робота виконана в Інституті радіофізики і електроніки імені О. Я. Усикова НАН України.

Науковий керівник доктор фізико-математичних наук, старший науковий співробітник Шестопалова Ганна Вікторівна, Інститут радіофізики і електроніки імені О. Я. Усикова НАН України, завідувач відділу біологічної фізики (м. Харків).

Офіційні опоненти:

доктор фізико-математичних наук, професор Харкянен Валерій Миколайович, Інститут фізики НАН України, завідувач відділу фізики біологічних систем (м. Київ);

доктор біологічних наук, професор Перський Євген Ефроїмович, Харківський національний університет імені В. Н. Каразіна, завідувач кафедри біохімії (м. Харків).

Захист відбудеться «17» червня 2011 року о 1500 годині на засіданні
спеціалізованої вченої ради Д 64.051.13 Харківського національного університету імені В. Н. Каразіна за адресою: 61022, м. Харків, пл. Свободи, 4, ауд. VII-4.

З дисертацією можна ознайомитись у Центральній науковій бібліотеці Харківського національного університету імені В. Н. Каразіна за адресою: 61022, м. Харків, пл. Свободи, 4.

Автореферат розісланий « » травня 2011 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради В. П. Берест

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Сьогодні для двох із трьох дистантних (тобто діючих на значній відстані) людських чуттів, а саме зору і слуху, створені технічні засоби реєстрації та відтворення сигналів. Життя сучасного людства не мислиме без широкого використання аудіо- і відеозаписувальної, передавальної та відтворювальної техніки. І тільки для нюху технічні аналоги залишаються вкрай недосконалими в порівнянні з природним біологічним нюховим механізмом. Більш від того, зараз не існує хоч скільки-небудь загальноприйнятої теоретичної системи класифікації та вимірювання запахів. Особливий інтерес сучасної науки до нюхового механізму ссавців підтвердило присудження Нобелівської премії у фізіології та медицині за 2004 р. першовідкривачам сімейства білків - нюхових рецепторів Лінді Бак і Ричардові Акселю. Крім цього, електронні детектори запахів можуть використовуватися (і частково використовуються) для вирішення ряду прикладних задач, у таких галузях, як медицина (діагностика хвороб), харчова промисловість (контроль за якістю продукції), системи безпеки (детектори присутності й ідентифікатори особистості), протипожежна охорона (детектори диму), гірська і нафтопереробна промисловість (датчики газу), контроль навколишнього середовища (спостереження за складом атмосфери) тощо.

Крім того, з часів першого одномолекулярного експерименту на біомолекулах, виконаного в 1970 році, інтерес до створення гібридних молекулярно-електронних пристроїв зростає стабільно й стрімко. Причинами цього є, по-перше, те, що сучасна кремнієва електроніка досягає межі мініатюризації, і для виведення її на якісно новий рівень розвитку (створення так званого квантового комп'ютера), необхідна нова фізична елементна база з елементами розміру порядку нанометра, тобто розміру молекули. Як можливу кандидатуру для цього розглядають органічні матеріали. Крім того, існує велика кількість часткових технологічних застосувань гібридних пристроїв. Тому останнім часом цій темі присвячується велика кількість експериментальних і теоретичних робіт.

Задача вивчення й контролю структурних перетворень білкових молекул дотепер залишається каменем спотикання сучасної біофізики. Винятковий інтерес до цієї проблеми визначається тим, що саме поточна просторова укладка молекули білка визначає його фізичні і хімічні властивості, а до розуміння й уміння маніпулювати ними зводиться велика частина задач сучасних мікробіології та медицини. Крім цього, задача контролю механізму структурних перетворень білкових молекул є модельною для створення ще багато в чому гіпотетичних молекулярних машин, чи нанороботів, тому що білки - найбільш близькі до цього поняття природні об'єкти. Більш від того, саме білкові структури можуть стати двигуном таких наномашин.

Білки сімейства GPCR - велике сімейство білків, основна функція яких полягає в передачі будь-якого зовнішнього сигналу через мембрану всередину клітини. До цього сімейства, зокрема, входять нюхові й зорові рецептори. Крім того, до сімейства GPCR входять різні хеморецептори, які беруть участь у хімічній регуляції роботи організму, що, через це, є найбільш розповсюдженою мішенню (target) для однієї з найбільш ефективних груп засобів проектування ліків - групи методів, заснованих на структурній інформації (SBDD, Structure-Based Drug Design).

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконувалася у відповідності з планами науково-дослідних робіт відділу біологічної фізики Інституту радіофізики і електроніки ім. О.Я.Усикова НАН України у межах держбюджетної теми "Дослідження взаємодії електромагнітних та акустичних полів, а також електронних пучків з твердотільними та біологічними структурами" (№ держ. реєстрації 0102U003139, 2002-2006); у рамках проекту Європейского союзу «Single PrOTein NanObioSEnsor griD array IST-2001-38899-SPOT-NOSED».

Мета і завдання дослідження. Основною метою роботи було створення теоретичної бази для прогнозування й параметризації дії одномолекулярного нюхового нанобіосенсора. У роботі були поставлені та вирішені такі завдання:

розробити теоретичний апарат для моделювання структурного переходу білка - нюхового рецептора між основним і сенсорно-збудженим станами;

на підставі розробленої моделі розрахувати сенсорний відгук молекули в термінах вимірюваних фізичних величин для декількох білків-рецепторів типу GPCR, у тому числі нюхових рецепторів ссавців;

оцінити надійність і стійкість результатів шляхом варіювання різних параметрів моделі;

використовуючи розроблену методику, дослідити процес структурних змін молекул білків-рецепторів у динаміці.

Об'єкт дослідження - молекули трансмембранних білків типу GPCR, а саме, нюхових рецепторів пацюка I7, людини OR 17-40 і коров'ячого (бичачого) зорового рецептора родопсину як найбільш дослідженого гомолога нюхових рецепторів ссавців.

Предмет дослідження - відгук молекул білків типу GPCR на структурні зміни, пов'язані із сенсорною дією.

Методи дослідження - числові методи, зокрема оригинальний метод мережі елементарних імпедансів, стандартний метод гомологічного моделювання третинної структури білкових молекул, адаптований перколяційний метод у сполученні з розробленими моделями гармонійних коливань і принципом Монте-Карло для визначення рівня шуму нерегулярної мережі, розроблені лінійні моделі переходу молекули білка між структурними станами.

Наукова новизна одержаних результатів

1. За допомогою розробленого здобувачем числового методу отримано повну третинну (просторову) структуру основного й сенсорно-збудженого станів коров'ячого родопсину з наявних фрагментів. Методом гомологічного моделювання на підставі даних для коров'ячого родопсину отримано третинну структуру двох станів нюхових рецепторів пацюка I7 і людини OR 17-40.

2. У термінах теорії графів проаналізовано нерегулярні мережі, що відповідають білкам типу GPCR.

3. Запропоновано оригінальний метод (метод нерегулярної мережі імпедансів) для прогнозування електричного відгуку молекули білка в складі двохтермінального пристрою.

4. Уперше спрогнозовано зміну повного імпедансу молекули трьох білків типу GPCR при переході з основного в сенсорно-збуджений стан. Показано, що зміна стійка до параметрів моделі, але відрізняється для різних білків і складає близько 10 %-50 % вихідної величини, тобто є потенційно детектованою.

5. Запропоновано дві прості моделі процесу переходу молекули білка між структурними станами, які застосовані до трьох білків типу GPCR.

6. Нерегулярні мережі, які відповідають білкам типу GPCR, досліджені методами перколяційної теорії (теорії протікання).

7. На основі запропонованих моделей гармонійних коливань змодельовано шум (варіація модуля імпедансу). Знайдено універсальний закон залежності варіації від амплітуди коливань.

Практичне значення одержаних результатів. Кінцевою метою досліджень є створення повноцінного нюхового детектора. Прикладне застосування детекторів запахів є дуже широким. У короткостроковій перспективі це - задачі пошуку наркотичних сполук і вибухівки, моніторинг якості (відповідності нормам) харчових і парфумних товарів, діагностика хвороб, створення детекторів присутності й пожежної небезпеки, пристроїв ідентифікації особистості тощо. У довгостроковій же перспективі це - створення повноцінного технічного циклу розпізнавання - оцифровування - записування - передавання - відтворення всієї інформації, яку здатний сприйняти людський ніс, що означає інформатизацію однієї з найбільш важливих (якщо не найважливішої) ще не інформатизованої галузі людського життя й сприйняття.

Розроблені моделі можуть бути застосовані для теоретичних досліджень конформаційних змін будь-яких білкових молекул у складі одномолекулярного пристрою.

Особистий внесок здобувача. В опублікованих із співавторами наукових працях особистий внесок здобувача полягає в такому:

у роботах [11; 12] - розроблення базової моделі, розрахунок третинних структур білкових молекул і участь у обговоренні результатів; у роботах [7-10; 13; 15; 16] - розроблення математичної моделі, реалізація числових методів, участь у обговоренні результатів; у роботах [1-6; 14] - участь у розробленні математичної моделі, написанні теоретичної частини й обговоренні результатів експериментів.

Апробація результатів дисертації. . Матеріали дисертаційної роботи були представлені та доповідались на Bionanotechnology: EuroConference on Biomolecular Devices (Гренада, Іспанія, липень 2003 р.), конференції ICTP-INFM «New Frontiers in Nanobiotechnology» (Трієст, Італія, липень 2003 р.), 2th International Symposium on Fluctuations and Noise (Маспаломас, Іспанія, травень 2004 р.), 22nd International Conference on Statistical Physics (Бангалор, Індія, липень 2004 р.), EuroNanoForum 2005 - Nanotechnology and the Health of the EU Citizen in 2020 (Единбург, Великобританія, вересень 2005 р.), 18th International Conference on Noise and Fluctuations - ICNF 2005 (Саламанка, Іспанія, 2005 р.), Unsolved Problems of Noise UPON-4 (Галіполі, Італія, листопад 2005 р.), Spanish Conference on Electron Devices (Тарагона, Іспанія, лютий 2005 р.), міжнародній конференції 14th International Conference on Nonequilibrium Carrier Dynamics in Semiconductors HCIS-14 (Чикаго, США, липень 2005 р.), 3-й міжнародній науково-технічній конференції «Сенсорна електроніка та мікросистемні технології» СЕМСТ-3 (Україна, Одеса, червень 2008 р.).

Публікації. Основні матеріали дисертації опубліковані в 16 наукових працях, у тому числі в 1 збірнику наукових праць, 8 статтях у наукових фахових журналах і в 7 тезах доповідей на міжнародних і національних конференціях.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається зі вступу, п'яти основних розділів, висновків і списку використаних джерел. Загальний обсяг дисертації складає 134 сторінки. Дисертація містить 40 рисунків (з них один займає повну сторінку) та 5 таблиць. Список використаних джерел (217 найменувань) займає 23 сторінки.

Основний зміст роботи

У вступі обґрунтовано актуальність обраної теми, сформульовано мету досліджень і завдання, які необхідно вирішити для її досягнення, визначено наукову новизну та практичну цінність отриманих результатів, наведено загальну структуру дисертаційної роботи.

Розділ 1 присвячений аналізу літературних даних, які відображають сучасні уявлення про таке. (1) Існуючі нюхові сенсори. Висновок: створення універсального нюхового сенсора, який найбільш точно відповідав би людському нюху, це - надзвичайно актуальна задача. Найбільш перспективний, якщо не єдиний, шлях для її вирішення - адаптація існуючих біологічних засобів до сучасної техніки. (2) Механізм нюху у ссавців. Висновок: нюх ссавців у наш час у цілому є найбільш досконалим
і точним засобом розпізнавання летких хімічних речовин, хоча і не абсолютно універсальним. (3) Теорії відрізнення запахів. Висновок: сьогодні не існує теорії, яка достовірно описує фізичний механізм взаємодії нюхового рецептора й молекули пахучої речовини та дозволяє робити достовірні прогнози запаху на основі довільної хімічної структури одоранту. (4) Нюхові рецептори, сімейство білкових рецепторів GPCR і родопсин. Висновки: ключовим процесом сенсорної дії нюху ссавців на молекулярному рівні є структурна трансформація білка нюхового рецептора з основного в найбільш стабільний сенсорно-збуджений мета-II стан; властивості нюхових рецепторів варто вивчати й моделювати, використовуючи дані коров'ячого родопсину - їх найбільш вивченого аналога. (5) Молекулярні пристрої та наноконтакти. Висновки: у цілому на сьогодні не існує надійної та загальновизнаної методики зв'язування органічної молекули з механічними контактами, хоча ця область знань і умінь бурхливо розвивається, і одержання необхідної технології варто очікувати в доступному для огляду майбутньому. Таким чином, задача створення нанорозмірного пристрою для вимірювання електричного відгуку однієї молекули на її структурні зміни з погляду сучасної технології стане принципово реалізованою. (6) Моделювання процесів у біомолекулах. Висновки: є виправданим пошук простих, структурно орієнтованих методів, які дозволяють вичленувати зміни, що відбуваються в молекулі GPCR при сенсорній активації в термінах вимірюваних величин. (7) Теорія протікання. Висновки: теорія протікання (у застосуванні до моделювання електричного й діелектричного пробою), по-перше, надає інструмент для моделювання протікання струму на основі ймовірнісних процесів, нехтуючи мікроскопічним описом середовища й розрахунками з перших принципів, і дозволяє описати широкий клас об'єктів і процесів на основі загальних закономірностей. По-друге, вона дає можливість прив'язати електричний відгук розглянутої системи до її розмірності й внутрішньої топології.

Загальні висновки. Кінцева мета - створення нюхового сенсора. Для збереження адекватності сенсора людським чуттям варто інтегрувати якусь частину існуючих біологічних засобів у сучасну техніку. Ключовою частиною нюхового механізму ссавців є нюхові білки-рецептори. Технології створення одномолекулярних пристроїв, можливо, стануть доступними в недалекому майбутньому. Для створення сприймального елемента нюхового сенсора можна взяти такий білок, помістити між контактами молекулярного пристрою й фіксувати зміну електричного сигналу при зміні конформації білка в результаті захоплення молекули одоранту. Теорія, яка описує таку зміну сигналу, повинна ґрунтуватися на вичленовуванні змін структурних особливостей конформацій рецепторів. Розрахунок таких змін із перших принципів є вкрай складним через електронну складність об'єкта й неприпустимість спрощень, які нехтують особливостями структури. Найбільш перспективною для вирішення задачі бачиться розробка нового структурно орієнтованого «грубозернистого» методу, близького за ідеологією до апарату, який використовується в теорії протікання, а також методу пружних мереж. При роботі з фактичними структурами нюхових рецепторів варто використовувати як відправну й опорну точку найбільш досліджений їх гомолог - коров'ячий родопсин.

У розділі 2 розглянуто методи й об'єкти дослідження. Обґрунтовано вибір вихідних третинних структур родопсину для основного й мета-II станів, PDB ID 1JFP, 1F88 (A), 1LN6. Розроблено й описано процедуру одержання робочих структур родопсину, яка включає зшивання фрагментів і суміщення орієнтації різних структур за допомогою числової мінімізації середнього зсуву положення атомів альфа-вуглецю сумісних амінокислотних залишків. Описано процедуру одержання робочих структур нюхових рецепторів людини (OR 17-40) і пацюка (I7) з їх первинної структури й третинних структур родопсину за допомогою гомологічного моделювання з використанням стандартної програми MODELLER версії 8.1.

Розроблено і обґрунтовано оригінальний метод нерегулярних мереж імпедансів для моделювання електричного відгуку білкових молекул у складі двохтермінального пристрою, зображеного на рис. 1.

Молекула моделюється як еквівалентне складне електричне коло, де вузлами є атоми альфа-вуглецю, які можуть бути з'єднані між собою елементами, що складаються з ємності й опору, підключеними паралельно (опір описує перенос заряду, а ємність - здатність амінокислот до поляризації).

Як показано на рис. 2, зв'язок є, якщо вузли знаходяться на відстані не більшій ніж 2Ra, де Ra - радіус взаємодії, параметр моделі. Найбільш реалістичним нам вбачається Ra 5Е, що відповідає характеристичному радіусу Ван дер Ваальса для амінокислот. Повний імпеданс мережі обчислюється розв'язанням системи рівнянь Кірхгофа. Для кожного вузла складаються рівняння суми струмів, що виражаються через потенціали вузлів і імпеданси. Отримуємо систему лінійних алгебраїчних рівнянь з розмірністю, яка відповідає числу амінокислот у білку та вирішується методом Гауса. Наведено деякі результати для модельної молекули коров'ячого родопсину в основному стані, що характеризують і ілюструють модель у цілому.

Структури досліджуваних молекул охарактеризовані в термінах теорії графів. Проаналізовано розподіли ступенів графа й кількість зв'язків у залежності від радіусу взаємодії. Побудовано й проаналізовано таблиці зв'язності кластерів структури, які відповідають функціонально різним відрізкам молекули рецептора (трансмембранні домени, цикли й термінали) для структур основного й сенсорно-збудженого станів родопсину. Зроблено висновок про те, що характер і складність досліджуваних структур, отриманих з молекул рецепторів типу GPCR, не дає можливостей для прогнозування особливостей зміни електричного відгуку структур таких молекул при переході в сенсорно-збуджені конформації, на підставі загальних міркувань і умоглядного аналізу. Очевидно, для ефективного прогнозу дії молекулярного сенсорного пристрою потрібне числове моделювання.

Програмування числових методів здійснювалося мовою FORTRAN 77, виконання розроблених програм проводилося на платформі PC, середовище розробки та компілятор Microsoft Visual Studio 6.0, а також на лінукс-кластері типу Beowulf, компілятор, убудований у операційну систему.

У розділі 3 наведено результати прогнозування зміни відгуку молекулярного пристрою при сенсорній активації.

По-перше, описано методику розрахунку об'єму молекули, проведені розрахунки і порівняння об'ємів молекули родопсину в основному й фотозбудженому станах з метою оцінювання можливості використання зміни цієї величини для створення сенсора. Виявилося, що при переході з основного до мета-II-стану об'єм молекули родопсину змінюється на величину близько 1 %. Така зміна є безперспективною з погляду використання в біосенсорі, тому що її важко зафіксувати апаратно.

Далі наведено й аналізуються результати розрахунку (відповідно до методики, описаної в другому розділі) зміни повного імпедансу білків типу GPCR у складі двохтермінального пристрою при переході з основного до сенсорно-збудженого стану. Моделювання здійснювалося для трьох білків, на основі їх даних у форматі PDB: коров'ячого родопсину (як модель), щурячого нюхового рецептора I7 і людського нюхового рецептора OR 17-40. Вхідні дані для обох станів були сконструйовані, як це описано й обґрунтовано у розділі 2: для родопсину - зшиті з наявних фрагментів, а для нюхових рецепторів - змодельовані на основі їх відомої первинної структури й третинної структури родопсину як гомологу.

Відповідно до розрахунків при сенсорній активації, які представлені на рис. 3, а також вважаючи найбільш імовірною область Ra 5Е, для родопсину очікується збільшення модуля імпедансу на 20-30 %, для I7 - зменшення на 50-60 %, для OR 17-40 - збільшення на 10-20 %. Усі ці зміни потенційно детектуються технічними вимірювальними засобами.

Отже, пристрій, який описано в розділі 2, є потенційно придатним для створення сенсора. По-друге, незважаючи на те, що третинні структури молекул нюхових рецепторів отримані за допомогою гомологічного моделювання зі структури коров'ячого родопсину, вплив їх індивідуальних особливостей на електричний відгук не було нівельовано. Це може непрямо підтверджувати адекватність процедури гомологічного моделювання. По-третє, поводження електричного відгуку різних рецепторів GPCR може бути різним, а отже, при створенні комплексного сенсора, що складається з декількох різних видів рецепторів, може знадобитися індивідуальне калібрування для кожного рецептора.

Далі в розділі проведено числове оцінювання можливої помилки конфігурування контактів з метою перевірки адекватності прийнятого припущення щодо еквівалентності контактам першої й останньої амінокислот. Варіації конфігурування контактів у розумних межах показали припустиму стійкість результату, тому всі подальші розрахунки для простоти проводилися для двохконтактної конфігурації.

Крім того, у розділі описано спробу моделювання зміни електричного відгуку молекулярного пристрою в динаміці. Для цього запропоновано дві найбільш прості моделі, які описують динаміку структурних змін при переході молекули типу GPCR від основного до сенсорно-збудженого стану, а саме: модель координат і модель відстаней. За результатами числового моделювання й аналізу зроблено висновок про те, що для моделювання динаміки електричного відгуку в процесі сенсорної дії прості моделі не достатні. Для одержання проміжних конфігурацій варто використовувати спеціальні методи, наприклад процедуру молекулярної динаміки чи метод пружних мереж у залежності від умов конкретної задачі.

Також у розділі коротко описано невирішені проблеми й задачі як теоретичного, так і експериментального плану, що виникають при створенні детектора запахів на основі молекулярного пристрою.

У цілому зміна електричного відгуку рецепторів у результаті сенсорної активації, яку отримано в рамках оригінального підходу мережі імпедансів, запропонованого автором у розділі 2, цілком підходить для того, щоб будувати сенсор на основі вимірювання цієї величини. Результат розрізняється для різних рецепторів, але досить стійкий до таких параметрів, як радіус взаємодії амінокислот, характер їх елементарної взаємодії й неточності в конфігуруванні контактів. Для моделювання зміни відгуку в динаміці потрібно комбінувати запропонований метод зі спеціальними методами одержання проміжних структур. Однак для створення нюхового нанобіосенсора варто ще вирішити низку проблем, головним чином технологічного плану.

Розділ 4 присвячено аналізу доцільності традиційних засобів і методів теорії протікання на предмет застосування до розв'язуваної в роботі задачі.

Теорія протікання (перколяційна теорія) звичайно застосовується для моделювання перехідних процесів у суцільних середовищах. Типові обчислювальні задачі, які розв'язуються нею, полягають у розрахунку характеристик регулярної (періодично упорядкованої) теоретично нескінченної структури. При цьому потрібно позбавлятися від ефектів, пов'язаних із обмеженим розміром моделі, які є неминучими при числовому моделюванні.

Задачі моделювання в нашому випадку багато в чому протилежні класичним перколяційним задачам. Потрібно розпізнати особливості даної кінцевої структури, щоб знайти засіб експериментально відрізнити її від іншої, точно такої ж за розмірами, але іншої топології, яка відрізняється в подробицях. При цьому найзагальніше, характерне для структур такого типу взагалі, варто винести за дужки.

Проведено моделювання режиму пробою для нерегулярної випадкової мережі родопсину. Отримано статистичний розподіл перколяційного порогу. Частка обірваних зв'язків цієї кінцевої структури характеризується не стільки визначеним числом (як для теоретично нескінченних регулярних випадкових мереж), скільки розподілом, що може розглядатися як характеристика структури, однак навряд чи підходить для визначення індивідуальних особливостей подібних структур через нестійкість і складність її прямої інтерпретації через експериментально вимірювані величини.

Проведено моделювання динамічного стаціонарного стану для дослідження закономірностей шуму, виробленого структурою, що коливається біля деякого в цілому стабільного стану. За результатами моделювання одна з найбільш істотних відмінностей родопсиноподібних мереж від регулярних полягає в наявності вузьких місць, розрив яких істотно впливає на шум, додаючи до нього великі телеграфні складові. Логічно припустити, що такими вузькими місцями, швидше за все, є зв'язки, що з'єднують сусідні вузли в поліпептидний ланцюг, відстань між якими менше, ніж між будь-якими іншими, і розрив яких у реальному родопсині практично виключений. Отже, будь-які особливості, знайдені з опорою на ці вузькі місця, не будуть відповідати якій-небудь реальній фізичній властивості білкових молекул.

У цілому дослідження структур молекул GPCR традиційними методами перколяційної теорії приводять до результатів, які можна передбачити із загальних розумінь із урахуванням насиченості, нерегулярності й розмірної обмеженості структур.

У розділі 5 у рамках методу мереж елементарних імпедансів пропонуються й розглядаються дві взаємодоповнюючі моделі внутрішніх флуктуацій повного мережного імпедансу, які зв'язані з коливаннями елементарних складових, а також з топологією структури. Джерело коливань значень елементарних імпедансів описується осциляціями довжин зв'язків (модель зв'язків, що осцилюють - МЗО) чи положень вузлів (модель вузлів, що осцилюють - МВО) біля фіксованого положення. Моделі застосовані до мережі, яка відповідає молекулі родопсину, поміщеній між двома омічними контактами. Досліджується поводження ключових вихідних даних (число зв'язків, імпеданс і т. д.) у залежності від параметрів моделі. Основна мета - спробувати виділити індивідуальні властивості молекули конкретного білка (чи частки варіанта конфігурації такої молекули) на підставі запропонованих моделей, а також знайти засоби калібрування параметрів моделі.

Процедура накопичення статистики по флуктуаціях включає ітеративне повторення таких кроків: (1) незалежне стохастичне визначення відхилення положення кожного вузла (для МКВ) чи відстані між кожною парою вузлів (для МКЗ) від рівноважного положення відповідно до ймовірностей, обумовлених законом класичного гармонійного осцилятора й обраною амплітудою коливань; (2) складання нової структури й побудова еквівалентної мережі за отриманими даними; (3) визначення загального імпедансу структури.

Розраховано й проаналізовано усереднені за всіма випадково вибраними станами величини числа зв'язків і повного імпедансу структури в залежності від амплітуди коливань (температурні залежності) і радіусу взаємодії для різних моделей коливань і елементарного імпедансу.

Отримано й проаналізовано залежності дисперсії флуктуацій мережного імпедансу (повного імпедансу структури) від амплітуди гармонійних коливань вузлів і радіусу взаємодії для двох моделей флуктуацій і двох моделей елементарного імпедансу (рис. 4).

На залежностях дисперсії імпедансу мережі від амплітуди гармонійних коливань вузлів і відстаней (температурних залежностях) виявлено універсальний закон для гладкої моделі елементарного імпедансу, який може бути цікавим з математичної точки зору.

Зроблено висновки про те, що (1) температурна залежність теплового шуму, який генерується молекулярним пристроєм, може використовуватися для одержання інформації щодо стану молекули, хоча вона й менш приваблива з цього погляду, ніж вимірювання імпедансу; (2) виявлено універсальні закони залежності відносної дисперсії імпедансу від амплітуди коливань, які можуть бути предметом подальших досліджень.

Індивідуальні особливості конкретної структури, які дозволяють розрізняти різні молекули чи стани однієї молекули, залежать від моделі елементарного імпедансу. Залежності дисперсії імпедансу демонструють подібне поводження для різних флуктуаційних моделей, що говорить про стійкість результату до типу флуктуаційної моделі.

Висновки

У дисертаційній роботі було вирішено проблему побудови математичних моделей грубозернистого типу для опису перенесення заряду в молекулах білків у складі двохтермінального пристрою, що дозволило спрогнозувати електричний відгук на зміну конформації, яка відповідає сенсорній дії рецепторів типу GPCR, включаючи нюхові рецептори ссавців і коров'ячий родопсин. Це необхідно для створення нюхового нанобіосенсора та для проведення досліджень перехідних процесів і коливальних явищ у молекулах білків. Запропонований метод може бути використано для реєстрації зміни конформацій білкових молекул.

1. Показано, що моделювання роботи нюхового сенсора на основі молекули білка-рецептора зводиться до моделювання різниці електричного відгуку різних структурних станів такої молекули - основного й сенсорно-збудженого.

2. Розвинуто оригінальний числовий метод нерегулярних мереж імпедансів для моделювання електричних властивостей білкових молекул. Метод ґрунтується на ідеї структурної подібності об'єкта моделювання та моделі і дозволяє враховувати структурні розходження різних станів молекули. У той же час метод не вимагає позамежних обчислювальних потужностей, що характерно для методик, які виходять з перших принципів, і цілком може бути реалізований практично на базі сучасної обчислювальної техніки.

3. Проведено розрахунки на основі розробленого методу, які передбачають цілком придатну до вимірювань зміну модуля повного імпедансу розглянутих білкових молекул при переході з основного до збудженого стану: коров'ячий родопсин - збільшення на 20-30 % (у залежності від параметрів), людський нюховий рецептор OR 17-40 - збільшення на 10 %-20 %, щурячий нюховий рецептор I7 - зменшення на 40-60 %. На цій основі може бути створено біосенсор. Результат задовільно стійкий до зміни параметрів і конфігурації контактів. У той же час відмінність результатів для різних молекул свідчить про те, що при гомологічному моделюванні не були нівельовані індивідуальні особливості різних рецепторів.

4. Розроблено оригінальні прості моделі динаміки переходу між двома структурними станами молекули білка. Аналіз результатів моделювання показує, що прогнозована динаміка відгуку в більшому ступені визначається особливостями моделі, ніж структури, а отже, для адекватного опису динаміки переходу потрібні більш складні моделі.

5. Внутрішні флуктуації білкових молекул на прикладі родопсину промодельовано з використанням перколяційної теорії. Аналіз результатів показує, що перколяційний поріг, який у силу обмеженості і нерегулярності структури варто описувати розподілом, а не одним числом, є характеристикою конкретної структури, але не може використовуватися при калібруванні сенсора, тому що є незвідним до легко вимірюваної фізичної величини. Моделювання динамічного процесу методами перколяційної теорії дає тривіальне поводження, що не дозволяє ідентифікувати характерні риси структури.

6. Розроблено оригінальні моделі гармонійних коливань для моделювання внутрішніх флуктуацій. Поводження залежностей варіації модуля повного імпедансу від амплітуди коливань істотно залежить від моделі елементарного імпедансу, що фактично є одним з калібрувальних параметрів моделі. Такі залежності можуть демонструвати особливості структури чи універсальний закон.

Список опублікованих праць за темою дисертації

1. Nanotechnologies for the Life Sciences, Vol. 4: Nanodevices for the Life Sciences. Ed. Challa S. S. R. Kumar / C. Pennetta, V. Akimov, E. Alfinito, L. Reggiani, T. Gorojankina, J. Minic, E. Pajot-Augy, M.A. Persuy, R. Salesse, I. Casuso, A. Errachid, G. Gomila, O. Ruiz, J. Samitier, Y. Hou, N. Jaffrezic, G. Ferrari, L. Fumagalli, M. Sampietro // Wiley. - 2006. - P. 221-244.

2. Immobilization of rhodopsin on a self-assembled multilayer and its specific detection by electrochemical impedance spectroscopy / Y. Hou, S. Helali, A. Zhang, N. Jaffrezic-Renault, C. Martelet, J. Minic, T. Gorojankina, M.-A. Persuy, E. Pajot-Augy, R. Salesse, F. Bessueille, J. Samitier, A. Errachid, V. Akimov, L. Reggiani, C. Pennetta, E. Alfinito // Biosensors and Bioelectronics. - 2006. - V. 21, N. 7. - P. 1393-1402.

3. Advances in the production, immobilization, and electrical characterization of olfactory receptors for olfactory nanobiosensor development / G. Gomila, I. Casuso, A. Errachid, O. Ruiz, E. Pajot, J. Minic, T. Gorojankina, M.A. Persuy, J. Aioun, R. Salesse, J. Bausells, G. Villanueva, G. Rius, Y. Hou, N. Jaffrezic, C. Pennetta, E. Alfinito, V. Akimov, L. Reggiani, G. Ferrari, L. Fumagalli, M. Sampietro, J. Samitier // Sensors and Actuators B. - 2006. - V. 116. - P. 66-71.

4. A novel detection strategy for odorant molecules based on controlled bioengineering of rat olfactory receptor I7 / Y. Hou, N. Jaffrezic-Renault, C. Martelet, A. Zhang, J. Minic-Vidic, T. Gorojankina, M.-A. Persuy, E. Pajot-Augy, R. Salesse, V. Akimov, L. Reggiani, C. Pennetta, E. Alfinito, O. Ruiz, G. Gomila, J. Samitier, A. Errachid // Biosensors & bioelectronics. - 2007. - V. 22, N. 7. - P. 1550-1555.

5. Nanoscale electrical conductivity of the purple membrane monolayer / I. Casuso, L. Fumagalli, J. Samitier, E. Padrґos, L. Reggiani, V. Akimov, G. Gomila // Phys. Rev. E. - 2007. - V. 76. - P. 041919

6. Electron transport through supported biomembranes at the nanoscale by conductive atomic force microscopy / I. Casuso, L. Fumagalli, J. Samitier, E. Padrґos, L. Reggiani, V. Akimov and G. Gomila // Nanotechnology. - 2007. - V. 18. - P. 465503.

7. Электрические свойства молекулы белка в составе двухтерминального устройства / В. И. Акимов, А. В. Шестопалова, В. Н. Тулупенко, E. Alfinito, C. Pennetta, L. Regiani // Біофізичний вісник ХНУ. - 2007. - 1 (18). - С. 26-30.

8. Nanobiosensors based on individual olfactory receptors / V. Akimov, E. Alfinito, J. Bausells, I. Benilova, I. Casuso Paramo, A. Errachid, G. Ferrari, L. Fumagalli, G. Gomila, J. Grosclaude, Y. Hou, N. Jaffrezic-Renault, C. Martelet, E. Pajot-Augy, C. Pennetta, M.-A. Persuy, M. Pla-Roca, L. Reggiani, S. Rodriguez-Segui, O. Ruiz, R. Salesse, J. Samitier, M. Sampietro, A.P. Soldatkin, J. Vidic and G. Villanueva // Analog Integrated Circuits and Signal Processing. - 2008. - V. 57. - N 3. - P. 197-203.

9. Способи моделювання флуктуацій молекули білка в рамках методу нерегулярної сітки імпедансів / В. І. Акімов, А. В. Шестопалова, В. М. Тулупенко, L. Reggiani // Український фізичний журнал. - 2008. - Т. 53. - № 6. - C. 596-602. (V. I. Akimov, A. V. Shestopalova, V. M. Tulupenko, L. Reggiani Simulation of protein molecule fluctuations by irregular impedance network method // Ukr. J. Phys. - 2008. - V. 53. - N 6. - P. 595-601.)

10. Fluctuations of Complex Networks: Electrical Properties of Single Protein nanodevices / C. Pennetta, V. Akimov, E. Alfinito, L. Reggiani G. Gomila // Proceedings of SPIE. - 2004. - V. 5472. - P. 172-182.

11. Modelization of Thermal Fluctuations in G Protein-Coupled Receptors / C. Pennetta, V. Akimov, E. Alfinito, L. Reggiani, G. Gomila, G. Ferrari, L. Fumagalli, M. Sampietro // AIP Conference Proceedings. - 2005. - V. 780. - P. 611-614.

12. Thermal Fluctuations of a GPCR: A two force constant model / E. Alfinito, V. Akimov, C. Pennetta, L. Reggiani and G. Gomila // AIP Conference Proceedings. - 2005. - V. 800. - P. 381-387.

13. Akimov V. Fluctuation Models Of Irregular Impedance Networks / V. Akimov, L. Reggiani // AIP Conference Proceedings. - 2005. - V. 800. - P. -414.

14. Development of an Artificial Nose Integrating NEMS and Biological Olfactory Receptors / G. Gomila, A. Errachid, F. Bessueille, O. Ruiz, I. Casuso, E. Pajot, J. Minic, T. Gorojankina, R. Salesse, J. G. Villanueva, J. Bausells, C. Pennetta, E. Alfinito, F. Della Sala, V. Akimov, L. Reggiani, Y. Hou, N. Jaffrezic, G. Ferrari, L. Fumagalli, M. Sampietro, J. Samitier // IEEE Proceedings. - 2005. - Spanish Conference on Electron Devices. - P. 529-532.

15. An Impedance Network Model for the Electrical Properties of a Single Protein Nanodevice / V. Akimov, E. Alfinito, C. Pennetta, L. Reggiani, J. Minic, T. Gorojankina, E. Pajot-Augy, R. Salesse // Springer Proceedings in Physics. - 2006. - V. 110. - P. 229-232.

16. Моделирование действия одномолекулярного белкового нанобиосенсора / В. И. Акимов, А. В. Шестопалова, В. Н. Тулупенко, L. Reggiani // 3-я міжнародна науково-технічна конференція «Сенсорна електроніка та мікросистемні технології» (СЕМСТ-3) : тези доповідей. - 2008. - С. 214.

Анотація

Акімов В. І. Моделювання і прогнозування дії нюхового нанобіосенсора на основі молекул білка типу GPCR. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата фізико-математичних наук за спеціальністю 03.00.02 - біофізика. - Харківський національний університет імені В. Н. Каразіна, Харків, 2011.

Досліджено електричний відгук на сенсорну дію молекули білка-рецептора типу GPCR у складі одномолекулярного біосенсора. Розроблено й обґрунтовано метод еквівалентних нерегулярних мереж імпедансів для моделювання впливу зміни конформацій на імпеданс молекули білка в складі двохтермінального пристрою. У рамках методу для двох нюхових рецепторів і родопсину при сенсорній активації спрогнозовано таку зміну сигналу, яку можливо детектувати, для чого отримано й охарактеризовано третинні структури нюхових рецепторів. Запропоновано й досліджено оригінальні прості моделі динаміки переходу молекули білка між конформаціями, які відповідають основному й збудженному станам. Отримано закономірності теплових флуктуацій сигналу нативної конформації молекули родопсину в рамках розробленого методу.

Ключові слова: нюхові рецептори, родопсин, GPCR, конформаційні переходи, сенсорна дія, нерегулярні мережі, метод еквівалентних кіл.

Аннотация

Акимов В. И. Моделирование и прогнозирование действия обонятельного нанобиосенсора на основе молекул белка типа GPCR. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук по специальности 03.00.02 - биофизика. - Харьковский национальный университет имени В. Н. Каразина, Харьков, 2011.

Исследован электрический отклик на сенсорное действие молекулы белка-рецептора типа GPCR в составе одномолекулярного биосенсора. Разработан и обоснован метод эквивалентных нерегулярных сетей импедансов для моделирования влияния изменения конформаций на импеданс молекулы белка в составе двухтерминального устройства. В рамках метода предсказано детектируемое изменение сигнала для двух обонятельных рецепторов и родопсина при сенсорной активации, для чего получены и охарактеризованы третичные структуры обонятельных рецепторов. Предложены и исследованы оригинальные простые модели динамики перехода молекулы белка между конформациями, которые соответствуют основному и возбужденному состояниям. Получены закономерности тепловых флуктуаций сигнала нативной конформации молекулы родопсина в рамках разработанного метода.

Ключевые слова: обонятельные рецепторы, родопсин, GPCR, конформационные переходы, сенсорное действие, нерегулярные сети, метод эквивалентных цепей.

Summary

Akimov V. I. Simulation and prediction of the sensor action of olfactory nanobiosensor based on the GPCR protein molecule. - Manuscript.

Thesis for a candidate degree by speciality 03.00.02 - biophysics. - V. N. Karazin Kharkiv National University, Kharkiv, 2011.

The main objective of this work is the development of the theoretical base for the prediction and parametrization of the one-molecule olfactory nanobiosensor action. The recepting part of the sensor consists basically of the two-terminal device with an olfactory receptor molecule put between two ohmic contacts. Olfactory receptors are proteins of G-protein coupled receptor (GPCR) family. Sensor action of the olfactory receptor proteins comprises capture of the odorant molecule and conformational transition from ground to activated state that starts the cascade of biochemical reactions.

Modelization of the olfactory sensor based on one protein-receptor molecule involves modelization of the difference of electric response of two conformations of molecule - ground and sensor-activated one.

Tertiary structures of two olfactory receptors for two distinct conformations are engineered by means of homology modelling on the base of bovine rhodopsin and characterized.

Equivalent irregular impedance network technique for the modelization of the influence of conformation change on the impedance of protein molecule within two-terminal device is developed and discussed in this work. The technique is based on the idea of structural homology of the model and modelization object and allows for structural peculiarities of the protein molecule's conformations. On the other hand the technique does not require overwhelming computational capacities, which is typical for techniques based on first principles; therefore it can be implemented on the base of contemporary computers.

Electric response to the sensor action of G-protein coupled receptor protein molecule within one-molecule biosensor is studied. A detectable change of signal for two olfactory receptors and rhodopsin with sensor activation is predicted within the framework of the proposed technique. When conformation of the receptor is changed from ground to sensor-activated one the full impedance of the device is predicted to change as follows: for bovine rhodopsin - increase by 20-30 % (depending on parameters); for human olfactory receptor OR 17-40 - increase by 10 %-20 %; for rat olfactory receptor I7 - decrease by 40-60 %. According to this prediction it is possible to develop an olfactory sensor based on such two-terminal device. The result is acceptably resistant to the variation of parameters and contact configuraton. On the other hand, different results for the different protein molecules shows that individual features of different receptors have not been lost after homology modelization procedure.

Simple models for the protein conformation transition dynamics are proposed and studied.

Internal fluctuations of protein molecules are modelized for the instance of the native conformation of the rhodopsin molecule using percolation theory apparatus. Results' analysis shows that percolation threshold (which should be described as a distribution rather than a number because of the finity and irregularity of the structure) can characterize the concrete structure in principle, but it is hardly usable for the sensor calibration, because it can not be expressed through a measurable physical quantity. Modelization of the dynamic process by means of percolation theory demonstrates trivial behavior that does not allow to identify characteristic features of the structure.

Original models of harmonic oscillations are developed to modelize internal fluctuations of protein molecules. Full impedance variation versus oscillations amplitude behavior depends essentially on the model of the elementary impedance, which is in fact one of the calibration parameters of the model. Depending on this parameter such graphs can demonstrate either structure peculiarities or universal law.

Keywords: olfactory receptors, rhodopsin, GPCR, conformational transitions, sensor action, irregular networks, equivalent cirquits technique.

Размещено на Allbest.ru