Конкурентне зв'язування біологічно активних речовин з полінуклеотидними матрицями

Размещено на http://www.allbest.ru/

Харківський національний університет імені В.Н. Каразіна

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата фізико-математичних наук

03.00.02. - біофізика

Конкурентне зв'язування біологічно активних речовин з полінуклеотидними матрицями

Виконав Єрмак Євгенія Леонідівна

Харків - 2008



АНОТАЦІЯ

ліганд спектрофотометрія ультрафіолетовий поліаніон

Єрмак Є.Л. Конкурентне зв'язування біологічно активних речовин з полінуклеотидними матрицями. - Рукопис.

Дисертація на одержання наукового ступеню кандидата фізико-математичних наук за спеціальністю 03.00.02 - біофізика. - Харківський національний університет ім. В.Н. Каразіна, м. Харків, 2008.

Дисертація присвячена розробці методик аналізу конкурентної взаємодії біологічно активних речовин з молекулами нуклеїнових кислот у випадку мультимодального зв'язування одної з БАР. Робота виконана за допомогою комплексу сучасних фізичних методів (абсорбційна спектрофотометрія у видимій і УФ областях, чисельні методи розрахунку параметрів зв'язування в системах БАР₁ - НК - БАР₂). Розроблено нову методику аналізу спектрів поглинання для систем БАР₁ - поліелектроліт - БАР₂ для випадку, коли один з лігандів не поглинає у видимій області спектра, а другий використовується як забарвлена мітка, що поглинає у видимій області спектра. Проаналізовано різні моделі зв'язування в розглянутих системах, визначено оптимальні моделі, термодинамічні і стехіометричні параметри зв'язування біологічно активних речовин з полімерними матрицями. Показано, що теофілін, кофеїн, цитидин і його біологічно активні аналоги утворюють на ДНК один тип комплексів і не інтеркалюють у ДНК. Також показано, що вони зменшують кількість агрегованого на НК ліганду-мітки.

Розроблено методику аналізу спектрів поглинання для систем БАР₁ - НК - БАР₂ у випадку, коли оба ліганда поглинають у близьких областях спектру. Аналіз проводився на прикладі систем Actіі - ДНК - бромистий етидій Actіі - ДНК - Хоест 33258. Показано, що в присутності бромистого етидію зменшується кількість інтеркальованого в ДНК Actіі, а в присутності Хоеста 33258 - мономерно зв'язаного в боріздці.

Ключові слова: конкурентне зв'язування, ДНК, спектрофотометрія, чисельні методи розрахунку параметрів зв'язування в системі БАР₁ - поліелектроліт - БАР₂.



1. ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. У зв'язку з розвитком комбінованої хіміотерапії виникла необхідність у вивченні конкурентного зв'язування декількох біологічно активних речовин (БАР) з биополимерами клітки, зокрема з нуклеїновими кислотами (НК). Аналіз конкурентного зв'язування БАР з НК ефективно проводити за допомогою комбінації фізичних методів дослідження та математичних методів обробки отриманих результатів. Одним з найбільш розповсюджених та доступних фізичних методів дослідження взаємодії БАР з НК є метод абсорбційної спектрофотометрії. У дисертаційній роботі запропоновано новий комплексний підхід до спектрофотометричних досліджень конкурентного зв'язування двох біологічно активних речовин (лігандів) з нуклеїновими кислотами. Можливості спектрофотометричного аналізу для вивчення конкурентного зв'язування двох лігандів з НК вважаються обмеженими. В основному його використовують для якісного аналізу процесів зв'язування з НК невивчених БАР у присутності біологічно активних малих молекул, досить добре досліджених раніше. У роботі пропонується нова методика дослідження процесів конкурентного зв'язування, у якій сполучення спектрофотометричних вимірів і розрахункових методів дозволяють одержувати інформацію про спектральні, термодинамічні і концентраційні характеристики усіх комплексів, що утворюються, у потрійних системах БАР₁ - НК - БАР₂, а також оцінювати вплив кожного з біологічно активних компонентів на зв'язування з НК інших не менш важливих лігандів. Методика вивчення конкурентного зв'язування лігандів із НК, що представляється в роботі, призначена для аналі систем, у яких одна з БАР не поглинає ні у видимій, ні в УФ областях спектра чи має слабку спорідненість до НК, або ліганди мають спектри поглинання, що перекриваються.

У запропонованій методиці аналізуються концентраційні залежності спектральних змін систем БАР₁ - НК - БАР₂ у видимій області спектра, де НК не має спектра поглинання. При цьому БАР з відомими типами взаємодії з ДНК (актиноциновое похідне Actіі, бромистий этидий чи Хоехст 33258) використовуються як забарвлені мітки для одержання параметрів і типу зв'язування з НК лігандів, що не мають спектрів поглинання у видимій області (кофеїн (CAF), теофілін (Tph), біологічно активні нуклеозиди (NUC)). Отримані електронні спектри поглинання сумішей аналізуються за допомогою комп'ютерних програм оптимізації, що дозволяють отримувати параметри зв'язування БАР з НК. Вибір біологічно активних речовин також не є випадковим: кофеїн і теофілін є біологічно активними речовинами, що попадають в організм людини з продуктами і які знижують фармакологічну активність багатьох лікарських препаратів. Біологічно активні нуклеозиди, аналоги цитидину, виявляють протипухлинну, противірусну і протимікробну активність. Молекулярні механізми комплексоутворення цих лігандів з НК різні, також як і їхній вплив на зв'язування з НК інших лігандів.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами.

Дослідження з теми дисертації проводилися згідно з планом науково - дослідницьких робіт кафедри біологічної і медичної фізики радіофізичного факультету Харківського національного університету ім. В.Н. Каразіна в рамках фундаментальних держбюджетних НДР: "Фізичні механізми впливу іонізуючого випромінювання, температури і гідратації на макромолекули та біомембрани" (номер держреєстрації 0103U004236, 2003-2005 рр.); "Механізми впливу фізичних факторів і біологічно активних речовин на ДНК, білки та біомембрани" (номер держреєстрації 0106U001548, 2006-2008 рр.); і згідно з планом науково - дослідницьких робот відділу біофізики Інституту радіофізики та електроніки ім. О.Я. Усикова НАН України в рамках фундаментальних держбюджетних НДР: "Дослідження енергетичних та гідратаційних характеристик взаємодії біологічно активних речовин з полінуклеотидними та колагеновими матрицями" (Шифр "Спіраль", номер держреєстрації 0103U002268, постанова Бюро ВФА НАН України від 27.11.2003, протокол № 11, 2004-2006 рр.) і "Молекулярні моделі комплексів біологічно активних речовин з нуклеїновими кислотами за розумів мультимодального та конкурентного зв'язування" (шифр "Модель", номер держреєстрації 0105U03534593, постанова Бюро ВФА НАН України від 12.11.2006, протокол № 17, 2007-2011 рр.).

Мета і задачі дослідження. Метою дійсної роботи є розробка нових методик спектрофотометричного аналізу, що дозволяють не тільки якісно, але і кількісно вивчати конкурентне зв'язування двох лігандів з НК у сумішах БАР₁ - НК - БАР₂ використовуючи різні моделі зв'язування і відповідні комп'ютерні програми оптимізації спектрів поглинання. Розроблені методики дозволяють одержати інформацію про особливості конкурентного зв'язування різних пар БАР з НК при їх мультимодальній взаємодії з НК, термодинамічні і спектральні параметри комплексів, що утворюються. У роботі проілюстровані можливості розробленого підходу на прикладі декількох біологічно важливих систем БАР₁ - НК - БАР₂ з метою його подальшого практичного застосування.

У роботі були поставлені і вирішувалися наступні задачі:

Одержати і проаналізувати експериментально спектри сумішей різних пар біологічно активних лігандів з НК для випадку, коли смуги поглинання лігандів знаходяться в різних областях спектру.

Розробити теоретичні моделі, що дозволяють адекватно описувати спектри поглинання в досліджуваних системах БАР₁ - НК - БАР₂, і вибрати для кожної з розглянутих систем оптимальну модель зв'язування.

Установити типи комплексів, що утворюються, і найкращу модель для кількісного опису взаємодії в кожній з розглянутих систем (забарвлена мітка-ДНК-БАР₂) і одержати параметри зв'язування з НК для БАР₂: кофеїну, теофіліну і біологічно активних аналогів цитидину.

Установити вплив кофеїну, теофіліну та аналогів цитидину на зв'язування з НК конкуруючих БАР (забарвлених міток) і визначити ступінь впливу гетероасоциації лігандів на їх взаємодії з НК у процесі конкурентного зв'язування.

Порівняти параметри зв'язування з НК БАР з подібною хімічною структурою - (1) кофеїну і теофіліну; (2) аналогів цитидину з різною структурою цитозинового і сахарного кілець.

Порівняти параметри зв'язування з НК досліджених БАР, отримані при конкурентному зв'язуванні і під час відсутності конкуруючих БАР.

Одержати і проаналізувати експериментально спектри сумішей різних пар біологічно активних лігандів з НК для випадку, коли смуги поглинання лігандів знаходяться в одній області спектру.

Об'єктом досліджень є конкурентне зв'язування біологічно активних БАР з поліаніонами, включаючи ДНК із тимуса теляти і полірибоцитидилову кислоту.

Предмет дослідження: енергетичні і спектральні характеристики комплексів в потрійних системах БАР₁ - НК - БАР₂.

Методи дослідження: абсорбціонна спектрофотометрія у видимій і ультрафіолетовій областях спектру, чисельні методи розрахунку параметрів комплексоутворення в системах БАР₁ - НК - БАР₂ за допомогою комп'ютерних програм оптимізації спектрів поглинання.

Наукова новизна отриманих результатів. У даній роботі розроблений новий підхід до аналізу спектрів поглинання у потрійних системах БАР₁ - НК - БАР₂. Запропонована методика дозволяє вибирати оптимальну модель конкурентного зв'язування, одержувати детальну інформацію про типи комплексів у системі і їх стехіометрію, обчислювати спектральні і термодинамічні параметри зв'язування лікарських препаратів з полінуклеотидними матрицями в присутності інших біологічно активних компонентів.

Розроблено методику аналізу електронних спектрів поглинання потрійних систем БАР₁ - НК - БАР₂ на основі рівнянь, що описують взаємодію малих молекул БАР з поліаніонами.

За допомогою розробленої методики визначені типи зв'язування і параметри утворення комплексів з ДНК для кофеїну, теофіліну, цитидину, цитозин арабінозиду, 6-азацитозин рібофуранозиду, 6-азацитозин тетрагідрофурилу і 6-азацитозин ксилофуранозиду.

Вперше визначені спектри поглинання і тип комплексів, що утворюються, для Actіі на poly(С) в різних конформаційних станах.

Оцінений вплив кофеїну, теофіліна та аналогів цитидину на зв'язування ActІІ і бромистого етидію з ДНК. На підставі отриманих даних зроблені висновки про активність кофеїну, теофіліну, цитидина і його аналогів при конкурентному зв'язуванні.

Оцінений вплив гетероасоціації лігандів на процеси їх конкурентного зв'язування з ДНК.

Вперше виявлений ефект сінергізму (збільшення константи зв'язування з ДНК) для 6AZC у присутності бромистого етидію.

Розглянуті модельні системи Actіі - ДНК - бромистий етидій і Actіі - ДНК - Хоехст 33258 з метою одержання параметрів зв'язування БАР з ДНК для випадку, коли оба БАР (один із яких утворює кілька типів комплексів на ДНК) поглинають у видимій області спектру, розроблена методика аналізу зв'язування в таких системах.

Практичне значення отриманих результатів.

Препарати ген-спрямованої дії використовуються протягом багатьох літ для лікування онкологічних захворювань, а також у якості противірусних, протимікробних і антибактеріальних лікарських препаратів. В останні роки для лікування онкологічних захворювань використовується комбінована хіміотерапія, коли в організм хворого одночасно вводять кілька лікарських препаратів чи лікарський препарат у сполученні з біологічно активною речовиною, що знижує токсичність протипухлинного препарату. Крім того, в організмі людини можуть бути присутнім різні біологічно активні ароматичні сполуки, що попадають при вживанні чаю, кави, біологічно активних домішок і харчових продуктів. Ці речовини здатні проникати в клітку і впливати на фармакологічну активність лікарських препаратів, як за допомогою прямого зв'язування з лікарським препаратом, так і конкуруючи з ним за місця зв'язування на нуклеїнових кислотах, включаючи ДНК. У зв'язку з викладеним вище виникає необхідність оцінки ступеня впливу кожного з важливих і широко використовуваних лікарських препаратів на характер їхнього зв'язування з ДНК у присутності інших не менш важливих компонентів і розробки нових методик розрахунку параметрів зв'язування і рівноважного складу сумішей у складних потрійних системах БАР₁ - НК - БАР₂ для завбачення впливу конкуренції лігандів на їх фармакологічну активність.

Запропонована нами методика аналізу конкурентного зв'язування в потрійних системах БАР₁ - НК - БАР₂ дозволяє враховувати вплив одного БАР на зв'язування другого з НК, визначати тип зв'язування БАР з НК, а також визначати параметри зв'язування БАР з НК у випадку, коли він не поглинає ні у видимій, ні в УФ областях спектра чи має слабку спорідненість до НК. Комбінація методів абсорбціонної спектрофотометрії і чисельного аналізу отриманих спектрів дозволяє одержувати спектральні і термодинамічні параметри зв'язування конкуруючих БАР з НК, визначати їх взаємний вплив на зв'язування при будь-яких концентраціях реагуючих компонентів і вибирати такі співвідношення концентрацій БАР і НК, у яких ефективність діючої речовини максимальна.

Особистий внесок здобувача. В опублікованих зі співавторами наукових працях особистий внесок здобувача складається: у роботах 1, 6, 7 - участь у проведенні спектрофотометричного титрування в сумішах Actіі - ДНК - кофеїн і розрахунках параметрів зв'язування Actіі і кофеїну з тимусною ДНК, обговоренні отриманих результатів по впливу кофеїну на зв'язування Actіі з ДНК; у роботах 2, 8 - у проведенні спектрофотометричного титрування в сумішах Actіі - poly(C) і Actіі - poly(C) - кофеїн, розрахунках по програмах оптимізації констант і величин місць зв'язування лігандів для різних типів комплексів, аналізі отриманих результатів. У роботах 3 - 5, 9 - 17 - планування експериментів, участь в експериментальних і розрахункових дослідженнях для всіх розглянутих систем, в аналізі літературних даних і разом зі співавторами в інтерпретації й обробці отриманих результатів.

Апробація роботи.

Основні результати дисертаційної роботи були представлені на:

· International School-Seminar Spectroscopy of Molecules and Crystals XVI ISSSMC. - Sevastopol, Ukraine. - 2003.

· The 2^nd International Conf. Physics of Liquid Matter: Modern Problems PLM MP. - Kyiv, Ukraine. - 2003.

· 1 Українській науковій конференції Проблеми біологічної і медичної фізики ПБМФ - 2004. Харків, Україна. 2004.

· 3^rd International Conference Physics of Liquid Matter: Modern Problems PLM MP. - Kyiv, Ukraine. - 2005.

· Конференции студентов, аспирантов и молодых ученых актуальные вопросы теоретической и прикладной физики и биофизики “Физика. Биофизика - 2005”. Севастополь, Украина. - 2005 г.

· 8^th Romanian Biophysics Conference with international participation "Advanced Biomaterials and Biophysical Techniques". Iasi, Romania - 2005.

· П'ятій Харківській конференції молодих науковців. Радіофізика та НВЧ електроніка. - Харків, Україна. Устный доклад "New aspects of ethidium bromide interaction with calf thymus DNA" отмечен дипломом II степени как лучший доклад в секции "Биофизика" ( Приказ № 34 от 16.12.05) - 2005.

· Workshop on the Structure and Function of Biomolecules II 2006. Bedlewo (Poland) - 2006.

· Сьомій Харківській конференції молодих науковців. Радіофізика та електроніка. - Харків, Україна. Устный доклад "Study of actinocine derivative and ethidium bromide competitive binding to calf thymus DNA" отмечен дипломом I степени как лучший доклад в секции "Биофизика" (Приказ № 34 от 16.12.07) - 2007.

· IV Всеукраинской научно-технической конференции актуальные вопросы теоретической и прикладной биофизики, физики и химии “БФФХ - 2008”. Севастополь, Украина. - 2008.

· 1-й Всеукраїнській науковій конференції молодих вчених Фізика низьких температур КМВ-ФНТ-2008. - Харків, Україна. - 2008.

· 4^th International Conference Physics of Liquid Matter: Modern Problems PLM MP. - Kyiv, Ukraine. - 2008.

· Семінарах відділу біофізики ІРЕ НАН України.

2. ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

У вступі обґрунтовано актуальність теми дисертації, сформульовано мету і визначені задачі дослідження, відзначені практичне значення і наукова новизна роботи, приведені відомості про апробацію результатів.

У першому розділі представлено огляд літератури за темою дисертації. Розглянуто літературні дані, що на сучасному рівні висвітлюють способи утворення комплексів біологічно активних лігандів з молекулами ДНК. Проведено детальний аналіз літературних даних з конкурентного звязування лігандів з нуклеїновими кислотами.

У другому розділі коротко розглянуто фізичні основи використаних методів дослідження: абсорбціонної спектрофотометрії у видимій та ультрафіолетовій областях; наведені характеристики вивчених препаратів.

Вимірювання спектрів поглинання сумішей БАР₁ - поліелектроліт - БАР₂ при різних значеннях P/D, де P/D - відношення концентрації основ поліелектролітів (C_Р) до концентрації ліганду (C_D), проводили в термостатованих кварцевих кюветах с довжиною оптичного путі 1, 2 та 10 мм на спектрофотометрі Specord M 40 у видимій та УФ областях спектру.

Поглинання сумішей ліганд - ДНК при любій довжині хвилі згідно закону Ламберта -Бера можливо представити у наступному вигляді:

, (1)

где 1_k - молярний коефіцієнт екстинкції k-ого компонента суміші в j-й довжині хвилі, l - довжина оптичного шляху, C_ki - концентрація відповідного компоненту в кожній i-й суміші.

Описано розрахунковий метод, що дозволяє на базі даних спектрофотометричних вимірювань за допомогою нелінійного метода найменших квадратів отримувати значення параметрів комплексоутворення в системах БАР₁ - поліелектроліт - БАР₂ для обох БАР.

У третьому розділі наведено результати конкурентного зв'язування теофіліну і кофеїну з ДНК і полірибоцитидиловою кислотою в присутності бромистого етидия та актиноцинових похідних (рис. 1). Також вивчені процеси гетероасоціації лігандів і їх вплив на конкурентне зв'язування з НК.

З аналізу спектрів поглинання сумішей ActII - Tph і ЕБ - Tph зроблено висновок, що Tph зв'язується і з ActII, і з ЕБ, і в кожнім випадку утворюється по одному типу комплексів, оскільки у кожній із систем спектри поглинання сумішей проходять через одні ізобестичні точки. Константи гетероасоціації Tph і CAF з ActII і з ЕБ, розраховані по програмі DALS, наведені в табл. 1.

Як видно з табл. 1, константи зв'язування Tph з Actіі і Tph з ЕБ значно перевищують такі ж для CAF. Можна припустити, що це зв'язано з відсутністю в молекулі Tph метильной групи, що є у CAF, що зменшує стеричні перешкоди при взаємодії ароматичних кілець хромофорів лігандів і Tph.



Таблиця 1. Константи зв'язування Tph і CAF з ЭБ і Actіі, по програмі оптимізації DALS

	Tph - ActII	Tph - ЭБ	CAF - ActII	CAF - ЭБ 1)
K, M-1	943	177	337	84.5

Дані отримані методом флюоресценції в роботі Larsen R.W., Jasuja R., Hetzler R.K., Muraoka P.T., Andrada V.G., Jameson D.M. Spectroscopic and molecular modeling studies of caffeine complexes with DNA intercalators. // Bioph. J. - 1996. - V. 70. - P. 443 - 452.

Для аналізу процесів комплексоутворення в потрійній системі БАР₁ - ДНК - БАР₂ розглянуто моделі зв'язування, що по-різному описують зв'язування цих лігандів з ДНК. Описані нижче моделі використовуються у програмах оптимізації для розрахунку параметрів зв'язування БАР з НК.

Модель 1 враховує утворення в системі БАР₁ - поліелектроліт - БАР₂ тільки одного типу комплексів кожного з БАР з НК. Параметри зв'язування і рівноважний склад сумішей для цього випадку розраховується по рівняннях (2 - 5). Величини місць зв'язування БАР₁ (Tph) і БАР₂ (ЕБ) з ДНК - n₁ і n₂ - можуть варіюватися в широкій області значень.

(2)

(3)

(4)

(5)

У рівняннях (2) - (5) використані наступні позначення: R₁ і R₂ - частки зв'язаних БАР₁ і БАР₂, розраховані як частка від ділення концентрацій відповідних комплексів на загальну концентрацію основ (фосфатів) ДНК, m₁ і m₂ - рівноважні концентрації вільних БАР. К₁, К₂ - константи утворення комплексів кожного з БАР з ДНК із місцями зв'язування розміром n₁, n₂ нуклеотидів ДНК. R позначає суму (R₁ + R₂). C_Dі, C_P - загальні концентрації БАР і ДНК, відповідно.

У цій моделі ми враховуємо також утворення гетероасоціатів БАР₁ - БАР₂ (доданок 3 у рівняннях (4) і (5), константа гетероасоціації К₁₂), і димеризацію БАР₂ (доданок 4 у рівнянні (5), константа димеризації К_D).

Модель 2 розглядає зв'язування БАР₂ із ДНК у присутності БАР₁ з урахуванням утворення двох типів комплексів БАР₂ із ДНК (ліганда, що має сусідів і ліганда, що не має сусідів на матриці) з різними молярними коефіцієнтами екстинкції і з урахуванням кооперативного зв'язування БАР₂ з фактором кооперативності щ на місцях зв'язування n₂ з константою зв'язування K₂. БАР₁ утворює з ДНК один тип комплексів з константою комплексоутворення K₁ на місці зв'язування n₁=1. У цій моделі також враховується гетероасоціація БАР₂ і БАР₁ і димеризація БАР₂. Розрахунок рівноважного складу сумішей і оптимізація відповідних спектрів поглинання по Моделі 2 проводився нами в програмі DALSCOMP по рівняннях (4), (5) та (6) - (8):

(6)

(7)

(8)

У рівняннях (6) - (8): щ - фактор кооперативності; г - характеризує імовірність розташування молекул ЕБ на сусідніх місцях зв'язування. Інші позначення співпадають з такими ж у рівняннях (2) - (5).

При обчисленні оптимальних параметрів зв'язування для сумішей Tph - ДНК - ЕБ по Моделі 1, у якій величина місця зв'язування Tph із ДНК варіювалася, було знайдено що n₁=1 щонайкраще задовольняє експериментальним даним. У цьому випадку на одну зв'язану молекулу Tph приходиться одна основа ДНК і можна зробити висновок, що Tph зв'язується з ДНК не по типу інтеркаляції, для якого на одну зв'язану молекулу ліганду приходиться n=4-5 основ ДНК. Оптимальне значення константи зв'язування Tph з ДНК склало К=220±30 M^-1.

При оптимізації тієї ж бази даних по Моделі 2, у якій враховується можливість утворення двох типів комплексів ЕБ із ДНК із двома різними значеннями молярних коефіцієнтів екстинкції, була отримана константа зв'язування Tph із ДНК К=185±20 M^-1. Модель 2 краще описує експериментальні дані, тому що вона враховує утворення двох типів комплексів ЕБ з ДНК.

ЕБ - ДНК і ЕБ - ДНК - Tph від концентрації ДНК, розраховані по Моделі 2. Видно, що кількість комплексу ЕБ з ДНК, що має сусідів на матриці ДНК (криві 2 на рис. 2, а, б), у присутності Tph значно зменшується, а кількість комплексу ЕБ із ДНК по типу інтеркаляції зростає. Таким чином, у присутності теофіліну співвідношення різних типів комплексів ЕБ з ДНК істотно змінюється.

Також була вивчена гетероасоціація актиноцинових похідних і кофеїну, розраховані константи гетероасоціації цих лігандів (табл. 2).

З табл. 2 видно, що для всіх розглянутих актиноцинових похідних значення констант гетероасоціації з кофеїном близькі по величині. Це можна пояснити 1) однаковим типом зв'язування кофеїну з однаковими ароматичними хромофорами актиноцинових похідних і 2) тим, що довжина метиленових ланцюжків в бічних групах актиноцинових похідних не впливає на їх зв'язування з кофеїном.



Таблиця 2. Значення констант гетероасоціації актиноцинових похідних з кофеїном, розраховані по програмі оптимізації DALS

	ActII	ActIII	ActV
KAct-CAF, М-1	337	352	331

Проведено аналіз конкурентного комплексоутворення кофеїну і Actіі з полірибоцитидиловою кислотою (poly(C)). Показано, що зв'язування Actіі як із двунитевою (рис. 2, а), так і з однонитевою poly(C) (рис. 2, б) відбувається з утворенням тільки комплексів по зовнішньому типу зв'язування.

Використовуючи описану вище Модель 2 для розрахунку рівноважних концентрацій (і відповідну їй програму оптимізації DALSCOM), нами були розраховані константи комплексообразования Actіі і CAF з poly(C) (табл. 3)

Таблиця 3. Параметри зв'язування Actіі і кофеїну з poly(C), розраховані по Моделі 2 (програма оптимізації DALSCOM)

	pH=4,45	pH=6,86
	poly(C) - ActII	poly(C) - ActII - CAF	poly(C) - ActII	poly(C) - ActII - CAF
К1, М-1	-	40 М-1	-	170 М-1
К2, М-1	1,7?105 М-1	2,1?105 М-1	3,4?104 М-1	2,8?104 М-1
щ	7?1	6?1	10?5	15?5
n2	3,3?0,1	3,4?0,1	3,0?0,1	2,8?0,1

Показано, що в системах Actіі - poly(C) і Actіі - poly(C) - кофеїн взаємодія Actіі з односпіральною poly(C) відбувається більш кооперативно, чим з двуспиральною, однак з меншою константою зв'язування. Молекули кофеїну не інтеркалюють у матрицю poly(C), а взаємодіють з нею по зовнішньому типу зв'язування. Константа зв'язування кофеїну з двуспіральною poly(C) значно менше, ніж з односпіральною, тобто структура матриці НК відіграє істотну роль при утворенні комплексів з молекулою кофеїну. При конкурентному зв'язуванні кофеїну і Actіі з односпіральною poly(C) кофеїн виявляє як протекторну, так і інтерцепторну дію, а з двуспіральною poly(C) - в основному інтерцепторну.

Також нами було проведене дослідження конкурентного зв'язування Actііі і кофеїну з тимусною ДНК.

Для аналізу комплексоутворення в системах ДНК - Actііі і ДНК - Actііі - кофеїн ми використовували Модель 3 і програму оптимізації DALSMOD. У Моделі 3 для розрахунку рівноважного складу сумішей ДНК - Actііі - кофеїн використовуються рівняння (4) - (8) та рівняння (9):

(9)

У рівнянні (9): К₃ - константа зв'язування БАР₂ з місцем зв'язування n₃ (пара основ) (комплекс 2); R₃ - частка комплексу 2, рівна частці від ділення відповідної рівноважної концентрації на C_N0.

Отримано, що в присутності кофеїну константи зв'язування Actііі з ДНК змінюються. Так, константа зв'язування Actііі в боріздці ДНК і фактор кооперативности в присутності кофеїну зменшуються (табл. 4), що приводить до значного зменшення частки агрегатів Actііі.

Таблиця 4. Значення параметрів зв'язування CAF та Actііі з ДНК, розраховані по Моделі 3 (програма оптимізації DALSMOD)

	K1, М-1	K2, М-1	K3, М-1	n2, осн.	n3, пар осн.	щ
ActIII - ДНК	-	4.7Ч104	1.0Ч105	3.2	6.0	2-3
ActIII - ДНК - CAF	190	2.3Ч104	8.9Ч104	1.9	6.0	1

Можна зробити висновок, що і Tph, і CAF зв'язуються з різними НК практично з однаковими по величині константами асоціації. Також можна відзначити, що ці константи значно менше по величині, чим константи зв'язування використаних нами лігандів-міток: ЕБ чи Actіі, Actііі з ДНК. Тому зрозуміло, що ефект впливу Tph і CAF на зв'язування ЕБ і Actіі з ДНК через малі величини їхніх констант зв'язування з НК буде виявлятися тільки при відносно високих концентраціях Tph і CAF, що необхідно враховувати при використанні розроблених нами методик конкурентного зв'язування для цих лігандів у присутності інших лігандів-міток.

У четвертому розділі надано результати дослідження конкурентного зв'язування цитидину і його біологічно активних аналогів (рис. 3) з ДНК у присутності бромистого етидія.

Показано, що немодифіковані по цитозиновому кільцю нуклеозіди (Cyd і Ara-C) не є безпосередніми конкурентами за місця зв'язування ЕБ з ДНК по типу інтеркаляції, але впливають на процес його зв'язування, наприклад, змінюючи гідратне оточення молекули ДНК, що може полегшувати перехід ДНК в А-подібну конформацію. На відміну від них модифіковані нуклеозіди (6AZC, AZAfur і AZAxyl), що мають додаткову азагруппу в цитозиновому кільці, виступають як конкуренти ЕБ за місця зв'язування на ДНК по типу інтеркаляції. Для цих лігандів були розраховані параметри зв'язування з ДНК по описаним вище моделям конкурентного зв'язування. Отримані по Моделі 1 (програма оптимізації COMP) параметри зв'язування 6AZC, AZAfur і AZAxyl із ДНК представлені в табл. 5.

Таблиця 5. Оптимальні значення параметрів зв'язування нуклеозидів 6AZC, AZAfur і AZAxyl з ДНК, розраховані по Моделі 1 (програма оптимізації COMP)

	6AZC	AZAfur	AZAxyl
K1, M-1	(1,4± 0,5)·104	(2,5±0,3)·104	(9,5± 0,5)·102
n1	1,1±0,1	1,2±0,1	1,1±0,1
n2	2,9±0,1	3,0±0,4	2,5±0,1

Модель 1 дозволяє досить добре описувати спектральні зміни, що відбуваються в системах нуклеозид - ДНК - ЕБ. Видно, що знайдена оптимальна величина місця зв'язування n₁ для всіх нуклеозидов приблизно однакова і дорівнює одній основі ДНК на зв'язану молекулу нуклеозиду.

Оскільки ЕБ при зв'язуванні з ДНК може утворювати з ДНК два типи комплексів з різними молярними коефіцієнтами екстинкції, для тих же нуклеозидів і використовуючи ту ж базу даних було проведено розрахунки параметрів зв'язування по Моделі 2 при фіксованій величині місця зв'язування n₁=1. Отримані по Моделі 2 (програма оптимізації DALSMOD) значення параметрів зв'язування для цих нуклеозидів представлені в табл. 6.

Показано, що Модель 2 також досить добре описує концентраційні зміни спектрів сумішей ЕБ - ДНК - нуклеозид, З даних, наведених у табл. 5 і 6, також видно, що на величину константи зв'язування кожного з нуклеозидів з ДНК впливає структура гликозидних фрагментів нуклеозидів і їх конформація.

Таблиця 6. Оптимальні значення параметрів зв'язування нуклеозидів 6AZC, AZAfur і AZAxyl з ДНК, розраховані по Моделі 2 (програма оптимізації DALSMOD)

	6AZC	AZAfur	AZAxyl
K1, M-1	(1,3± 0,3)·104	(8,3±1,3)·103	(8,7± 1,5)·102
n1	1,0	1,0	1,0
n2	2,8±0,1	2,9±0,1	2,9±0,1

Оскільки розраховані величини місця зв'язування 6AZC, AZAfur і AZAxyl з тимусною (ГЦ ~ 42%) ДНК порядку однієї основи на молекулу нуклеозиду, це свідчить, по-перше, про відсутність АТ-, ГЦ- специфічності зв'язування цих лігандів з ДНК, а, по-друге, про те, що вони не є інтеркаляторами. Можна припустити, що комплексоутворення 6AZC, AZAfur і AZAxyl з ДНК відбувається за рахунок утворення водневого зв'язку між азо-групою нуклеозидів (атом азоту N₆ триазинових основ) і аміногрупами основ ДНК, з якими також взаємодіє і ЕБ, зв'язуючись з ДНК по типу класичної інтеркаляції. Також необхідно відзначити, що константа зв'язування 6AZC з ДНК, розрахована у відсутності конкуруючих лігандів, значно нижча (К₁=500 М^-1 [Гладковская Н.А. Спектрофотометрический анализ связывания биологически активных лигандов с молекулами ДНК. - Дисс. канд. физ. - мат. наук. - Харьков. - 2006.]), ніж в присутності ЕБ, тобто присутність в суміші ЕБ значно збільшує сродство 6AZC до ДНК, можливо, за рахунок зміни конформації ДНК при зв'язуванні.

У п'ятому розділі проведений спектрофотометричний аналіз зв'язування з ДНК двох лігандів, що поглинають у близьких областях спектру (Actіі з ДНК у присутності забарвлених лігандів-міток ЕБ і Хоехста 33258 (ХТ)). Для того, щоб порівняти параметри зв'язування Actіі з ДНК у відсутності та у присутності конкуруючих лігандів, ми провели розрахунки констант і величин місць зв'язування Actіі з ДНК по Моделі 3, використовуючи програму оптимізації DALSMOD. У табл. 7 наведені параметри зв'язування Actіі з ДНК у відсутності та у присутності конкуруючих лігандів, розраховані в програмі оптимізації DALSMOD по Моделі 3.

Таблиця 7. Параметри зв'язування Actіі з ДНК у відсутності та у присутності ЕБ і ХТ, розраховані в програмі оптимізації DALSMOD по Моделі 3

	ActII - ДНК	ActII - ДНК - ЭБ	ActII - ДНК - ХТ
К1, М -1	4,5Ч104	1,2Ч104	1,9Ч104
К2, М -1	2,8Ч105	1,3Ч104	2,0Ч105
n1, основ	3,2	1,5	1,3
n2, пар основ	6	3	10
щ	1-2	1	6

Як видно з таблиці, у присутності конкуруючих лігандів константи зв'язування Actіі з ДНК зменшуються для двох типів комплексів. Величина місця зв'язування Actіі в боріздці ДНК також зменшується як у присутності ЕБ, так і ХТ. Величина місця зв'язування Actіі з ДНК по типу інтеркаляції в присутності ЕБ зменшується, а в присутності ХТ, навпаки, збільшується. Проведені розрахунки ще раз підтверджують той факт, що Actіі зв'язується з ДНК мультимодально і за допомогою конкуруючих лігандів можна змінювати кількість кожного з комплексів Actіі з ДНК.

Рис. 1. Рівноважний склад сумішей Actіі - ДНК (а), Actіі - ДНК у присутності ЕБ (б) і Actіі - ДНК у присутності ХТ (в), розрахований у програмі оптимізації DALSMOD по Моделі 3. 1 - мономерно зв'язаний Actіі, 2 - агрегований Actіі, 3 - інтеркальований Actіі, 4 - вільний Actіі

Як видно з рис. 1, у присутності інтеркалятора ЕБ зменшується кількість інтеркальованого Actіі, а кількість Actіі, мономерно зв'язаного в боріздці, збільшується. У присутності ХТ, що зв'язується з ДНК у малій боріздці, зменшується кількість мономерно зв'язаного і збільшується кількість інтеркальованого Actіі. Також у присутності ЕБ зменшилося, а в присутності ХТ збільшилася кількість агрегованого на ДНК Actіі, що може свідчити про більш щільне упакування агрегованих на ДНК молекул Actіі в присутності ХТ, що зв'язується в малій боріздці ДНК.



ВИСНОВКИ

1. У ході виконання роботи було вивчено фізичні механізми конкурентного зв'язування різних комбінацій біологічно активних речовин з НК. Для цього була розроблена нова методика аналізу спектрів поглинання в потрійних системах БАР₁ - НК - БАР₂. Показано ефективність даної методики незалежно від області поглинання лігандів. Розроблена методика аналізу конкурентного зв'язування може бути використана для одержання параметрів комплексоутворення з нуклеїновими кислотами БАР, що не поглинають ні у видимій, ні в УФ областях спектру; для визначення типу зв'язування БАР з поліелектролітною матрицею; для врахунку впливу одної з конкуруючих БАР на зв'язування другої з нуклеїновою кислотою та ефектів сінергизму. Показано, що розроблений нами підхід є ефективним у випадку, коли конкуруючі БАР зв'язуються з ДНК різними способами та у випадку мультимодального зв'язування одної з БАР. Отримані у роботі дані можуть бути використані для аналіз взаємодії біологічно активних речовин з нуклеїновими кислотами та дослідження впливу конкуруючих речовин на біологічну активність препаратів ген-спрямованої дії.

2. Показано, що БАР, що мають слабку спорідненість до НК (наприклад, теофілін і кофеїн) впливають на зв'язування інших лігандів з НК тільки при великих концентраціях БАР. При цьому їхній вплив виявляється як за рахунок взаємодії БАР у розчині так і за рахунок безпосередньої конкуренції за місця зв'язування з НК. Показано, що теофілін є більш активним, чим кофеїн, акцептором ароматичних молекул у розчині, у той час, як константи зв'язування цих двох БАР з ДНК практично збігаються.

3. Визначено, що в деяких системах вплив конкуруючих БАВ зводиться в основному до конкуренції за місця зв'язування на НК і практично відсутня взаємодія БАР у розчині. Також показано, що конкуруюча дія може виявлятися навіть у випадку, коли механізми взаємодії БАР з НК різні. Аналіз таких взаємодій проведений на прикладі ряду систем біологічно активний нуклеозид - ДНК - бромистий етидій. Отримано константи зв'язування з ДНК біологічно активних нуклеозидів, азо-похідних цитидину. Показано, що ці БАР взаємодіють з ДНК у жолобі і не мають АТ- чи Гц-специфічністі зв'язування. Показано, що на відміну від теофіліну і кофеїну конкурентна дія нуклеозидів виявляється при їх концентраціях, приблизно рівних концентрації в суміші бромистого етидія.

4. Показано, що структура і конформація матриці нуклеїнової кислоти відіграє істотну роль при взаємодії з нею БАР. Наприклад, показано, що актиноциновое похідне Actіі зв'язується з одно- та двоспіральною полірибоцитидиловою кислотою тільки в жолобі з утворенням мономерно зв'язаних і агрегованих комплексів. З ДНК ж Actіі додатково утворює комплекс по типу інтеркаляції. Також показано, що кофеїн зв'язується з односпіральною poly(C) і практично не взаємодіє з двуспіральною.

5. Вперше отримано, що при зв'язуванні 6-азацитозіну рибофуранозіду з ДНК у присутності бромистого етидія константа утворення комплексу 6-азацитозіну рибофуранозіду з ДНК значно вище, ніж при його взаємодії з ДНК під час відсутності етидіуму броміду, тобто спостерігається ефект сінергізму (збільшення активності БАР у суміші).

6. На прикладі модельних систем Actіі - ДНК - бромистий етидій і Actіі - ДНК - Хоехст 33258 розроблена методика аналізу спектрів складних потрійних систем, у яких обоє БАР поглинають в одній чи близьких областях спектру. Розраховано параметри зв'язування Actіі з тимусною ДНК у присутності конкуруючих БАР різного типу (інтеркалятора бромистого етидія і Хоехста 33258, що зв'язується в малому жолобі ДНК). Показано, що Actіі зв'язується з тимусною ДНК мультимодально і за допомогою конкуруючих БАР можна змінювати співвідношення різних типів комплексів Actіі з ДНК і в такий спосіб впливати на його активність.



СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Круглова Е.Б., Ермак Е.Л. Исследование конкурентного связывания двух лигандов: актиноцинового антибиотика и кофеина с ДНК // Вестник Харьковского университета. Биофизический вестник. - 2003. - Вып.1(12) - С.64 - 69.

2. Круглова Е.Б., Ермак Е.Л. Конкурентное связывание двух лигандов: актиноцинового производного и кофеина с полирибоцитидиловой кислотой в разных конформационных состояниях // Вестник Харьковского университета. Биофизический вестник. - 2004. - Вып.1-2(14) - С.32-37.

3. Ермак Е.Л., Круглова Е.Б. Влияние конкурирующих лигандов разного типа на связывание актиноцинового производного ActII с ДНК // «Вестник СевГТУ» (Физика и математика). - 2005. - т.70. - С. 118 - 126.

4. Ермак Е.Л., Круглова Е.Б. Связывание теофиллина с тимусной дНК в присутствии конкурирующих лигандов // Биофизический вестник. - 2007. - Вып.2 (19). - С. 13 - 19.

5. Iermak Ie.L., Kruglova O.B., Palchykovska L.H., Alexeeva I.V. Spectrophotometrical study of mechanisms of binding of cytidine analogues and ethidium bromide with DNA // Вiopolymers and cell. - 2007. - v. 23. - № 6. - Р. 529 - 536.

6. Ermak E.L., Kruglova E.B. Spectrophotometric investigation of competitive binding of two ligands: actinocin antibiotic and caffeine to DNA // Proc. of the XVI International School-Seminar Spectroscopy of Molecules and Crystals XVI ISSSMC. - Sevastopol, Ukraine. - 2003. - P.295.

7. Ermak E.L., Kruglova E.B. Thermodynamic characteristics of interaction in three-component systems: DNA-ligand-caffeine in aqueous solutions // Abstr. Of The 2^nd International Conf. Physics of Liquid Matter: Modern Problems PLM MP. - Kyiv, Ukraine. - 2003. - P.171.

8. Ermak E.L., Kruglova E.B., Maleev V. Ya. investigation of competitive binding of biologically active ligands to nucleic acids // Тези 1 Української наукової конференції Проблеми біологічної і медичної фізики ПБМФ - 2004. - Харків, Україна. - 2004. - С. 54.

9. Ermak E.L., Kruglova E.B. investigation of competitive binding of biologically active ligands with calf thymus DNA in aqueous solution // 3^rd International Conference Physics of Liquid Matter: Modern Problems PLM MP. - Kyiv, Ukraine. - 2005. - P.191.

10. Ермак Е.Л., Круглова Е.Б. связывание актиноцинового производного ActII с ДНК в присутствии бромистого этидиума и Хоехста 33258 // Материалы Всеукраинской научно-технической конференции студентов, аспирантов и молодых ученых актуальные вопросы теоретической и прикладной физики и биофизики “Физика. Биофизика - 2005”.Севастополь, Украина. - 2005. - С. 62.

11. Ermak E.L., Kruglova E.B. Binding of the new actinicine derivative ActII to calf thymus DNA in the presence of competing ligands // Proceedings of the 8^th Romanian Biophysics Conference with international participation "Advanced Biomaterials and Biophysical Techniques. Iasi, Romania. - 2005. - P.126-127.

12. Ermak E.L., Kruglova E.B. New aspects of ethidium bromide interaction with calf thymus DNA // П'ята Харківська конференція молодих науковців. Радіофізика та НВЧ електроніка. - Харків, Україна. - 2005. - С.103.

13. Iermak Ie.L., Kruglova O.B., Bolbukh T.V. binding modes of ethidium bromide to calf thymus DNA // Proceedings of the Workshop on the Structure and Function of Biomolecules II 2006. Bedlewo, Poland - 2006. - P. 68.

14. Iermak Ie.L., Kruglova O.B. Study of actinocine derivative and ethidium bromide competitive binding to calf thymus DNA // VII Kharkiv Young Scientist Conference on “Radiophysics and Electronics”. - Kharkiv, Ukraine. - 2007. - P.39.

15. Ермак Е.Л., Круглова Е.Б. Сравнительный анализ взаимодействия взаимодействия теофиллина и кофеина с тимусной ДНК в присутствии конкурирующих лигандов // IV Всеукраинская научно-техническая конференция актуальные вопросы теоретической и прикладной биофизики, физики и химии “БФФХ - 2008”. Севастополь, Украина. - 2008. - С.152 - 153.

16. Ермак Е.Л., Круглова Е.Б. Методика анализа конкурентного связывания двух лигандов с нуклеиновыми кислотами // 1-а Всеукраїнська наукова конференція молодих вчених Фізика низьких температур КМВ-ФНТ-2008. - Харків, Україна. - 2008. - С.102.

17. Iermak Ie.L., Kruglova O.B. Study of ethidium bromide binding to calf thymus DNA in presence of competing ligands in aqueous solution // 4^th International Conference Physics of Liquid Matter: Modern Problems PLM MP. - Kyiv, Ukraine. - 2008. - P.206.

Размещено на Allbest.ru

...