Вплив пептидних компонентів отрути павуків роду geolycosa на пуринергічні рецептор-канальні комплекси

Размещено на http://www.allbest.ru/

[Введите текст]

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ФІЗІОЛОГІЇ ІМ. О. О. БОГОМОЛЬЦЯ

Савченко Ганна Анатоліївна

УДК 577.354.3

ВПЛИВ ПЕПТИДНИХ КОМПОНЕНТІВ ОТРУТИ ПАВУКІВ РОДУ GEOLYCOSA НА ПУРИНЕРГІЧНІ РЕЦЕПТОР-КАНАЛЬНІ КОМПЛЕКСИ

03.00.02 - біофізика

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Київ - 2011



Дисертацією є рукопис.

Роботу виконано на кафедрі біохімії біологічного факультету Київського національного університету імені Тараса Шевченка та у відділі фізико-хімічної біології клітинних мембран Інституту фізіології ім. О. О. Богомольця НАН України

Науковий керівник:

доктор біологічних наук, професор, академік НАН України Кришталь Олег Олександрович, Інститут фізіології ім. О. О. Богомольця НАН України, завідувач відділу фізико-хімічної біології клітинних мембран

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук Марченко Сергій Михайлович, Інститут фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України, провідний науковий співробітник відділу загальної фізіології нервової системи;

доктор фізико-математичних наук Тесленко Віктор Іванович, Інститут теоретичної фізики ім. М. М. Боголюбова НАН України, провідний науковий співробітник відділу квантової теорії молекул і кристалів.

Захист дисертації відбудеться «22» березня 2011 р. о 14:00 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.198.01 при Інституті фізіології ім. О. О. Богомольця НАН України за адресою: 01024, м. Київ-24, вул. академіка Богомольця, 4.

З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Інституту фізіології ім. О. О. Богомольця НАН України за адресою: 01024, м. Київ-24, вул. академіка Богомольця, 4.

Автореферат розіслано «14» лютого 2011 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради, доктор біологічних наук О. Сорокіна-Маріна



ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Біль є найбільш значущим відчуттям, яке доводиться переживати людині. Він є одним з найбільш сильних та глибоких відчуттів і варіює у своєму прояві від фізичного нездужання до емоційного страждання.

Протягом останніх кількох десятиліть розуміння того, як мозок отримує та обробляє візуальну, слухову, смакову, нюхову та соматосенсорну інформацію зазнало революційних змін. Проте, найбільший прогрес відбувся у розумінні механізмів формування, передачі та обробки больових сигналів у нормі та патології. Великою мірою такий прогрес відбувся завдяки мультидисциплінарному підходу до вирішення проблеми, що включало одночасне застосування методів нейробіології, поведінкових тестів, генетичних, молекулярних та клітинних підходів. Втім, незважаючи на значний поступ у цій галузі, надзвичайно скромні можливості має сучасна медицина для подолання болю і надзвичайно мало що може пояснити сучасна наука.

Біль є необхідним для виживання організму та підтримання його цілісності, проте, будучи тривалим або хронічним, біль може призвести до виникнення таких вторинних симптомів, як занепокоєння і депресія, та значно погіршити якість життя.

Відомо, що обробка больового сигналу відбувається на троьх рівнях: периферичному, спінальному та супраспінальному. Ноцицептивна інформація від пошкоджених периферичних ділянок приходить у мозок по численних паралельних нейронних шляхах. У кожній ділянці больового шляху - від сенсорного нерва до спинного мозку, від спинного мозку до стовбура мозку, і від стовбура мозку до переднього мозку - інформація про пошкодження розподіляється між цими паралельними системами. Молекулярне розділення таких паралельних систем дозволяє оцінити вклад кожної з них у кінцеве поведінкове вираження болю.

Біль зазвичай розділяють на сенсорний та емоційний аспекти. Також його визначають як гострий або хронічний в залежності від тривалості, а також як нейропатичний у випадку коли він є наслідком пошкодження нервової системи. Такі лікувальні агенти як нестероїдні протизапальні препарати або нові інгібітори циклооксигеназ ефективно знижують інтенсивність больового стимулу від пошкодженої тканини або від активованих сенсорних нейронів(Green, 2001). З іншого боку системні опіати діють переважно на рівні центральної нервової системи, і зменшують чуттєві прояви болю(посилання). Хоча місцеві ін'єкції опіатів також можуть зменшувати біль, спричинений запаленням або нейропатичний біль(Davis, 2010). Втім, і ті, й інші мають ряд неминучих побічних ефектів(Ahmedzai, Boland, 2007).

Виходячи з окресленої картини, перспективним науковим напрямком є виокремлення індивідуальних сигнальних ланок больової системи, відкриття нових молекулярних мішеней для анальгетиків. Це дасть не лише інструменти для контролю над болем, але й допоможе зрозуміти улаштування больової системи та механізми передачі больових сигналів.

Серед багатьох складників больової системи неостаннє місце займає пуринергічна ланка. Зокрема її представник -рецептор-канальний комплекс Р2Х3, що експресується в мембрані сенсорних нейронів дорсально-корінцевих гангліїв, залучений у формування таких больових відчуттів як біль, зумовлений запаленням та гострий біль(Wirkner et al., 2007).

Відомо, що рецептор-канальний комплекс Р2Х3 складається з 3 однакових субодиниць, що це є катіонна пора, найбільш проникна для іонів кальцію(MacKenzie et al., 1999). Також відома низка агоністів, що активують ці рецептори та кілька неселективних антагоністів(North, 2002). Наразі небагато відомо про структурно-функціональні особливості цих рецептор-канальних комплексів, і значною мірою це обумовлено відсутністю селективних модуляторів.

Також відомо, що шпиги більшості павуків призводять до виникнення больового відчуття. Але поки мало відомо стосовно того, які компоненти отрут павуків спричинюють біль; на які ланки больової системи вони діють. З іншого боку, ряд селективних модуляторів іонних каналів знайдено саме серед пептидних компонентів отрут павуків(Vassilevski et al., 2009).

Дана робота присвячена дослідженню отрути павуків родини Geolycosa sp, їхнього впливу на «больові» рецептор-канальні комплекси Р2Х3. А також вивченню механізмів роботи рецептор-канального комплексу Р2Х3 за допомогою селективних модуляторів цього рецептора, які було виділено з отрути павуків-вовків.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана відповідно до загального плану науково-дослідних робіт відділу фізико-хімічної біології клітинних мембран Інституту фізіології ім. О. О. Богомольця НАН України в рамках науково-дослідних робіт «Дослідження молекулярно-генетичних механізмів фізіологічних та патофізіологічних процесів та розробка методів їх корекції» (номер державної реєстрації - 0107U005336), «Механізми внутрішньоклітинної та міжклітинної сигналізації; вивчення шляхів їх модуляції та пошук нових фармакологічних впливів» (номер державної реєстрації - 0107U010843), в ході співпраці з Міжнародним центром молекулярної фізіології (Україна, Київ) в рамках науково-дослідних робіт «Рецепторні механізми периферичної антиноцицепції» (номер державної реєстрації - 0105U003467) та в ході співпраці з московським інститутом біоорганічної хімії ім. Шемякіна та Овчиннікова в рамках білатерального гранту «Нові сполуки з природних отрут, що селективно взаємодіють з нейрональними рецепторами та іонними каналами» (номер державної реєстрації - 0108U003916).

Мета та завдання дослідження. Мета даної роботи полягала у встановленні механізмів впливу пептидних компонентів отрути павуків роду Geolycosa на активність Р2Х3 типу пуринорецепторів сенсорних нейронів щурів.

Для досягнення поставленої мети необхідно було вирішити такі завдання:

Протестувати вплив пептидних фракцій та окремих пептидних комонентів отрути Geolycosa sp. на активність Р2Х пуринорецепторів сенсорних нейронів щурів;

Виділити пептидні компоненти, що впливають саме на Р2Х3 підтип пуринорецепторів;

Порівняти ефективність впливу на рецептор-канальні Р2Х3 комплекси ДКГ нейронів щурів нативного та рекомбінантного пептидів;

Встановити механізм дії пептиду на рецептор-канальні Р2Х3 комплекси сенсорних нейронів щурів;

Визначити селективність дії пептиду;

Порівняти вплив пептиду на нативні та рекомбінантні Р2Х пуринорецептори.

Порівняти вплив пептиду на Р2Х3 пуринорецептори щура та Р2Х3 пуринорецептори людини.

Об'єкт дослідження - модуляція больової системи пептидними компонентами природних отрут.

Предмет дослідження - взаємодія рецептор-канальних комплексів Р2Х3 з пептидними компонентами отрути павуків родини Geolycosa sp.

Методи дослідження - метод внутрішньоклітинної перфузії, метод фіксації потенціалу в режимі відведення від цілої клітини, метод швидкого прикладання агоністів у конфігурації фіксації концентрації.

Наукова новизна одержаних результатів. В дисертаційній роботі вперше показано та досліджено модулюючий вплив цілої низки сполук пептидної природи, отриманих з отрути Geolycosa sp.. Виділено та охарактеризовано перший селективний модулятор Р2Х3 рецептор-канальних комплексів пептидної природи - пуротоксин 1 (РТ1). Встановлені механізми його дії на досліджувані рецептор-канальні комплекси. Показано, що ефект РТ1 на Р2Х3 рецептор є стано-залежним. Показано, що ефективність дії РТ1 на Р2Х3 рецептори щурів та людей незначно відрізняється за величиною.

Практичне значення одержаних результатів. Проведені дослідження дозволили виявити селективний модулятор рецептор-канальних комплексів Р2Х3 серед пептидів з отрути павуків родини Geolycosa sp. Оскільки РТ1 є високо селективним до Р2Х3 рецептор-канальних комплексів, а також оскільки дія РТ1 є чутливою до стану, в якому знаходиться Р2Х3 рецептор-канальний комплекс, можна стверджувати, що РТ1 є надзвичайно важливим інструментом у дослідженні структурно-функціональних особливостей роботи цього комплексу. Досі не було знайдено подібної природної чи синтетичної речовини, яка б селективно взаємодіяла з представниками «больових» рецепторів, що входять до складу пуринергічної родини. Тож, РТ1 дозволить значно розширити знання стосовно механізмів роботи одного з представників групи больових рецепторів.

Оскільки рецептор-канальні комплекси Р2Х3 беруть участь у генеруванні та передачі больових сигналів, речовина, що селективно пригнічує їх роботу є надзвичайно важливою у фармакологічному сенсі. Малі ефективні концентрації та повна зворотність ефекту роблять РТ1 привабливим кандидатом на роль анальгетика нового покоління.

Також, відомо, що укуси більшості павуків викликають біль, проте мало відомо про те, що саме викликає біль. РТ1 - один з небагатьох пептидів, що розкривають механізми впливу отрут на больову систему ссавців.

Особистий внесок здобувача. Усі експериментальні дослідження виконувалися за безпосередньої участі здобувача. Статистичне опрацювання результатів, підбір та обробка літературних джерел, виділення гостро ізольованих нейронів ДКГ також здійснювалися особисто автором роботи. Здобувач брав активну участь у плануванні напрямків досліджень, обговоренні та аналізі отриманих результатів. Культивування нейронів ДКГ виконувалося науковим співробітником відділу фізико-хімічної біології клітинних мембран Інституту фізіології ім. О. О. Богомольця НАН України Волковою Тетяною Михайлівною. Розробка стратегії досліджень, аналіз та узагальнення результатів здійснювалися спільно з керівником роботи д. б. н., проф., акад. НАН України О. О. Кришталем. Поведінкові експерименти з РТ1, що наводяться в обговоренні результатів, здійснювались молодшим науковим співробітником В'ячеславом Вятченко-Карпінським з відділу загальної фізіології нервової системи. Автор щиро вдячний пров. інж. Бойчуку Я. А. за допомогу в обробці результатів, м.н.с. Вятченко-Карпінському В. за допомогу у проведенні поведінкових тестів, с.н.с. Чижмакову І.В. за допомогу у розробці схеми кінетичного виділення підтипів пуринергічних рецепторів, н.с. Волковій Т.М. за забезпечення культурами клітин.

Апробація результатів дисертації. Основні положення роботи були представлені на українсько-польській конференції для молодих вчених «Механізми внутрішньоклітинної сигналізації» в рамках співпраці інституту фізіології ім. О.О. Богомольця та Інституту експериментальної біології ім. М. Ненскі (Київ, Україна, 2007), на 5-му міжнародному симпозиумі «Актуальні проблеми біофізичної медицини» (Київ, Україна, 2007), на IV конференції українського товариства нейронаук (Слов'янськ, Україна, 2008), на міжнародному форумі Федерації Європейських товариств нейронаук (Женева, Швейцарія, 2008), на V міжнародній школі “Neuro-Glial Interactions: From Womb to Tomb in Health and Disease” (Ізмір, Туреччина, 2009)б на 7-ій міжнародній конференції Глобального Інституту Нейропротекції та Нейрорегенерації (GCNN) (Стокгольм, Швеція, 2010), на семінарі в Інституті Фармакології та Токсикології (Тюбінген, Німеччина, 2010)Б на конференціях-виставках «Медична лабораторія та інновація в медицині» (Київ, Україна, 2010) та «Наука - Виробництву» (Всеукраїнського Фестивалю науки) (Київ, Україна, 2010).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 9 праць, з них 3 статті у фахових наукових журналах, затверджених ВАК України, тези 5 доповідей у збірках матеріалів наукових конференцій та з'їздів, та 1 патент Російської Федерації.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, матеріалів і методів досліджень, експериментальної частини, аналізу і узагальнення результатів досліджень, висновків, списку використаних джерел, який охоплює 222 найменування. Дисертацію викладено на 134 сторінках стандартного машинопису, вона містить 37 рисунків та 2 таблиці.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали і методи дослідження. В експериментах використовувались білі щури лінії Вістар WAG\GSto (Москва, Росія) віком 8-10 днів, вагою 15-20 г, що утримувались на стандартній лабораторній дієті у віварії Інституту фізіології ім. О. О. Богомольця НАН України. Електрофізіологічні вимірювання проводили на ізольованих нейронах ДКГ (гостроізольовані та культивовані). Нейрони виділялись з відповідних гангліїв методом ферментативно-механічної ізоляції. Реєстрацію струмів, опосередкованих Р2Х рецепторами сенсорних нейронів, проводили методом фіксації потенціалу (петч-клемп) в режимі відведення від цілої клітини. В ході роботи використовувався стандартний позаклітинний розчин такого складу (у ммоль/л): 130 NaCl; 5 КCl; 2 СаСl2; 2 MgCl2; 10 HEPES. pH розчину доводили до 7,4 - 7,45 за допомогою NaOH. Реєструючі мікропіпетки заповнювалися внутрішньоклітинним розчином, що містив (у ммоль/л): 130 KCl, 10 Hepes, 10 ЕГТА, 0,5 ГТФ, 5 ATФ. pH розчину доводили до 7,2 за допомогою КОН. В ході деяких експериментів до складу внутрішньоклітинного розчину вносили зміни (зазначено окремо). Опір мікропіпеток для реєстрації струмів, опосередкованих Р2Х3 рецепторами в нейронах ДКГ, при зануренні у стандартний позаклітинний розчин та заповненні стандартним внутрішньоклітинним розчином становив 3 - 5 МОм. Швидке прикладання та відмивка досліджуваних речовин досягалися за рахунок використання методу «фіксації концентрації» з незначними модифікаціями (Krishtal, Pidoplichko, 1980; Pankratov et al., 2001).

Амплітуда струму визначалася від базової лінії до його пікового значення. Експериментальні дані представлені у вигляді середніх арифметичних значень вимірів із стандартним відхиленням. Статистична вірогідність відмінності від контрольних умов оцінювалася за допомогою t-тесту Стьюдента. Значуща відмінність позначена *** - P < 0.0001, ** - P < 0.001 та * - P < 0.05.. Аналіз та обробка одержаних результатів проводилася за допомогою комп'ютерних програм AnDatRa (Ярослав Бойчук) та Origin 8.0 (OriginLab Corporation, США).

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Вплив нативних пептидних компонентів отрути павуків роду Geolycosa на Р2Х рецептори нейронів дорзально-корінцевих гангліїв щурів. В мембранах нейронів дорзально-корінцевих гангліїв (ДКГ) експресуються три представники родини пуринергічних рецептор-канальних комплексів, а саме Р2Х3, Р2Х2 та Р2Х2/3 (Bland-Ward, Humphrey, 2000). Іонні струми, опосередковані роботою Р2Х різних підтипів відрізняються за кінетикою (Petrushka et al., 2002). Наразі не існує агоністів селективних до певного підтипу пуринергічних рецепторів. Тому активація Р2Х рецепторів на нейронах ДКГ за допомогою таких агоністів, як аденозинтрифосфат (АТФ) та цитидинтрифосфат (ЦТФ), призводить до виникнення інтегрального струму через канали Р2Х2, Р2Х3 та Р2Х2/3 типів. Первинне дослідження пептидних компонентів отрути відбувалось саме на інтегральних Р2Х струмах.

Рис. 1 - Первинне тестування впливу пептидів на Р2Х-опосередковані струми

При первинному дослідженні впливу пептидних компонентів отрути павуків роду Geolycosa на Р2Х-опосередковані струми на нейронах ДКГ щурів концентрація досліджуваних зразків становила 1 нМ. Після отримання контрольних АТФ-опосередкованих струмів дослідний зразок вводився у позаклітинний розчин. На фоні перебування дослідного зразка у позаклітинному розчині отримували кілька АТФ-опосередкованих відповідей (до досягнення стаціонарного стану). Амплітуду та кінетику струмів після досягнення стаціонарного стану у розчині з досліджуваною речовиною порівнювали із контрольними. Ліворуч - сумарна діаграма, що описує дію зразків з фракції V на АТФ індуковані струми через рецептор-канальні комплекси Р2Х ДКГ нейронів малого діаметру. Праворуч - сумарна діаграма, що описує дію зразків з фракції VІ на АТФ індуковані струми через рецептор-канальні комплекси Р2Х ДКГ нейронів малого діаметру.

Ряд пептидних молекул, виділених з отрути павуків роду Geolycosa ефективно впливав на АТФ-індуковані струми на нейронах ДКГ щурів (Рис. 1). З досліджених 17 зразків 10 мали помітний ефект на Р2Х-опосередковані струми у концентраціях від 1 нМ до 10 нМ. Зразки впливали на Р2Х-опосередковані струми по-різному: одні - потенціювали, інші - пригнічували. Це може бути обумовлено тим, що отрути павуків (і не лише павуків) є складними сумішами біологічно активних речовин різноманітної природи - від неорганічних солей до білків. Відповідно до сучасних уявлень різноманітні компоненти отрути працюють у синергізмі, забезпечуючи таким чином певний фізіологічний ефект отрути. Тому не виключено, що окремі компоненти отрути самі по собі можуть проявляти протилежні ефекти, що підтверджують отримані результати.

Більшість досліджених пептидів впливали виключно на амплітуду струмів, проте деякі, наприклад VI 22, змінювали кінетику АТФ-індукованих струмів (Рис. 2).



Рис. 2 - Ефект зразка VІ 22 на АТФ індуковані струми через Р2Х рецептор-канальні комплекси ДКГ нейронів малого діаметру. При введенні зразка VІ 22 у позаклітинний розчин у концентрації 1 нМ спостерігалось суттєве (20 ± 7) % збільшення АТФ-індукованого струму, порівняно з контрольним. Прикладання VІ 22 також пришвидшувало кінетику входу рецептор-канальних комплексів у десенситизований стан. На вставці представлено нормалізовані струми

Взаємодія модулятора з рецептор-канальним комплексом характеризується кількома кінетичними параметрами, зокрема афінністю та ефективністю (Colquhoun, 1998). Афінність виражає імовірність зв'язування модулятора з рецептором і експериментально відображається у половинній ефективній концентрації (КД50). Ефективність виражає імовірність конфірмаційного переходу (наприклад такого, що призводить до відкривання каналу) і експериментально відображується у максимальній величині ефекту. Модулятори, зв'язуючись з рецептором (або опосередковано впливаючи на нього) можуть змінювати конформацію білкової молекули так, що це впливає на взаємодію з агоністом. Якщо розглядати вплив модулятора на взаємодію ліганда (агоніста) з рецептор-канальним комплексом, то в залежності від того, на який кінетичній параметр впливає модулятор, можна спостерігати зміни в амплітуді чи кінетиці іонного струму. Таким чином, отримані результати вказують на те, що отрута містить як певний ряд пептидів, що можуть впливати на афінність рецептор-канального комплексу до агоніста, так і ряд пептидів, що можуть впливати на ефективність переходу рецептор-канального комплексу Р2Х з одного функціонального стану до іншого.

Виділені з отрути пептидні молекули, що проявляли значну за силою зворотну дію по відношенню до АТФ-індукованих струмів були обрані для отримання у рекомбінантному вигляді.

Вплив РТ1, рекомбінантного аналога VI 4, на АТФ-індуковані струми. Пептид VI 4 у концентраціях 1 нМ та 10 нМ ефективно (15% та 40%) пригнічував АТФ-індуковані струми на нейронах ДКГ щурів (Рис. 3). Для подальшого детального дослідження цей пептид було отримано у рекомбінантному вигляді московськими колегами з інституту Шемякіна та Овчиннікова та названо РТ1.

Рис. 3 - Вплив зразка VІ 4 (який пізніше було отримано у рекомбінінтному вигляді під назвою РТ1) на АТФ індуковані струми через Р2Х рецептор-канальні комплекси ДКГ нейронів малого діаметру. При введенні у позаклітинний розчин зразка VІ 4 у концентрації 1 нМ спостерігалось помірне (15 ± 5)% пригнічення АТФ-індукованих струмів, порівняно з контролем. При дії зразка VІ 4 не спостерігалось жодних змін у кінетиці АТФ-індукованих струмів. На вставці представлено нормалізовані струми

Дія РТ1, рекомбінантного пептиду, на Р2Х-опосередковані струми виявилась слабшою за дію його природного попередника VІ 4. Це може бути зумовлене кількома причинами, зокрема, особливістю синтезу білка на рибосомах та його складання у третинну структуру. Клітини штучної експресії можуть мати невідповідні умови для утворення білка конкретної просторової структури, що може відображуватись у зміні ефективності взаємодії пептида з рецептором.

Оперуючи різною чутливістю представників пуринергічної родини рецептор-канальних комплексів до різних агоністів було встановлено, що РТ1 впливає виключно на струми опосередковані роботою рецептор-канальних комплексів Р2Х3 (Рис. 4).

Рис. 4 - Ефект РТ1 на струми, опосередковані роботою Р2Х3 та Р2Х2/3 рецепторів. Для того щоб розмежувати струми, опосередковані роботою Р2Х2 та Р2Х2/3 рецепторів було використано різну чутливість цих рецепторів до таких агоністів як АТФ та б,в-меАТФ

Р2Х2/3 рецептори мають однакову чутливість до обох агоністів, а Р2Х2 рецептори активуються за допомогою б,в-меАТФ лише за таких його концентрацій, що перевищують 100 мкМ (Spelta et al., 2002). Однакові концентрації обох агоністів було прикладено до клітини і отримано «повільні» іонні струми. На деяких клітинах іонні струми у відповідь на прикладання АТФ були значно більшими за іонні струми у відповідь на прикладання б,в-меАТФ, вказуючи на домінуючий внесок у інтегральний струм Р2Х2 рецепторів (А). На інших клітинах іонні струми у відповідь на прикладання як АТФ, так і б,в-меАТФ були однаковими, вказуючи на домінуючий внесок у інтегральний струм Р2Х2/3 рецепторів (Б). РТ1 не проявляв жодної активності по відношенню до струмів активованих за допомогою АТФ або б,в-меАТФ (n = 6). Отже, РТ1 не впливає на Р2Х2 та Р2Х2/3.

Взаємодія РТ1 з рецептор-канальним комплексом Р2Х3. При взаємодії з Р2Х3 рецептором РТ1 проявляв подвійну дію. А саме, в залежності від моменту прикладання РТ1 до клітини спостерігали або потенціацію або пригнічення АТФ-індукованих струмів. Спираючись на модель рецептор-канального комплекса (Ford, 2005), відповідно до якої останній може перебувати у трьох функціональних станах (закритому, відкритому та десенситизованому); а також беручи до уваги часові параметри взаємодії Р2Х3 рецетора з агоністами (АТФ та ЦТФ) було встановлено, що дія РТ1 на Р2Х3 рецептори є стано-залежною. При взаємодії РТ1 з рецептором у закритому стані спостерігалась потенціація АТФ (або ЦТФ)-індукованих струмів, а при взаємодії РТ1 з Р2Х3 рецептором у десенситизованому стані, навпаки, - пригнічення АТФ (або ЦТФ)-індукованих струмів (Рис. 5). Обидва ефекти були зворотніми та відбувались при дії РТ1 у надзвичайно малих концентраціях: для потенціації ЕС50 = (24 ± 2) нм, для пригнічення ЕС50 = (12 ± 1) нм (Рис. 6).

Рис. 5 - Вплив РТ1 на АТФ-викликані струми. Викликані прикладанням АТФ струми на нейронах ДКГ характеризуються надзвичайно тривалим періодом десенситизації. Відтворювані АТФ-індуковані струми можна отримати, прикладаючи АТФ до клітини приблизно що 15 хвилин. А. Вплив РТ1 на закритий стан рецептор-канального комплексу Р2Х3



На 14-ій хвилині більша частина рецептор-канальних комплексів Р2Х3 вже вийшла з десенситизованого стану і знаходиться у закритому стані. Тому, прикладання на 14-ій хвилині дослідного зразка відображує його взаємодію з рецептор-канальним комплексом у закритому стані. Взаємодія РТ1 з Р2Х3 рецептором у закритому стані призводить до потенціювання АТФ-індукованого струму порівняно з контрольним. Б. Вплив РТ1 на десенситизований стан рецептор-канального комплексу Р2Х3. Прикладання РТ1 безпосередньо після отримання АТФ-індукованого струму відображає взаємодію пептиду з рецептор-канальним комплексом у десенситизованому стані. Взаємодія РТ1 з Р2Х3 рецептором у десенситизованому стані призводить до пригнічення АТФ-індукованого струму порівняно з контрольним.

Рис. 6 - Концентраційна залежність дії РТ1 на рецептор-канальний комплекс Р2Х3 у різних функціональних станах. Зверху - крива доза-ефект для дії РТ1 на закритий (не зв'язаний з агоністом) стан рецептор-канального комплексу Р2Х3. Знизу - крива доза-ефект для дії РТ1 на десенситизований стан рецептор-канального комплексу Р2Х3. ЕК50 - половинна ефективна концентрація; кх - коефіцієнт Хілла. В обох випадках коефіцієнт Хілла може вказувати на одномолекулярну взаємодію

Механізм впливу РТ1 на Р2Х3-рецептори. У Р2Х3 рецепторів надзвичайно вираженим є десенситизований стан. За експериментальних умов (за температури 20 - 22 °С) він складає 1 хвилину у випадку використання у якості агоніста ЦТФ та 15 хвилин у випадку використання АТФ. З'ясувалось, що пригнічувальний ефект РТ1 послаблюється зі збільшенням часу між прикладаннями агоністу. За достатньо тривалого часу між прикладаннями агоністу ефект пригнічення переходить в ефект потенціації (Рис. 7). Тож, РТ1 впливає на Р2Х3 рецептори шляхом затримання їх у десенситизованому стані.

пептид нейрон щур модулятор

Рис. 7 - Елімінація пригнічувального ефекту РТ1 на Р2Х3 рецептор-канальний комплекс при збільшенні часу між прикладаннями агоніста. Час виходу з десенситизації для ЦТФ-активованих струмів складає близько 2 хвилин. При прикладанні РТ1 безпосередньо після отримання ЦТФ-активованого струму спостерігалось пригнічення струму. При послідовній активації Р2Х3 рецепторів на фоні постійної присутності РТ1 у позаклітинному розчині спостерігали стаціонарний рівень пригнічення ЦТФ-струмів порівняно з контролем. При збільшенні часового проміжку між активацією Р2Х3 рецепторів ефект пригнічення послаблювався переходячи в ефект потенціації

Дія РТ1 в експериментах in vivo. В ряді експериментальних больових моделей на щурах РТ1 проявляв добре виражену антибольову активність. Так, антиноцицептивний ефект РТ1 спостерігався після його інтраплантарного введення у запалену задню лапу щура як після викликаної карагінаном, так і після викликаної повним ад'ювантом Фройнда, температурної гіпералгезії. РТ1 також ефективно зменшував кількість ноцицептивних проявів, викликаних ін'єкцією капсаіцину або формаліну. Ноцицептивна поведіка значно пригнічувалась саме у другій фазі формалін-індукованого болю (Рис. 8).

Селективність дії РТ1. Оскільки РТ1 активно зменшував прояв больової поведінки у моделях in vivo, в тому числі у капсаїциновій моделі, було необхідним перевірити вплив цього пептиду на такі «больові» рецептори як TRPV1 (капсаїцинові) та NaV1.9. При дослідженні впливу РТ1 на TRPV1 рецептори, що експресуються у мембранах нейронів ДКГ не було зафіксовано жодного помітного ефекту у діапазоні концентрацій РТ1 від 10 нМ до 100 нМ. РТ1 у концентрації 100 нМ також був неактивним по відношенню до ряду потенціал-керованих каналів (K+, Na+ та Ca2+ канали), що експресуються у мембранах нейронів ДКГ. Отже, можна вважати, що поведінкові ефекти РТ1 обумовлені його дією саме на рецептор-канальні комплекси Р2Х3.

Рис. 8 - Ефект РТ1 на температурну гіпералгезію та ноцицептивну поведінку у різних моделях болю. У кожному тесті 0,5 нМ РТ1 було інтраплантарно введено кожній досліджуваній тварині. А. РТ1 зменшував термічну гіпералгезію, викликану карагінаном (ліва діаграма) та повним ад'ювантом Фройна (права діаграма). Б. РТ1 послаблював індуковану капсаїцином та формаліном ноцицептивну поведінку (у випадку формаліну така дія РТ1 розповсюджувалась лише на другу фазу). ***P < 0.0001, **P < 0.001, *P < 0.05. (n = 6 для кожної групи)

Вплив РТ1 на людські Р2Х3 рецептори гетерологічно експресовані у мембранах ембріональних клітин нирки людини (ЕКНЛ). Оскільки РТ1 ефективно зменшував прояв больової поведінки у щурів і таким чином стає кандидатом на роль потенційного анальгетика, було необхідно перевірити його вплив на людські Р2Х3 рецептори. Хоча кінетика АТФ або ЦТФ-індукованих струмів через гетерологічно експресовані людські рецептор-канальні комплекси Р2Х3 відрізняється від кінетики струмів через нативні рецептор-канальні комплекси Р2Х3 щурів, РТ1 також проявляв пригнічувальний ефект на людські рецептор-канальні комплекси Р2Х3. Порівняно з нативними рецепторами щурів, вплив РТ1 на гетерологічно експресовані рецептори був таким самим за механізмом, проте трохи слабшим за силою (Рис. 9).

Рис. 9 - Вплив РТ1 на струми, опосередковані людськими Р2Х3 рецептор-канальними комплексами, експресованими у ембріональних клітинах нирок людини (ЕНКЛ). А. Типовий приклад Р2Х3-опосередкованих струмів на ЕКНЛ клітинах та дія на нього РТ1 у концентрації 20 нМ. Б. Порівняльна діаграма величини ефекту РТ1 на Р2Х3 рецептори нейронів ДКГ та клітин ЕКНЛ



ВИСНОВКИ

З'ясовувався вплив пептидних компонентів отрути павуків Geolycosa sp. на пуринергічні рецептор-канальні комплекси. Результатом скринінгу ряду пептидних компонентів стало відкриття селективного модулятора Р2Х3 рецептор-канальних комплексів.

Низка пептидних компонентів отрути павуків роду Geolycosa впливає на рецептор-канальні комплекси Р2Х сенсорних нейронів, зокрема, - VI 22 та V 33-39 потенціюють Р2Х-опосередковані струми, а VI 9, V 35-1, V24-26, V 3-29, V 40 та V 32 пригнічують Р2Х-опосередковані струми;

Знайдено пептид довжиною у 35 амінокислотних залишків (РТ1), що у рекомбінантній формі здатен у концентрації 12 нМ впливати на Р2Х3 рецептор-канальні комплекси. Настільки мала діюча концентрація ставить РТ1 на перше місце серед відомих на сьогодні селективних та неселективних модуляторів Р2Х3 рецептор-канальних комплексів;

Дія РТ1 є стано-залежною. При дії на Р2Х3 рецептор-канальний комплекс у закритому стані РТ1 призводить до потенціації струмів, а при дії на Р2Х3 рецептор-канальний комплекс у десенситизованому стані, навпаки - до їх пригнічення. Це свідчить про те, що РТ1 може бути використаний в якості інструмента у дослідженнях структурно-функціональних зв'язків у роботі Р2Х3 рецептор-канальних комплексів;

РТ1 є ефективним по відношенню не лише до нативних Р2Х3 рецептор-канальних комплексів щурів, але й по відношенню до людських Р2Х3 рецептор-канальних комплексів, експресованих на мембранах ембріональних клітин нирки людини. Це говорить про можливість використання РТ1 в медицині як потенційного анальгетика нового покоління;

РТ1 є селективним до Р2Х3 рецептор-канальних комплексів. Він не чинить впливу на Р2Х2, Р2Х2/3, TRPV1 рецептор-канальні комплекси, а також на ряд Na+, K+ та Ca2+ потенціал-керованих іонних каналів, що експресуються у мембранах сенсорних нейронів щурів. Така селективність, особливо поміж рецепторів пуринергічної родини, разом з надзвичайно малою ефективною концентрацією (12 нМ) робить його цінним інструментом для подальших досліджень Р2Х3 рецептор-канальних комплексів;

РТ1 є ефективним у зменшенні больових проявів у моделях in vivo. РТ1 зменшує термічну гіпералгезію, викликану карагінаном та повним ад'ювантом Фройнда. РТ1 послаблює індуковану капсаїцином та формаліном ноцицептивну поведінку.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Пептидні компоненти отрути Geolycosa sp. модулюють активність P2X рецепторів сенсорних нейронів ссавців / [Савченко Г.А., Василевский А.А., Плужников К.А. та ін.] / Фізіологічний журнал, _ 2009. - Т. 55, № 2 С. 11-16.

2. Пуринергічні мембранні рецептори як мішені дії пуротоксину-1 - компоненту отрути пауків роду Geolycosa / [Савченко Г.А., Волкова Т.М., Бойчук Я.А., та ін.] / Нейрофізіологія, - 2010. - Т. 42, № 6. С. 483-489.

3. Пат. 2010122215 Російська Федерація. Пептидний модулятор пуринергічних рецепторів / Василевский А.А., Савченко Г.А., Королькова Ю.В., Бойчук Я.А., Плужников К.А., Кришталь О.О., Гришин Є.В. - № 1037739009110; заяв. 01.06.2010.

4. Вплив поліпептидного компонента LSP315 отрути павука Geolycosa на P2X3 рецептори DRG нейронів щурів / Савченко Г.А., Бойчук Я.А., Волкова Т.М., Кришталь О.О. / 5-й міжнародний симпозиум «Актуальні проблеми біофізичної медицини», Київ, Україна, 2007. //Фізіологічний журнал 54, № 2 C. 119-120.

5. Novel peptide from spider venom effectively inhibits P2X3 receptors in sensory neurons and ameliorates inflammatory pain / [N. Voitenko, O. Krishtal, A. Savchenko et al] / Society for Neuroscience Annual Meeting. Nov. 15-19, 2008, Washington, USA.

6. Г.А. Савченко, Я.А. Бойчук, К.А. Плужніков, Є.В. Грішин, О.О. Кришталь. Вплив поліпептидного компоненту LSP315 отрути павука Geolycosa на Р2Х3-рецептори нейронів дорсальних гангліїв щурів // Нейронауки: теоретичні та клінічні аспекти. - 2008. - Т. 4, № 1. Додаток. С. 56-57.

7. Savchenko G. Modulation of spinal cord sensory entries by opioids and natural toxins / Savchenko G., Mamemnko M. / Vth Ege Biennial International Neuroscience Graduate Summer School “Neuro-glial interactions: From womb to tomb in health & disease”. June 29-July 4, 2009, Izmir, Turky.

8. Novel peptide from spider venom inhibits P2X3 receptors and allaviates inflammatory pain / [Eugene V. Grishin, Ganna A. Savchenko, Alexand A. Vassilevski et al] / 7th Annual International Conference of Global college of Neuroprotection and Neuroregeneration (GCNN). February 28 - March 3, 2010, Stockholm, Sweden. American Journal of Neuroprotection and Neuroregeneration, - June 2010. V. 2, № 1. P. 86-159.



АНОТАЦІЯ

Савченко Г. А. Вплив пептидних компонентів отрути павуків роду Geolycosa на пуринергічні рецептор-канальні комплекси. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.02 - біофізика. - Інститут фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України, Київ, 2010.

Дисертацію присвячено вивченню впливу пептидних компонентів отрути на «больові» пуринергічні рецептор-канальні комплекси. Показано, що значна частина пептидних компонентів отрути впливає на іонні струми опосередковані роботою Р2Х рецепторів сенсорних нейронів шурів. Детальне дослідження одного з пептидних компонентів (а саме, РТ1) показало, що він селективно впливає на Р2Х3-опосередковані струми. Дія РТ1 залежить від функціонального стану рецептор-канального комплексу. Механізм дії РТ1 на Р2Х3 рецептори полягає у затриманні останніх у десенситизованому стані. Показано, що РТ1 ефективно зменшує прояви больової поведінки in vivo. Також продемонстровано чутливість людських Р2Х3 рецепторів до дії РТ1.

Ключові слова: сенсорні нейрони, Р2Х рецептори, біль, пептидні компоненти отрут



АННОТАЦИЯ

Савченко А. А. Влияние пептидних компонентов яда пауков рода Geolycosa на пуринэргические рецептор-канальные комплексы. - Рукопис.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.02 - биофизика. - Институт физиологии им. А. А. Богомольца НАН Украины, Киев, 2009.

Диссертация посвячена изучению влияния пептидних компонентов яда на «болевые» пуринэргические рецептор-канальные комплексы. Показано, что значительная часть пептидних компонентов яда влияет на ионные токи, опосредованные работой Р2Х рецепторов сенсорних нейронов крыс. Детальное исследование одного из пептидних компонентов (а именно, РТ1) показало, что он селективно действует на Р2Х3-опосредованные токи. Действие РТ1 зависит от функционального состояния рецептор-канального комплекса. Механизм действия РТ1 на Р2Х3 рецепторы состоит в задержке упомянутых рецепторов в десенситизированном состоянии. Показано, что РТ1 эффективно уменьшает проявление болевого поведения in vivo. Также продемонстрована чувствительность Р2Х3 рецепторов человека к РТ1.

Ключевые слова: сенсорные нейроны, Р2Х рецепторы, боль, пептидные компоненты ядов



SUMMARY

Savchenko G.A. Effect of peptide components of Geolycosa sp venom of the puriergic receptors.

Electrophysiological recordings were carried out on the small DRG neurons demonstrating only fast responses to ATP characteristic of P2X3 receptors. Conventional whole-cell patch-clamp was used in combination with rapid drug application.

Using patch clamp and concentration clamp, we have studied the mode of PT1 action on P2X3 receptors in DRG neurons of rat. PT1 produced a small potentiating effect on the current generated by P2X3 receptors. However, when acting on the desensitized receptors, PT1 greatly decreased subsequent responses of P2X3 to ATP. Both effects were totally reversible. We have found that PT1 exerts its inhibitory action by a dramatic concentration-dependent prolongation of P2X3 desensitization removal. In the continuous presence of PT1, inhibition is reversed back to potentiation as the period of agonist applications increases. Desensitized P2X3 receptors acquire a "high-affinity binding site" for the agonist: its unbinding mirrors the rate of recovery from desensitization. Preliminary data suggest that PT1 does not compete for this site acting allosterically. PT1 produced similar effects on human recombinant P2X3 receptors expressed in HEK293 cells.

PT1 was ineffective (at concentrations up to 1 µM) against slower responses to ATP generated by the cumulative activity of P2X2 and P2X2/3 receptors. No activity of PT1 against a number of voltage- and ligand-gated channels, including the vanilloid TRPV1 receptors, was found.

We have evaluated the effects of PT1 on behavioral reactions of rats in inflammatory pain models. In the Hargreaves plantar test, the antinoceptive effect was observed following intraplantar injection of PT1 into the inflamed hindpaw of rat under both carrageenan- and CFA-induced thermal hyperalgesia. PT1 was also effective in reducing the number of nocifensive events triggered by the injection of capsaicin or formalin. Nocifensive behavior was significantly reduced in the second but not in the first phase of the formalin assay. In summary, as little as only 0.5 nmol of injected peptide produced roughly a two-fold reduction of hyperalgesia in all the employed models. A further four-fold increase in the amount of injected PT1 did not produce additional changes.

The analgesic effects of PT1 are in qualitative agreement with observations made using a small molecule, A-317491, which is an antagonist of both P2X3 and P2X2/3 receptors. However, the amount of PT1 per animal used in our experiments is almost 3 orders of magnitude lower than that of A-317491, causing comparable effects. In summary, PT1 is a naturally occurring inhibitor of P2X3 receptors that represents a highly attractive molecular motif for developing new analgesic drugs.

Key words: sensory neurons, P2X receptors, pain, toxins' peptide components

Размещено на Allbest.ru

...