Залежність фізичних властивостей нуклеотидів і промоторів від їхніх функціональних і еволюційних характеристик

Размещено на http://www.allbest.ru/

ХАРКІВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

імені В.Н.КАРАЗІНА

УДК 577.32

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата фізико-математичних наук

Залежність фізичних властивостей нуклеотидів і промоторів від їхніх функціональних і еволюційних характеристик

03.00.02 - біофізика

Бережной Андрій Юрійович

Харків - 2011

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті високих енергій і ядерної фізики Національного наукового центру «Харківський фізико-технічний інститут» Національної академії наук України

Науковий керівник: доктор фізико-математичних наук, старший науковий співробітник, Дуплій Степан Анатолійович, Харківський національний університет імені В. Н. Каразіна, провідний науковий співробітник.

Офіційні опоненти:доктор фізико-математичних наук, професор Семенов Михайло Олексійович, Інститут радіофізики та електроніки ім.. О.Я.Усикова НАН України (м. Харків), старший науковий співробітник відділу біофізики;

кандидат фізико-математичних наук, старший науковий співробітник Самійленко Світлана Панасівна, Інститут молекулярної біології і генетики НАН України (м. Київ), провідний науковий співробітник відділу молекулярної та квантової біофізики.

Захист відбудеться « 8 » квітня 2011 р. о 15⁰⁰ годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.051.13 Харківського національного університету ім. В. Н. Каразіна (61077, м. Харків, площа Свободи 4, ауд. 7-4).

З дисертацією можна ознайомитись у Центральній науковій бібліотеці Харківського національного університету ім. В. Н. Каразіна за адресою:

61077, м. Харків, площа Свободи 4.

Автореферат розісланий « 23 » лютого 2011 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради_____________Берест В.П.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. У різних наукових центрах світу досліджуються фактори, що обумовлюють біологічну активність певних ділянок ДНК, зокрема, таких, до яких приєднується РНК-синтезуючий фермент. Ці ділянки ДНК, які називаються промоторами, відіграють важливу роль у процесах синтезу білка. Саме виявлення та дослідження взаємозв'язків між фізичними властивостями промоторів та їхньою біологічною активністю проводиться в дисертаційній роботі.

Особливості ділянок ДНК визначаються властивостями створюючих їх генетичних одиниць генної інформації - нуклеотидних триплетів (кодонів). Властивості кодонів, у свою чергу, визначаються властивостями нуклеотидів, які містяться в їхньому складі. Вивчення можливих залежностей фізичних властивостей нуклеотида від його положення в кодоні та його здатності однозначно визначати амінокислоту (ступеня детермінації) є важливим напрямком досліджень у сучасній біофізиці. Знання перелічених закономірностей і залежностей дає змогу зрозуміти енергетичні характеристики генетичного коду та зробити висновок про те, чи впливають та як впливають фізичні (енергетичні) властивості промоторів на їхню біологічну активність.

Вивчення фізичних характеристик нуклеотидів і промоторів потрібне для розуміння структури ДНК і впливу різних типів радіоактивного випромінювання на біологічні об'єкти та живі організми, розробки методів їхнього захисту від опромінення, чим і визначається актуальність проведених у дисертації досліджень. Дослідження нуклеотидів у кодонах є першою спробою, на основі якої можна розвинути подальші теоретичні уявлення про структуру ДНК.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дослідження, які являють собою основу дисертаційної роботи, важливі для прикладної ядерної фізики і проведені відповідно до державних науково-дослідних програм, які виконувалися в Інституті високих енергій і ядерної фізики ННЦ ХФТІ НАН України:

Програма проведення фундаментальних досліджень з атомної науки і техніки ННЦ ХФТІ до 2005 року, затвердженої розпорядженням Кабінету Міністрів України від 13.09.2001 р., № 421-р, № держреєстрації 0809UP0009 від 08.10.2001 р.

Державна програма фундаментальних і прикладних досліджень із проблем ядерних матеріалів, ядерних і радіаційних технологій у сфері розвитку галузей економіки на 2004 -2010 роки: проект X866, № держреєстрації 080999UP0009; К 102/05-U, № держреєстрації 080999UP0009.

Відомче замовлення НАН України на проведення наукових досліджень з атомної науки і техніки ННЦ ХФТІ на 2006-2010 роки, затвердженого Постановою Бюро Відділення ядерної фізики та енергетики НАН України від 13 червня 2005 року, протокол №7(16) §2, № держреєстрації 080906UP0010.

Договір №2 про науково дослідне співробітництво між відділом ядерної фізики Інституту фізики високих енергій та ядерної фізики ННЦ ХФТІ НАН України та кафедрою біологічної і медичної фізики Харківського національного університету ім. В.Н.Каразіна від 14.05.2009 р.

Мета і задачі дослідження. Об'єктами досліджування були нуклеотиди та промотори, які досліджувалися на предмет наявності взаємозв'язків між їхніми фізичними властивостями та функціональними і еволюційними характеристиками. Метою роботи було визначення та дослідження взаємозв'язків між фізичними властивостями нуклеотидів і їхнім положенням у кодоні та ступенем детермінації, а також між фізичними властивостями промоторів та їхньою біологічною активністю. Для досягнення цієї мети потрібно було розв'язати такі задачі:

1.Створення за допомогою програмного комплексу HYPERCHEM моделей нуклеотидних триплетів.

2.Розрахунки на основі цього ж програмного комплексу з використанням квантових методів визначення параметрів молекул AM1 і PM3 фізичних параметрів одного з нуклеотидів у кодоні в присутності двох інших нуклеотидів та, при необхідності, молекул води.

3.Створення та використання програм, які дають змогу проводити кластерний аналіз промоторів по їхнім структурно-енергетичним параметрам.

4.Аналіз на основі графічного подання залежностей показника біологічної активності промоторів від їхніх структурно-енергетичних параметрів. молекула нуклеотидний квантовий вода

Наукова новизна отриманих результатів.

1.Уперше за допомогою програмного комплексу HYPERCHEM проведені розрахунки фізичних параметрів нуклеотидів у кодоні з урахуванням впливу на них сусідніх нуклеотидів. Результати цих розрахунків довели, що дипольний момент практично не залежить від положення нуклеотида в кодоні та його ступеня детермінації, теплота утворення залежить тільки від положення нуклеотида в кодоні, а енергія найбільш стійкої конформації залежить як від положення нуклеотида в кодоні, так і від його ступеня детермінації.

2.Уперше за допомогою програмного комплексу HYPERCHEM проведені розрахунки фізичних параметрів нуклеотидів у кодоні, оточеному молекулами води. Здобуті результати довели, що характер залежностей фізичних параметрів нуклеотидів у цьому випадку є приблизно таким же самим, як тоді, коли кодон не перебуває у водяному розчині, але величини фізичних параметрів не збігаються з їхніми значеннями в згаданому раніше випадку.

3.Уперше розраховано розподіл енергії та кількість гуанін-цитозин нуклеотидних пар по всій довжині промотора, що допомогло переконатися в тому, що розподіл енергії по всій довжині промотора має екстремуми на позиціях -35, -10 і +7 стосовно точки ініціації транскрипції, і що цей результат не залежить від орієнтації промотора в геномі.

4.Уперше проведений кластерний аналіз промоторів по розподілу енергії зв'язку ниток ДНК в областях -55, -35, -10 і+7 нуклеотидних позицій стосовно точки старту транскрипції. Результати цього аналізу довели, що розподіл енергії в цих областях пов'язаний з функціональною активністю промотора, а залежність середньої сили промотора від його середньої енергії в кластері має принаймні один екстремум у випадках -55, -35 і +7 послідовностей, однак у випадку -10 послідовності ця залежність є монотонною.

Практичне значення отриманих результатів. Здобуті результати є важливими для розвитку теоретичних уявлень про нуклеотиди та кодони, для планування експериментальних робіт у цій області, для розвитку робіт з прикладної ядерної фізики з метою вивчення впливу радіоактивного випромінювання на біологічні об'єкти.

Особистий внесок здобувача. Здобувач приймав активну участь у постановці, розв'язуванні та аналізі досліджуваних задач, написанні наукових статей, а також створив програми і виконав усі числові розрахунки.

У роботах [1, 3] здобувач розробив моделі нуклеотидних триплетів і за допомогою програмного комплексу HYPERCHEM розрахував такі фізичні параметри нуклеотидів у триплетах: дипольний момент, теплота утворення та енергія найбільш стійкої конформації (мінімально можлива енергія) нуклеотида.

У роботі [2] проаналізував за допомогою графіків розподіл енергетичних і структурних параметрів промоторів по всій їхній довжині, провів кластерний аналіз промоторів по їхнім енергетичним параметрам.

У роботах [4, 5] склав програму для кластерного аналізу промоторів по їхнім енергетичним характеристикам, проаналізував графічні залежності показника біологічної активності промоторів від їхніх енергетичних характеристик; у роботі [5] здобув формули регресивних залежностей показника біологічної активності («сили») промотора від енергії взаємодії нуклеотидних пар у визначеній його області.

Апробація результатів дисертації. Основні результати дисертаційної роботи доповідалися на таких міжнародних конференціях та семінарах:

1. Міжнародна наукова конференція «Каразінські природознавчі студії», Харків, 2004.

2. 2^nd International Conference on Quantum Electrodynamics and Statistical Physics, Kharkov, 2006.

3.Харківський міський семінар з біофізики.

4.Семінар Інституту молекулярної біології і генетики НАН України.

Публікації. Основні результати дисертаційної роботи опубліковані в п'яти статтях у фахових наукових журналах (з яких три статті - у зарубіжних журналах) і в матеріалах двох міжнародних конференцій.

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота містить вступ, чотири розділи основного тексту, висновки та перелік використаних літературних джерел з 197 найменувань на 20 сторінках і додаток - усього 131 сторінка тексту. Дисертація містить 23 рисунки та 12 таблиць.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

У вступі обґрунтовується актуальність дисертаційної теми, сформульовані мета та задачі дослідження, наведені наукова новизна та практична цінність здобутих результатів, а також відомості про особистий внесок здобувача, апробацію результатів дисертації та публікаціях основного змісту дисертації.

Перший розділ містить огляд літератури, в якому є дані про методи дослідження фізичних та геометричних параметрів різних органічних молекул. Розглянуті результати розрахунків параметрів молекул напівемпіричними методами та методами ab initio. Проведено порівняння результатів розрахунків параметрів молекул різними методами. Зроблено аналіз результатів цього порівняння.

Наприкінці розділу сформульована постановка дисертаційної задачі.

Другий розділ присвячений обчислювальним методам, які застосовуються для розрахунків фізичних властивостей складних молекул, зокрема, біополімерів. Коротко наведено описи методів, які містяться в програмному комплексі «HYPERCHEM» та використовуються в дисертаційній роботі, а саме: методи AM1 (Austin Model 1) та PM3 (Parametric Method 3). Розглянуто математичну структуру цих методів, описані властивості доданків, які описують взаємодію атомних електронів та атомних ядер.

У третьому розділі наведені результати вивчення закономірностей взаємозв'язків функціональної активності промотора з його структурою та енергетичними властивостями.

Енергія промотора визначалась як сума енергій взаємодії всіх пар нуклеотидів у промоторі відносно кількості нуклеотидів. У роботі досліджувана саме енергія взаємодії нуклеотидних пар у дуплексі ДНК, тому що вивчалась здатності дуплексної ДНК до розплітання ланцюжків ДНК, яке потрібне для взаємодії ДНК з білками, що відтворюють процес транскрипції . Безумовно, взаємодії між сусідніми нуклеотидами також впливають на стабільність ДНК, але значно меншою мірою. Так, енергія стекінг взаємодії сусідніх пар ДНК становіть, наприклад ДG⁰₃₇(AA/TT) = -0.93 ккал/моль [1], що значно менше, ніж енергія водневих зв'язків між комплементарними нуклеотидами. Середня енергія взаємодії нуклео-тидів у AT-парі була прийнята рівною -29,33 кДж/моль, у GC-парі вона становила -70,35 кДж/моль. Для аналізу розподілу вмісту AT-пар та енергії взаємодії в промоторі використовувався метод «ковзного вікна». На ділянці довжиною 10 нуклеотидів (довжина вікна), яка міститься на початку промотора (початкова позиція вікна), окремо підсумовувався вміст AT-пар та енергія взаємодії нуклеотидів, після чого оцінювалися середні значення цих параметрів. На кожному наступному етапі аналізу вікно зсувалося на одну нуклеотидну пару стосовно його попередньої позиції.

Розраховані дані для енергії взаємодії пар основ нуклеотидів по довжині промотора для прямих і зворотних послідовностей наведені на рис. 1. Для цього дослідження були вибрані «сильні» промотори - ті, у яких сила мала величину, перевищуючу або рівну одиниці. Взагалі, сила промоторів була взята з інтернетовської бази даних, де вона визначалась як десятинний логарифм концентрації білка, синтезованого з гена, який регулюється певним промотором. Прямими послідовностями називалися ті послідовності, початок генів, які регулюються ними, був розміщений ближче до 3' кінця молекули ДНК, ніж кінець генів, а зворотними - ті, гени яких мали початок розташований ближче за кінець до 5' кінця молекули ДНК. Оскільки орієнтація гена не впливає на його функції, розподіл послідовностей на прямі та зворотні був чисто умовним. Також за допомогою розробленої автором дисертації комп'ютерної програми було складено 30 випадкових послідовностей з використанням генератора випадкових чисел. Це було зроблено для того, щоб порівняти їх із існуючими в природі послідовностями, і переконатися в тому, що склад реальних послідовностей не є випадковим. З цього рисунка видно, що розподіл енергій взаємодії пар основ у промоторі має 3 максимуми. Перший з них міститься в області між позиціями вікна -40 і -30 стосовно точки ініціації транскрипції (+1), другий - між позиціями -15 і -10, останній - між позиціями -4 і +10. Ці області розташовані на найбільш важливих ділянках промотора та відповідають -10, -35 і +10 консенсусним послідовностям.

Рис. 1. Залежність середньої енергії нуклеотидної пари (кДж/моль) від її положення в промоторі.

Дані про силу промотора наведені на рис. 2. З цих даних видно, що проаналізовані промоторні послідовності істотно відрізняються між собою по силі. Сила промотора визначалась як десятинний логарифм концентрації білка, синтезованого з гена, який регулювався певним промотором.

Рис. 2. Сила промоторів (по горизонталі відкладено номер промотора).

У дисертаційній роботі досліджувалося питання про розбиття всіх 106 промоторів на групи або кластери по ступеню схожості їхньої структури з консенсусною послідовністю (тут розглядалися також і «слабкі» промотори). Спочатку потрібно було знайти «середню» (консенсусну) промоторну послідовність серед усіх досліджених промоторів. Ця процедура полягала у визначенні нуклеотида, який найчастіше зустрічається в промоторах на кожній промоторній позиції. Для цього вважалося, що на певній позиції в «середній» промоторній послідовності міститься нуклеотид, який найчастіше зустрічається на цій позиції у всіх інших промоторів.

Таблиця 1. Формули регресійної залежності сили промоторів від енергії взаємодії ланцюгів ДНК у різних ділянках промотора.

Ділянка промотора	Формула регресивної залежності середньої сили промотора від його середньої енергії в кластері.	Множинний коефіцієнт кореляції.
Весь промотор		0,876
-55 послідовність		0,991
-35 послідовність		0,942
-10 послідовність		1,000
+7 послідовність		0,813

Кількісні дані, що характеризують властивості кластерів, наведені в таблиці 1. Множинний коефіцієнт кореляції у цій таблиці - складова величина, яка у даному випадку описує кореляцію регресивної залежності зі здобутими в результаті розрахунків точками на графіку залежності середньої сили простора у кластері від його середньої енергії (тобто, наскільки точно регресивна залежність описує здобуті дані). З цієї таблиці видно, що залежності середньої сили промотора в кластері від середньої по кластеру енергії взаємодії ланцюгів ДНК у всьому промоторі, в -35 і в +7 послідовностях є подібними та мають форму параболи. Це означає, що кластери з найбільш сильними промоторами мають низькі величини середньої енергії, а кластери, які містять промотори з найбільшою енергією взаємодії ланцюгів ДНК, мають мінімальну середню силу. Залежність середньої по кластеру енергії взаємодії ланцюгів ДНК в -55 послідовності від середньої сили промотора в кластері має трохи складніший характер і описується кривою з двома екстремумами. Кластери, здобуті шляхом аналізу енергії взаємодії, мають експоненціальну залежність середньої по кластеру сили від середньої енергії -10 послідовності.

Таблиця 2. Енергетичні властивості промоторів і їхня сила в групах за ступенем подібності блоків Прібнова.

Номер кластера	Кількість промоторів у кластері	Середня енергія взаємодії ланцюгів ДНК у промоторі для даного кластера (Ккал/моль)	Середня енергія взаємодії ланцюгів ДНК у блоці Прібнова для даного кластера (Ккал/моль)	Середня сила промотора для кластера
1	2	890,1	71,4	0,62
2	10	903,8	61,6	1,54
3	59	915,1	54,7	3,21
4	40	904,5	51,4	3,00

Таблиця 3. Енергетичні властивості промоторів і їхня сила в групах за ступенем подібності -35 послідовностей.

Номер кластера	Кількість промоторів у кластері	Середня енергія взаємодії ланцюгів ДНК у промоторі для даного кластера (Ккал/моль)	Середня енергія взаємодії ланцюгів ДНК у -35 послідов-ності для даного кластера (Ккал/моль)	Середня сила промотора для кластера
1	2	890,1	61,6	1,12
2	7	898,5	54,6	1,20
3	72	906,4	62,3	2,97
4	25	917,5	71,4	3,47

У дисертаційній роботі також досліджено питання про можливість розбиття на групи всіх аналізованих промоторів по розподілу енергії взаємодії нуклеотидів у блоці Прібнова та -35 послідовності. За допомогою кластерного аналізу всі 106 промоторів (включаючи «слабкі») були розбиті на чотири кластери. Знайдені дані для групування промоторів за ступнем подібності блоків Прібнова наведені в Табл. 2, а для їхнього групування за ступенем подібності -35 послідовностей - у Табл. 3. В обох випадках усі кластери істотно розрізняються по розподілу енергії взаємодії комплектуючих нуклеотидів у цілому промоторі (його довжина - 31 нуклеотид).

Для кожної з груп промоторів були визначені середні величини енергії взаємодії нуклеотидів у блоці Прібнова (у першому випадку) і в -35 послідовності (у другому випадку), а також була визначена середня величина сили промотора в кластері (для обох випадків). Формули регресивної залежності та коефіцієнти кореляції залежності середньої сили промотора в кластері від середньої енергії взаємодії ланцюгів ДНК у -10 і -35 послідовностях наведені в Табл. 4.

Таблиця 4. Формули регресивної залежності сили промоторів від енергії взаємодії ланцюгів ДНК у різних ділянках промотора і в цілому промоторі.

Область ДНК.	Формула регресивної залежності сили промотора від енергії взаємодії ланцюгів ДНК у вказаній області.	Множинний коефіцієнт кореляції.
Блок Прібнова	y = 280exp(-8,5·10-2x)	0,909
Весь промотор (групування по блоку Прібнова)	y = 4,34·10-27exp(6,78·10-2x)	0,922
-35 послідовність	y = -6,59+0,141x	0,802
Весь промотор (групування по -35 послідовності)	y = -85,2+9,68·10-2x	0,935

У дисертаційній роботі також вивчалися можливі зв'язки між типом регулюючого сигма-фактора та складом промоторів, які регулюються цим фактором. У зв'язку з цим були проведені дослідження нуклеотидних послідовностей промоторів, що регулюються різними сигма-факторами, які були наведені в базі даних Regulon Database V. 4.0, 02-FEB-05. Довжина всіх послідовностей дорівнювала 81 нуклеотиду. Відомо, що склад нуклеотидної послідовності промотора визначає тип сигма-фактора, який взаємодіє з цим промотором, і навпаки. Промотори були поділені на 7 груп залежно від регулюючого їх сигма-фактора (Табл. 5).

Таблиця 5. Кількість нуклеотидних послідовностей промоторів, які регулюються різними сигма-факторами.

Сигма-фактор(и), який(які) регулюють активність промотора.	Кількість промоторів, які регулюються сигма -фактором (-ами).
у24	35
у28	15
у32	32
у38	50
у54	34
у70	555
у70, у38	27

На наступному етапі дослідження були визначені «середні» нуклеотидні послідовності для всіх промоторів, які регулюються певним сигма-фактором. Алгоритм знаходження «се-редньої» послідовності полягав у визначенні найбільш розповсюдженого нуклеотида на певній позиції промоторів, які регулювалися одним і тим же сигма-фактором. Цей нуклеотид ставився на ту ж саму позицію в «середній» послідовності. Потім середня послідовність для промоторів одного сигма-фактора порівнювалася по черзі зі «середніми» послідовностями, складеними для промоторів, які регулюються іншим певним сигма-фактором. При цьому проводився розрахунок кількості різних нуклеотидів, які містилися на певній позиції в порівнюваних нуклеотидних послідовностях.

Отже, були знайдені числа, які характеризують ступінь відмінності між послідовностями нуклеотидів. Були здобуті дані для відмінності нуклеотидів (рис. 3а) і для відмінностей пар нуклеотидів (рис. 3б) на певних позиціях блоків Прібнова кодуючого ланцюга промоторної ДНК для промоторів, які регулюються і взаємодіють з різними сигма-факторами.

а)б)

Рис. 3. Залежність середньої величини різниць нуклеотидних послідовностей блоків Прібнова для різниць нуклеотидів (а) і нуклеотидних пар (б) в промоторах, які регулюються різними сигма-факторами.

З рис. 3 видно, що для генів, які регулюються сигма-факторами 54 і 38, спостерігаються мінімальні кількості відмінностей між нуклеотидними послідовностями блоків Прібнова їхніх промоторів і послідовностями нуклеотидів блоків Прібнова промоторів, що регулюються іншими сигма-факторами. Максимальна відмінність між нуклеотидними послідовностями блоків Прібнова певного класу промоторів від блоків Прібнова всіх інших класів спостерігається для промоторів, які регулюються сигма-фактором 32. Усі інші послідовності нуклеотидів у блоках Прібнова для різних груп промоторів, що регулюються певними сигма-фактором, мають проміжні значення відмінностей нуклеотидів цих послідовностей від аналогічних послідовностей, які належать до інших класів промоторів.

Здобуті дані для відмінностей пар нуклеотидів певно мають біологічно та еволюційно більш важливе значення, тому що вони віддзеркалюють енергетичні властивості взаємодії кожної нитки ДНК у промоторі з сигма-фактором. На основі цих даних було зроблено припущення про те, що зміни в нуклеотидних послідовностях промоторів, які регулюються сигма-факторами 54 і 38, виникли раніше всіх інших змін у нуклеотидних послідовностях промоторів. Цим і викликана максимальна подібність таких послідовностей з послідовностями промоторів для генів, які регулюються іншими сигма-факторами. Нуклеотидні послідовності промоторів, що регулюються сигма-фактором 32, згідно з раніше наведеними міркуваннями, виникли пізніше всіх інших промоторних послідовностей.

Крім того, була досліджена ступінь подібності промоторів по всій довжині їхньої нуклеотидної послідовності, яка дорівнює 81 нуклеотиду, для промоторів, що регулюються різними сигма-факторами. Результати цього дослідження тільки частково збігаються з результатами, здобутими для аналізу ступеня подібності блоків Прібнова (рис. 4). У першому випадку мінімальну кількість відмінностей у нуклеотидах мають промотори, які регулюються сигма-фактором 70. Максимальну різницю в нуклеотидному складі від інших промоторів мають гібридні промотори, що регулюються двома сигма-факторами 70 і 38.

Мінімальна кількість відмінностей у нуклеотидних парах від усіх інших нуклеотидних послідовностей промторів мають промотори, які регулюються сигма факторами 54 і 70, тоді як максимальна кількість відмінностей в парах нуклеотидів з іншими промоторними послідовностями мають промотори, що регулюються сигма-фактором 28. Той факт, що результати для блоку Прібнова та всього промотора мають невеликі відмінності, є нетривіальним, оскільки блок Прібнова становить усього тільки 7,4% від довжини всього

а)б)

Рис. 4. Залежність середньої величини різниць нуклеотидних послідовностей всього промотора для різниць нуклеотидів (а) і нуклеотидних пар (б) в промоторах, які регулюються різними сигма-факторами.

промотора. Це свідчить, що блок Прібнова еволюціонує як частина промотора та визначає специфічність усієї групи промоторів, які регулюються певним сигма-фактором.

У четвертому розділі наведені залежності дипольного моменту, теплоти утворення та енергії найбільш стабільної конформації нуклеотидів від їхнього положення в кодоні та числової характеристики типу нуклеотида - ступеня детермінації. Розрахунки проводилися для триплетів, які містяться у вакуумі та в оточенні молекул води при врахуванні їхньої безпосередньої взаємодії з найбільш близькими до них молекулами. Далі наводиться короткий опис ступеня детермінації.

Як відомо, основи в триплетах генетичного кода відіграють різні ролі. Наприклад, перші дві основи кодона більше детермінують утворення певної амінокислоти, ніж третя основа. Тому половина загальної кількості триплетів (32 кодона) має повне виродження по третій основі, а амінокислота повністю визначається першими нуклеотидами і незалежно від третього нуклеотида . Приблизно дві третини загальної кількості основ, які містяться в ДНК, мають майже постійний характер у всіх організмів - це основи, що розташовані на першому та другому місцях у триплеті (дуплеті), а мінливість складу ДНК визначається основами в третьому положенні.

Шістнадцять можливих дуплетів по спроможності детермінувати амінокислоту розпадаються на два октети: вісім дуплетів (більш «сильних»), що однозначно кодують амінокислоти незалежно від третьої основи, та вісім («слабких»), у яких третя основа визначає значення кодона. Тому чотири нуклеотиди можна розташувати за спроможністю однозначно детермінувати амінокислоти («силі») у порядку зменшення так: C, G, T, A. У дисертаційній роботі для числового опису «сили» була запропонована абстрактна характеристика - ступінь детермінації нуклеотида d згідно таблиці 6.

Це дає змогу перейти від якісного опису структури генетичного коду стосовно здатності кодувати амінокислоту до кількісного. Припускається, що в першому наближенні ступінь детермінації кодона d є адитивною характеристикою, тобто для дуплету x,y маємо . Тоді ромбічна структура дуплетів, наведена в таблиці 7, яка відповідає ромбіч-

Таблиця 6.

ному варіанту генетичного словника, пов'язана з «силою» так, що горизонтальні ряди складаються з дуплетів однакової сили. Для триплету припущення адитивності дає змогу визначити силу за допомогою формули і дослідити симетрії кубічної матриці кодонів.

Далі в загальному змісті роботи наведені графічні зображення та короткі описи залежностей фізичних параметрів нуклеотидів у триплетах, які перебувають у вакуумі. Ці розрахунки проводилися методом AM1 або методом PM3.

Таблиця 7.

Дипольний момент нуклеотидів у триплетах. Дипольний момент молекули, який описує лінійну неоднорідність розподілу її заряду, відіграє важливу роль у визначенні розміру молекули та може бути пов'язаний з міжмолекулярною взаємодією в складних полімерах, таких як ДНК. У найпростішому випадку диполь являє собою систему, яка містить два однакових за величиною та протилежних за знаком заряди q з відстанню між ними r. Дипольний момент такої системи становить D=qr. У випадку рідини з нерегулярним розподілом заряду дипольний момент дорівнює:

Дипольний момент може бути також створений позитивним або негативним і нульовим зарядами. У дисертаційній роботі дипольні моменти нуклеотидів розраховувалися з урахуванням їхньої взаємодії з сусідніми нуклеотидами. Отже, були знайдені залежності їхніх дипольних моментів від їхнього положення в кодоні (рис. 5) та ступеня детермінації з урахуванням впливу сусідніх нуклеотидів.

Деякі дипольні моменти нуклеотидів у залежності від їхнього положення в кодоні мають максимальну величину в середній точці, але іноді дипольний момент нуклеотида в одному кодоні відрізняється від його дипольних моментів у інших кодонах. Дипольні моменти нуклеотидів, розташованих на крайніх положеннях у кодоні, мало відрізняються, а деякі нуклеотиди, які мають максимальний дипольний момент при розташуванні нуклеотида в центрі кодона, характеризуються значно меншими значеннями дипольного момента при його розташуванні в інших точках крім деяких випадків розташованого на початку кодона гуаніну. Залежності дипольних моментів нуклеотидів від їхнього ступеня детермінації мають хаотичний характер і тому вони не наведені в авторефераті.



аб

вг

Рис. 5. Залежність дипольного моменту аденіну (а), тиміну (б), гуаніну (в) і цитозину (г) від його положення в кодоні.

Теплота утворення нуклеотидів у триплетах. Теплота утворення являє собою енергію, яка виділяється атомами в процесі утворення ними молекули. Якщо об'єм системи залишається сталим, то кількість теплоти , яка здобувається системою, дорівнює зміні її енергії, тобто . Якщо тиск системи також залишається сталим, то зміна кількості теплоти становить

'

де функція, що залежить від теплоти являє собою ентальпію.

У дисертаційній роботі розраховувалася теплота утворення всіх нуклеотидів з урахуванням їхньої взаємодії з сусідніми нуклеотидами. Отже, були знайдені залежності теплоти утворення від положення нуклеотида в кодоні (рис. 6) та його ступеня детермінації.

Графіки залежності енергії найбільш стабільної конформації та теплоти утворення для різних нуклеотидів дуже схожі між собою та в кожній точці вони мають дуже малі відмінності. Для цих параметрів у точці 2 спостерігається мінімум, із чого випливає, що центральний нуклеотид є більш стабільним, ніж нуклеотиди, розташовані по краям. Залежність теплоти утворення нуклеотида від його ступеня детермінації має складний та хаотичний характер і тому в авторефераті не наводиться.

Енергія найбільш стабільної конформації нуклеотидів у триплетах. Найбільш стабільна конформація молекули має мінімально можливу енергію. Чим меншою є енергія молекули, тим стабільнішою буде її конформація. Знання величини енергії найбільш стабільної конформації молекули дає змогу визначити, яка з молекул у наборі є найбільш стабільною.

аб

вг

Рис. 6. Залежність теплоти утворення аденіну (а), тиміну (б), гуаніну (в) і цитозину (г) від його положення в кодоні

Можна також зробити це у випадку різних складових молекули, з'єднаних одна з одною в різних послідовностях. Якщо складова, оточена іншими складовими, має мінімальну енергію, то структура, яка містить усі частини в певному порядку, є більш стабільною, ніж будь-яка структура, в якій частини розташовані в деякому іншому порядку.

У дисертаційній роботі розраховувались енергія найбільш стабільної конформації нуклеотидів з урахуванням їхньої взаємодії з сусідами. Автор дисертаційної роботи користувався програмним комплексом «HYPERCHEM» для визначення енергії найбільш стабільної конформації молекул. «Стартова» модель молекули (модель, з якої починалась оптимізація її геометрії) була взята із бази даних програмного комплексу «HYPERCHEM», у якій були представлені моделі різних складних молекул таких як амінокислоти, нуклеотиди та ін.. Найбільш стабільні конформації визначались самим програмним комплексом «HYPERCHEM» у процесі розрахунків. Отже, здобуто залежності енергії найбільш стабільної конформації від місця розташування нуклеотида в кодоні та його ступеня детермінації (рис. 7).

Для залежності енергії найбільш стійкої конформації нуклеотида від його місця розташування в кодоні спостерігається мінімум, коли нуклеотид міститься в середені кодона.

Для залежності енергії найбільш стійкої конформації нуклеотида від ступеня детермінації нуклеотида спостерігається мінімум при d =3, що відповідає гуаніну.

Наведення вигляду найбільш стабільних конформацій є складним, оскільки їх дуже багато, у кожній з них багато атомів і всі вони не схожі одна на одну.

Для залежностей фізичних параметрів нуклеотидів у кодонах, які оточені молекулами води, характерними є відсутність певної залежності дипольного моменту нуклеотидів від їхнього положення в кодоні та від ступеня детермінації. Теплота утворювання не має чіткої залежності від ступеня детермінації нуклеотида, а її залежність від положення нуклеотида в

аб

в

Рис. 7. Залежність енергії найбільш стабільної конформації нуклеотида, розташованого в першому (а), другому (б) та третьому (в) положенні в кодоні від його ступеня детермінації.

кодоні має вигляд, аналогічний графікам на рис. 4, але величини теплоти утворення в цьому випадку не збігаються зі значеннями, наведеними на цьому рисунку. Залежності енергії найбільш стійкої конформації нуклеотида від його положення в кодоні та його ступеня детермінації мають такий саме характер, як і в попередньому випадку, але значення енергій відрізняється від величин енергій нуклеотида в кодоні, який перебуває у вакуумі.

ВИСНОВКИ

У дисертаційній роботі була розв'язана поставлена наукова задача визначення та дослідження можливих закономірностей між фізичними властивостями нуклеотидів і їхнім положенням у кодоні та ступенем детермінації, а також між фізичними властивостями промоторів та їхньою біологічною активністю. Основні наукові результати є такі:

1.Виявлено, що розподіл енергії по всій довжині промотора має екстремуми на позиціях -35, -10 і +7 стосовно точки ініціації транскрипції. Цей результат не залежить від орієнтації промотора в геномі. Знайдено, що склад -55 послідовності пов'язаний з функціональною активністю промотора.

2.На основі аналізу груп (кластерів) промоторів по розподілу енергії зв'язку ниток ДНК в областях -55, -35, -10 і+7 нуклеотидних позицій стосовно точки старту транскрипції доведено, що розподіл енергії в цих областях пов'язаний з функціональною активністю промотора. Залежність середньої сили промотора від його середньої енергії в кластері має принаймні один екстремум у випадках -55, -35 і +7 послідовностей, однак у випадку -10 послідовності ця залежність є монотонною.

3.Знайдено, що блоки Прібнова (-10 послідовності) промоторів, які регулюються сигма-факторами 28, 38 і 54, мають мінімальну кількість відмінностей у нуклеотидному складі з блоками Прібнова промоторів, що регулюються іншими типами сигма-факторів.

4.На основі аналізу збігів нуклеотидних пар у блоках Прібнова доведено, що мінімальна кількість відмінностей по цьому параметру з блоками Прібнова промоторів, які регулюються іншими сигма-факторами, мають промотори, що регулюються сигма-факторами 54 і 70, а максимум - промотори, які регулюються сигма-фактором 24. На основі здобутих даних зроблено висновок, що промотори, які регулюються сигма-факторами 38, 54 і 70, еволюційно є старшими, ніж промотори, що регулюються сигма-факторами 24 і 32.

5.Результати розрахунків дипольного моменту, теплоти утворення та енергії найбільш стійкої конформації нуклеотида, який взаємодіє з двома іншими нуклеотидами в триплеті довели, що дипольний момент практично не залежить від положення нуклеотида в кодоні та його ступеня детермінації. У той же час теплота утворення залежить тільки від положення нуклеотида в кодоні, а енергія найбільш стійкої конформації залежить як від положення нуклеотида в кодоні, так і від його ступеня детермінації.

6.У дисертації вперше розраховані дипольний момент, теплота утворення та енергія найбільш стійкої конформації нуклеотидів, які перебувають у водяному розчині, при врахуванні його безпосередньої взаємодії з шістьма найбільш близькими молекулами води, які його оточують. Цей результат є важливим, оскільки в природі ДНК зустрічається, як правило, у водяному розчині, що має відображатись у розрахунках. Здобуті результати довели, що характер залежностей фізичних параметрів нуклеотидів у цьому випадку є приблизно таким же самим, як тоді, коли кодон не перебуває у водяному розчині, але величини фізичних параметрів не збігаються з їхніми значеннями в згаданому раніше випадку.

ПЕРЕЛІК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1.Berezhnoy A.Y. Dependence of nucleotide physical properties on their placement in codons and determinative degree. / Berezhnoy A.Y., Duplij S.A // Journal of Zhejiang University SCIENCE. - 2005. - V.6B. - №.10. - P.948-960.

2.Berezhnoy A.Y. Dependence of E. coli promoter strength and physical parameters upon the nucleotide sequence. / Berezhnoy A.Y., Shckorbatov Y.G // Journal of Zhejiang University SCIENCE. - 2005. - V.6B. - №. 11. - P.1063-1068.

3.Бережной А.Ю. Зависимость физических свойств нуклеотидов, находящихся в водном растворе от их положения в кодоне и степени детерминации. / Бережной А.Ю., Дуплий С.А. // Біофізичний Вісник. - 2007. -Т.1. - Вип. 18. - С.29-47.

4.Shckorbatov Y.G. Regularities in the E. Coli promoters composition in connection with the DNA strands interaction and promoter activity. / Shckorbatov Y.G., Berezhnoy A.Y. // J. of Zhejiang University SCIENCE. - 2006. - V.7. - №. 12. - P.969-973.

5.Шкорбатов Ю.Г. Энергия взаимодействия цепей ДНК в промоторах E. coli в связи сих функциональной активностью. / Шкорбатов Ю.Г., Бережной А.Ю. // - Біофізичний Вісник. - 2006 - Т.1. - Вип.17. - С.42-47.

6.Зависимость физических свойств нуклеотидов от их положення в кодоне и степени детерминации: материалы Международной научной конференции «Каразинские естественнонаучные студии» / Бережной А.Ю., Дуплий С.А. - Харьков, 2004. - С.207-208.

7.Dependence of physical properties of nucleotides solute in water on their placement in codons and determinative degree: 2^nd International Conference on Quantum Electrodynamics and Statistical Physics, Book of Abstract / Berezhnboy A.Y., Duplij S.A. - Kharkov, 2006. - P.146.

АНОТАЦІЯ

Бережной А.Ю. Залежність фізичних властивостей нуклеотидів і промоторів від їхніх функціональних і еволюційних характеристик. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата фізико-математичних наук за спеціальністю 03.00.02 - біофізика. Харківський національний університет імені

В.Н. Каразіна, Харків, 2010.

Проведено огляд літератури, присвяченої різним методам моделювання нуклеотидів і ланцюгів ДНК, що складаються з них, а також результати досліджень, в яких використовуються ці моделі. Обговорюються молекулярні механізми, які обумовлюють аномальні властивості кристалів азотистих основ, та дослідження структурних ізомерів основ нуклеотидів.

Досліджені можливі взаємозв'язки між функціональною активністю промоторів, їхньою структурою та енергетичними властивостями. Досліджені структурні відмінності між групами промоторів, які регулюються різними сигма-факторами, що дало змогу зробити певні висновки про еволюцію промоторів.

Досліджені такі фізичні параметри нуклеотидів та їхніх основ, як дипольний момент, теплота утворення та енергія найбільш стійкої конформації для нуклеотидів, що перебувають у вакуумі та у водяному розчині. Проведено аналіз їхньої залежності від положення нуклеотида в кодоні та його ступеня детермінації.

Ключові слова: нуклеотид, кодон, промотор, ступень детермінації, дипольний момент, енергія промотора, конформація.

АННОТАЦИЯ

Бережной А.Ю. Зависимость физических свойств нуклеотидов и промоторов от их функциональных и эволюционных характеристик. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук по специальности 03.00.02. - биофизика. Харьковский национальный университет имени

В.Н. Каразина, Харьков, 2010.

Проведен обзор литературы, посвященной различным методам моделирования нуклеотидов и цепей ДНК, состоящих из них, а также результатам исследований, использующих эти модели. Обсуждаются молекулярные механизмы, обуславливающие аномальные свойства кристаллов азотистых оснований, и исследования структурных изомеров оснований нуклеотидов.

Исследованы возможные взаимосвязи между функциональной активностью промоторов, их структурой и энергетическими свойствами. Для изучения энергетических характеристик промоторов использовался метод «скользящего окна», для изучения зависимостей этих характеристик от функциональной силы промотора применялся кластерный анализ. Рассмотрены структурные различия между группами промоторов, регулируемых различными сигма-факторами, что позволило сделать определенные выводы об эволюции промоторов.

Энергия промотора определялась как сумма энергий связи всех нуклеотидных пар в промоторе. Длина «скользящего окна», использовавшегося для этой цели, была выбрана равной 10 нуклеотидам. Это было связано с тем обстоятельством, что при малой длине окна (порядка 2-3 нуклеотида) энергетический спектр промотора имел бы очень большие скачки, а при большой длине окна (порядка половины промотора и больше) спектр был бы близок к прямой линии. Так как длина функционально важных участков промотора (блока Прибнова и -35 последовательности) равняется шести нуклеотидам, было выбрано наиболее близкое к 9 (длина участка плюс половина его длины) круглое значение, что упрощало расчеты. Эти расчеты проводились для «сильных» промоторов (тех, у которых величина биологической силы превышала единицу). Перед проведением расчетов промоторы были разделены на две группы в зависимости от их ориентации в геноме. Результат расчетов показал, что в энергетическом спектре обеих групп промоторов наблюдаются четко выраженные три минимума на позициях, отвечающих функционально важным участкам промотора.

Рассматривался вопрос о возможности разбиения всех 106 промоторов Escherichia coli, исследовавшихся в настоящей работе, на группы по степени сходства их структуры со «средней» для всех промоторов последовательностью. Для этой цели использовался кластерный анализ. Результат показал, что зависимости средней силы промотора в кластере от средней по кластеру энергии взаимодействия цепей ДНК во всем промоторе, в -35 и в +7 последовательностях являются сходными и имеют форму параболы. Это означает, что кластеры с наиболее сильными промоторами имеют низкие значения средней энергии, а кластеры, содержащие промоторы с наибольшей энергией взаимодействия цепей ДНК, имеют минимальную среднюю силу. Кластеры, полученные путем анализа энергии взаимодействия комплементарных нуклеотидных пар в -10 последовательности, имеют экспоненциальную зависимость средней по кластеру силы от средней энергии -10 последовательности.

Исследованы такие физические свойства нуклеотидов и их оснований, как дипольный момент, теплота образования и энергия наиболее устойчивой их конформации. При проведении расчетов значений этих свойств для нуклеотидов, находящихся в водном растворе, предполагалось, что исследуемый нуклеотид непосредственно взаимодействует с шестью наиболее близкими к нему молекулами воды. В отличие от расчетов, проводившихся ранее, принималось во внимание взаимодействие нуклеотидов друг с другом при градиенте сходимости, равном единице. Проведен анализ зависимости выше названных свойств от положения нуклеотида в кодоне и его степени детерминации. Проанализированы различия этих свойств для кодонов и антикодонов.

Расчеты физических параметров нуклеотидов проводились с помощью программного комплекса HYPERCHEM. Перед расчетами составлялись модели нуклеотидных триплетов, которые при необходимости окружались моделями молекул воды, расположенных на расстоянии от триплета в пределах условно выделенного блока. После составления моделей проводилась оптимизация их геометрии, с одновременной модификацией физических параметров соединений, представленных этими моделями. При оптимизации геометрии энергия уменьшалась до тех пор, пока разность ее значения на предыдущем и текущем шаге вычисления (градиент сходимости) не становилась меньше определенной величины. Оптимизация геометрии для триплетов в вакууме проводилась до градиента сходимости, равного 0,001, а для нуклеотидов в окружении молекул воды - до градиента сходимости, равного 1, так как технические возможности не позволяли достичь в этом случае большей точности.

Ключевые слова: нуклеотид, кодон, промотор, степень детерминации, дипольный момент, теплота образования, энергия нуклеотида, энергия промотора, конформация.

SUMMARY

Berezhnoy A.Y. Dependence of physical properties of nucleotides and promoters from their functional and evolutional characteristics. - Manuscript.

Thesis for a candidate's degree of Physical and Mathematical Sciences in Biophysics - Specialty 03.00.02, V.N. Karazin Kharkiv national university, Kharkiv, 2010.

One has made review of the literature in which different nucleotide and DNA chains modeling methods and the results of investigation using these models are described. The molecular mechanisms stipulating anomalous nitrous bases crystals and investigations of the structural nucleotide bases isomers are discussed

The possible correlations between the functional promoters activity and their structure or their energetic properties have been investigated. One has also investigated structural differences of the promoter groups regulating by different sigma-factors, what allowed making the conclusions about promoters evolution.

One has investigated the physical properties of nucleotides placed in vacuum and in the water solution, such as dipole moment, heat of formation and the energy of most stable conformation. One has realized the analysis of their dependences on nucleotide place in codon and on its determinative degree.

Keywords: nucleotide, codon, promoter, determinative degree, dipole moment, promoter energy, conformation.

Размещено на Allbest.ru

...