Ca2+, H+ - залежна регуляція кінетичних характеристик скорочення гладеньких м’язів та її модуляція оборотними ефекторами

Размещено на http://www.allbest.ru/

Київський національний університет імені Тараса Шевченка

УДК 577.353.2: 577.325.2

03.00.02 - біофізика

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Ca2+, H+ - залежна регуляція кінетичних характеристик скорочення гладеньких м`язів та її модуляція оборотними ефекторами

Бориско Петро Олександрович

Київ-2009

Дисертацією є рукопис.

Роботу виконано в Київському національному університеті імені Тараса Шевченка

Науковий керівник: доктор фіз.-мат. наук, професор Прилуцький Юрій Іванович, Київський національний університет імені Тараса Шевченка, завідувач науково-дослідної лабораторії фізичного факультету

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор Сиволоб Андрій Володимирович, Київський національний університет імені Тараса Шевченка, біологічний факультет, професор кафедри загальної та молекулярної генетики

кандидат біологічних наук Голуб Андрій Григорович Інститут молекулярної біології і генетики НАН України, науковий співробітник відділу комбінаторної хімії

Захист дисертації відбудеться "27" січня 2010 року о 1400 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.001.38 у Київському національному університеті імені Тараса Шевченка (проспект академіка Глушкова, 2, біологічний факультет).

Поштова адреса: 01601, Київ, вул. Володимирська, 64.

З дисертацією можна ознайомитись у науковій бібліотеці Київського національного університету імені Тараса Шевченка за адресою: 01601, Київ, вул. Володимирська, 58.

Автореферат розісланий 25грудня 2009 року.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради О. В. Цимбалюк



Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Актуальною проблемою біофізики гладеньких м`язів (ГМ) є з'ясування механізмів їх скорочення-розслаблення - основи функціональної активності вісцеральних органів. Успішне вирішення цієї проблеми є необхідним для розуміння фундаментальних механізмів, які лежать в основі роботи ГМ, а також відкриває реальні перспективи подальшої розробки підходів для їх корекції за різних патологій.

Вкрай важливими, але, в силу складності організації скорочувальних систем, мало дослідженими є механізми модуляції різними чинниками регуляторних процесів скорочення ГМ (Bolton et al. 2003; Шуба, та ін. 2005). Також, поряд з експериментальними методами, дослідження цієї проблеми не є в повній мірі ефективним без застосування математичного моделювання. Теоретичні методи дозволяють за умови чіткого визначення меж системи та використання вже існуючих експериментальних даних проводити розрахунки і дослідження функціонування ГМ, зокрема, Ca2+-залежного контролю їх скоротливої активності, дії оборотних ефекторів (інгібіторів чи активаторів), іонів водню (Н+) та штучних інгібіторів на ферментативну, а також транспортну активність білків ГМ.

Відомо, що зміна вмісту в клітині іонів Са2+, які є ключовим чинником у процесах регуляції скорочення-розслаблення ГМ, обумовлена взаємодією трансмембранних кальцієвих потоків. Існує кілька методів кінетичного аналізу для встановлення закономірностей процесу скорочення-розслаблення ГМ, які включають кількісний емпіричний опис повної механокінетичної кривої чи її окремих фрагментів. Втім, на молекулярному рівні повний цикл скорочення-розслаблення ГМ є адитивним процесом, який складається із транспортних процесів, що відповідають суто фазі скорочення та суто фазі розслаблення, які реалізуються у "паралельному" (у часовому аспекті) Са2+-залежному режимі. Костеріним зі співавторами (2002) розроблено та апробовано в експерименті феноменологічну механокінетичну модель скоротливої відповіді ГМ. У розвиток ідей, покладених в основу цієї моделі, тими ж авторами (2002) була запропонована модель транссарколемального транспорту іонів Са2+ у гладенько-м'язовій клітині (ГМК), яка і була покладена в основу запропонованої нами математичної моделі, що описує вплив не лише такого важливого регулятора кількості Са2+ у міоплазмі як плазматична мембрана (ПМ), але й враховує інший важливий фактор - ендоплазматичний ретикулум (ЕПР) ГМК.

Значний науковий інтерес має також вивчення питання щодо участі в механізмах збудження та гальмування в ГМ ефекторів, які шляхом зв`язування та подальшої зміни ферментативної активності різних ланок регуляції гомеостазу в ГМ модулювали б їх роботу. У цьому сенсі корисним щодо оцінки характеру впливу ефекторів на ферментативні чи транспортні системи ГМ є запропонований нами новий підхід відносно розрахунку універсальних кінетичних характеристик.

Одним з найважливіших чинників, який може приводити до змін у скорочувальній системі м`язів, є концентрація іонів Н+ у цитоплазмі, зміни рівня якої, в силу різних причин, можуть викликати порушення у функціонуванні ГМ. Тому актуальною задачею є побудова моделей, які б адекватно описували роль іонів водню у регуляції гомеостазу в ГМК.

Відомо, що значну кількість патологій, пов`язаних з функціонуванням ГМ, можна корегувати, знижуючи ферментативну активність міозину, зокрема, його АТФ-азну активність. Пошук нових високоафінних специфічних ефекторів, які б оборотно зв`язувались та інгібували АТФ-азну активність міозину, є альтернативним перспективним підходом щодо вирішення проблеми регуляції скорочення-розслаблення ГМ.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами.

Робота виконувалася на кафедрі біофізики біологічного факультету Київського національного університету імені Тараса Шевченка в рамках науково-дослідної програми „Дослідження та моделювання молекулярних та клітинних процесів у збудливих біологічних системах”, № держреєстрації 01010001967.

Мета і завдання дослідження. Мета роботи полягає в тому, щоб з використанням методів математичного та молекулярного моделювання побудувати математичні моделі Са2+ - регульованого впливу та дії оборотних ефекторів (інгібіторів чи активаторів), включаючи іони водню, на ферментативну і транспортну активність білків ГМ.

Для досягнення поставленої мети вирішували такі завдання:

1. Врахувати в рамках математичної моделі Са2+ - залежного контролю механічної напруги ГМ вплив на внутрішньоклітинний кальцієвий профіль роботи Mg2+ АТФ - залежної кальцієвої помпи ЕПР і ПМ та запропонувати пояснення механізму дії білку А стафілококу на скорочувальну активність ГМ. математичний ефектор водень ферментативний

2. Розробити новий математичний підхід до кінетичної характеристики дії оборотних ефекторів на ферментативну (транспортну) активність білків ГМ із застосуванням коефіцієнтів інгібування чи активації.

3. Провести математичне моделювання, яке описує хід АТФ-гідролазної біохімічної реакції при зміні рівня рН у ГМК. Надати кінетичне тлумачення лінійної pН-залежності активності „базальної” Mg2+ АТФ-ази у фракції сарколеми міометрія.

4. Застосувати методи молекулярного моделювання для пошуку нових штучних інгібіторів АТФ-азної активності міозину.

Об'єкт дослідження: гладенькі м`язи.

Предмет дослідження: кінетика роботи транспортних і скоротливих білків гладеньких м`язів.

Методи дослідження: теоретичні методи фізичної кінетики та біофізики (побудова систем диференціальних рівнянь для аналізу складних біологічних систем), методи молекулярного моделювання та експериментальні методи дослідження кінетики ферментативних реакцій.

Наукова новизна одержаних результатів. Застосування запропонованої моделі для дослідження механізмів зміни концентрації Са2+ у міоплазмі за допомогою речовин, що зв`язуються з транспортуючими Са2+ білками і модулюють їх активність, є важливим кроком до встановлення біофізичних та біохімічних закономірностей роботи ГМ. В рамках розглянутої математичної моделі розкрита роль білку А стафілококу у модуляції тензометричних характеристик ГМ та показано, що важливим фактором Са2+ - залежного контролю скоротливої відповіді ГМ є регуляція транспортної активності Mg2+ АТФ - залежної кальцієвої помпи ЕПР і ПМ.

Запропонований новий підхід щодо універсальної кінетичної характеристики дії оборотних ефекторів на ферментативну та транспортну активність білків, який базується на визначенні значень коефіцієнтів модифікації, а також ефекторної константи (інгібування та активації). Проілюстровано застосування цього підходу на прикладі дії еозину Y на ферментативну активність Ca2+, Mg2+ АТФ-ази ГМ.

Проведене математичне моделювання дало можливість описати особливості взаємодії міозину ГМ з чотирма іонами водню, що поглиблює уявлення про вплив рівня pH на процес м'язового скорочення. Запропоновано кінетичне пояснення лінійної pH-залежності ферментативної активності „базальної” Mg2+ АТФ-ази ГМК.

У результаті проведеного молекулярного моделювання знайдені сполуки, які мають високий рівень передбачуваної спорідненості до міозину і, на нашу думку, можуть слугувати конкурентними інгібіторами його АТФ-азної активності.

Запропоновані теоретичні моделі в цілому добре описують наявні експериментальні дані і вперше пояснюють цілий ряд експериментальних фактів.

Практичне значення одержаних результатів. Зазначено доцільність використання запропонованої математичної моделі для дослідження і прогнозування результатів впливу на молекулярні механізми роботи ГМ різного роду факторів, що модулюють значення базових кінетичних констант Mg2+ АТФ - залежної кальцієвої помпи ПМ і ЕПР.

Новий підхід щодо кінетичної характеристики дії оборотних ефекторів на ферментативну і транспортну активність білків може бути корисним у дослідах з ензимології, а також біохімії та біофізики мембран при ідентифікації механізму дії ефектора, оцінці його реальної спорідненості до білкової макромолекули.

Дано кінетичне обґрунтування регуляторної ролі іонів Н+, як фактора негативного оберненого зв'язку, що контролює ферментативну активність „базальної” Mg2+ АТФ-ази, локалізованої у ПМ ГМК.

Знайдено нові, не описані в літературі речовини, які можуть слугувати інгібіторами АТФ-азної активності міозину і бути використані у подальшому для синтезу та тестування in vitro аналогів найбільш активних сполук з метою розробки відповідних нових фармакологічних препаратів.

Особистий внесок здобувача. Здобувач опрацював наявну літературу з теми дослідження і проаналізував сучасний стан проблеми (роботи [1-7]), розробляв теоретичні моделі в роботах [1-7], проводив аналіз та інтерпретацію одержаних результатів (роботи [1-7]), а також експерименти в роботах [2, 3], займався написанням доповідей на конференції та наукових статей (роботи [1-7]), проводив побудову та дослідження математичних моделей [3, 4] і молекулярне моделювання та комп`ютерні розрахунки у роботах [1, 2].

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертаційної роботи доповідалися на Молодіжній конференції з молекулярної біології (Київ, 2003), II-му міжнародному симпозіумі „Фізіологія та біофізика гладеньких м'язів” (Київ, 2003), І-й Українській науковій конференції “Проблеми біологічної і медичної фізики” (Харків, 2004), IV-му з`їзді УБФТ (Донецьк, 2006), ІІІ Всеукраїнській науковій конференції, присвяченій 70-річчю з дня народження Г.М. Чайченка “Психофізіологічні та вісцеральні функції в нормі і патології” (Київ, 2006), а також на наукових семінарах відділу молекулярної та квантової біофізики Інституту молекулярної біології та генетики НАН України, кафедри біофізики біологічного факультету Київського національного університету імені Тараса Шевченка [8-12].

Публікації. За темою дисертації опубліковано 12 наукових праць, з них - 7 статей у фахових журналах та 5 тез доповідей у збірниках матеріалів з'їздів і конференцій.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається зі вступу, огляду літератури, експериментальної і теоретичної частин, висновків і списку використаних джерел. Загальний обсяг дисертації складає 117 сторінок, містить 20 рисунків і 4 таблиці. Список використаних джерел складає 129 найменувань.

Основний зміст роботи

Матеріали і методи досліджень. АТФазну активність білків вимірювали при 37 оС за високої та низької іонної сили в середовищі (загальний об'єм - 1,8 мл) з такими концентраціями: для актоміозинової АТФази - 5 мМ MgCl2, 100 мкМ CaCl2, 1 мМ АТФ, 0,05 М KСl, 0,5 мМ ДТТ, 20 мМ імідазол, рН 7,5, 0,28 мг/мл білку; для міозинової АТФази - 2,5 мМ MgCl2, 5 мМ CaCl2, 1 мМ АТФ, 0,5 або 0,05 М KСl, 1 мМ ЕДТА, 0,5 мМ ДТТ, 20 мМ імідазолу, рН 7,5, 0,14 мг/мл білку. При дослідженні рН-залежності Са2+-АТФазної активності міозину використовували такі буферні розчини: 20 мМ оцтова кислота в області слабкокислих значень рН, трис-НСl в зоні нейтральних та слабколужних значень рН, гліцин-NаОН в зоні лужних рН. При вивченні впливу іонів металів на АТФазну активність міозину та АМ ці катіони (у вигляді хлоридів) у відповідних концентраціях додавали до середовища інкубації. Кількість утвореного під час гідролізу АТФ неорганічного фосфату вимірювали за методом Фіске-Суббароу.

При побудові математичних моделей впливу деяких лігандів (оборотних ефекторів, іонів кальцію, рівня pH) на скорочення ГМ були отримані системи нелінійних диференціальних рівнянь, які розв'язувалися чисельно з використанням програмного пакету “Mathematica”.

Графічний аналіз результатів було проведено за допомогою пакету Microcal Origin.

Для передбачення фармако-кінетичних властивостей досліджуваних речовин була використана модифікована програма QikProp з пакету Schrodinger. Підготовка бази лігандів проводилась за допомогою програми LigPrep з того ж самого пакету.

Усі процедури докінгу проводили за допомогою програмного пакету QXP/Flo+. Для докінгу була обрана 3-D структура S1 фрагмента міозину (PDB код 1KWO, роздільна здатність відбитку рентгена 3.8 А). Для створення моделі сайту зв`язування білка мішені використовували вбудовані інструменти програмного пакету QXP/Flo+. Відбір оптимальних результатів проводили як за геометричними показниками положення ліганду в центрі зв`язування “білок-ліганд” комплексу, так і за енергетичними показниками, використовуючи вбудовані в програмі QXP функції розрахунку енергії зв`язування в “білок-ліганд” комплексі.

Результати досліджень та їх обговорення. Математична модель Ca2+ - залежного контролю скоротливої активності ГМ, на основі якої проаналізована можливість модифікації важливих параметрів внутрішньоклітинного кальцієвого гомеостазу та механічної відповіді, базується на використанні закону діючих мас та наступних положеннях.

1) За умов дії збуджувального фактору збільшення концентрації іонів Са2+ у міоцитах (mi) відбувається за рахунок запасу іонів Са2+, що надходять у саркоплазму за градієнтом концентрації внаслідок активації кальцієвих каналів ПМ та ЕПР - головного кальцієвого депо ГМК. Проте підвищення концентрації цих іонів у цитоплазмі призводить не лише до активації скоротливого процесу, але й до так званої "Са2+ - залежної інактивації" цих каналів, що супроводжується зменшенням їх проникності для іонів Са2+. Припускається, що процес Са2+ - залежної інактивації підпорядковується оборотному механізму



де X - кальцієвий канал ПМ (чи мембрани ЕПР), який знаходиться в активованому (здатному до проведення іонів Са2+) стані; Са2+i - цитоплазматичний кальцій; XCa2+i - кальцієвий канал ПМ (чи мембрани ЕПР), який знаходиться в інактивованому стані внаслідок адсорбції іонів цитоплазматичного кальцію на внутрішній поверхні ПМ (чи зовнішній поверхні мембрани ЕПР); k1 (чи k2) та k-1 (чи k-2) - константи швидкості адсорбції та десорбції іонів цитоплазматичного кальцію на кальцієвому каналі з боку внутрішньої поверхні ПМ (чи зовнішньої поверхні мембрани ЕПР), відповідно.

Згідно з реакцією (1) та з урахуванням процесу Са2+ - залежної інактивації провідності каналу, кінетика зміни миттєвої концентрації вільного Са2+ у цитоплазмі mi, як результат функціонування кальцієвих каналів ПМ і ЕПР, буде описуватися такою системою диференціальних рівнянь:

(dmi/dt)кан = B(me - mi)?(t)+ L(mret - mi)л(t),

d?(t)/dt = k-1??(t) - k1mi?(t),

dл(t)/dt = k-2 л*(t) - k2miл(t),

причому

?(t) + ?*(t) = 1,

л(t) + л*(t) = 1

Тут (dmi/dt)кан - миттєва швидкість збільшення концентрації вільного Са2+ у цитоплазмі за рахунок функціонування кальцієвих каналів ПМ та ЕПР; B - константа швидкості транссарколемального руху іонів Са2+ в міоцити кальцієвими каналами, L - константа швидкості руху іонів Са2+ з ЕПР; me - концентрація іонів Са2+ у позаклітинному просторі, mret - концентрація іонів Са2+ у цистернах ЕПР; ?(t) (чи л(t)) та ?*(t) (чи л*(t)) - відносна миттєва кількість кальцієвих каналів ПМ (чи ЕПР), що знаходяться в активованому та Са2+ - залежному інактивованому станах, відповідно.

2) В основі активного зменшення концентрації іонів Са2+ в саркоплазмі є функціонування Mg2+, АТФ - залежних кальцієвих помп сарколеми та ЕПР. За стаціонарних умов кінетичний режим роботи цих транспортних систем як Са2+, Mg2+ - залежного АТФ - гідролазного ферментативного комплексу описується (стосовно іонів Са2+) рівняннями Міхаеліса-Ментен

(dmi/dt)помп1 = - Vmax1mi/(Km1 + mi),

(dmi/dt)помп2 = - Vmax2mi/(Km2 + mi),

де (dmi/dt)помп1 і (dmi/dt)помп2 - миттєві швидкості зменшення концентрації вільного Са2+ у цитоплазмі за рахунок функціонування Mg2+, АТФ - залежної кальцієвої помпи ПМ та ЕПР, відповідно; Km1 і Km2 - константи Міхаеліса стосовно іонів Са2+ (у певному наближенні - показники спорідненості іонів Са2+ до цих транспортних систем); Vmax1 і Vmax2 - максимальні швидкості функціонування цих транспортних систем ("число обертів" кальцієвої помпи відповідає кінетичному режиму транспорту за умов насичення її субстратом переносу).

3) Відповідно до принципу суперпозиції трансмембранних кальцієвих потоків, які наведені вище, значення сумарної швидкості зміни концентрації вільного кальцію у цитоплазмі збудженої ГМК (dmi/dt) буде зумовлене адитивністю парціальних швидкостей дифузійного надходження іонів Са2+ у міоцити за кальцієвими каналами ПМ та ЕПР (dmi/dt)кан, вивільнення Са2+ у позаклітинний простір за рахунок функціонування Mg2+, АТФ - залежної кальцієвої помпи сарколеми (dmi/dt)помп1; активного транспорту Са2+ в ЕПР за рахунок роботи Mg2+, АТФ - залежної кальцієвої помпи (dmi/dt)помп2: dmi/dt = (dmi/dt)кан + (dmi/dt)помп1+ (dmi/dt)помп2, або у розгорнутій формі:

dmi/dt =B(me - mi)и(t) + L(mret - mi)л(t) - Vmax1mi/(Km1+ mi) - Vmax2mi/(Km2+mi).

4) Значення сумарної швидкості зміни концентрації вільного кальцію в ЕПР збудженої ГМК dmret/dt буде зумовлене адитивністю парціальних швидкостей дифузійного надходження іонів у міоплазму L(mret - mi)л(t) з ретикулуму та їх активного транспорту до цистерн ЕПР за рахунок функціонування Mg2+ АТФ - залежної кальцієвої помпи:

dmret/dtt = Vmax2mi/(Km2+mi) - L(mret - mi)л(t).

В цілому, запропонована математична модель добре описує типову реальну часову залежність, яка властива для внутрішньоклітинного кальцієвого транзієнту та зміни механічної напруги у випадку ГМ (Рис.1, a): спостерігаються фаза зростання, амплітудне значення та фаза спаду кальцієвого сигналу та механічної відповіді, що реалізуються за умов використання у розрахунках початкових умов, наведених вище, у реальному фізіологічному (щодо величини концентрації mi вільного Са2+ у міоплазмі та протіканні у часі) режимі.

В рамках цієї моделі добре відтворюється динаміка зміни концентрації іонів Са2+ в ЕПР під час скорочення-розслаблення ГМ (Рис. 1, б): тестуються фаза вивільнення кальцію з ЕПР, мінімальний рівень концентрації іонів Са2+, фаза накопичення кальцію в ЕПР і вихід на базальний рівень.

При збільшенні концентрації вільного Са2+ у міоплазмі він оборотно зв'язується з регуляторним білком Б (кальмодуліном (КМ)). Була досліджена залежність сили скорочення м`язу від концентрації «Ca2+-КМ» комплексу щ(t) + щ*(t) = 1, де щ(t) - миттєва відносна концентрація вільного (не зв'язаного з іонами Са2+) КМ.

де БCa2+i - комплекс "Са2+ - КМ", k3 та k-3 - константи швидкості адсорбції та десорбції іонів Са2+ на КМ, відповідно.

Вважається, що за ізометричних умов миттєва механічна напруга ГМ F(t) пропорційна миттєвій відносній концентрації комплексу "Са2+ - КМ" щ*(t)

F(t) = D щ*(t),

де D - коефіцієнт пропорційності (відповідає гіпотетичній максимальній величині м'язової напруги за умов повного насичення КМ іонами Са2+). Були проаналізовані особливості зміни механокінетичних залежностей нормованої сили F(t)/D=щ*(t) за умов модифікації "паспортних" (відносно іонів Са2+) характеристик Mg2+ АТФ - залежної кальцієвої помпи ПМ та ЕПР - константи Міхаеліса Km і максимальної швидкості транспортного процесу Vmax (Рис. 2). Отже, зміна числа обертів та спорідненості щодо іонів кальцію Mg2+ АТФ - залежної кальцієвої помпи ПМ та ЕПР суттєво впливає на профіль механокінетичної кривої скорочення-розслаблення ГМ.

Результати моделювання (Рис. 3, а) були порівняні з експериментом (Костерін та ін. 2001) з модуляції профілю механокінетичних кривих гіперкалієвої контрактури (80 ммоль/л) за присутності ряду концентрацій (10-3 - 10-1 мг/мл) білку А стафілококу (Рис. 3, б).

Зміни модельної механокінетичної кривої, які спостерігаються за умови зменшення спорідненості субстрату, якісно добре відтворюють експеримент з дії ефектора на досліджувану систему, що дозволяє зробити наступне припущення щодо природи і механізму його дії.

Як бачимо, внесення до системи ефектора (білку А стафілококу) у початковій концентрації 10-3 мг/мл і її подальше збільшення якісно добре співпадає з модельним збільшенням величини Km ЕПР. Отже, доцільно припустити, що білок А стафілококу може впливати на певний компонент системи, який безпосередньо бере участь у скороченні. В рамках запропонованої моделі найвірогіднішою мішенню є Mg2+, АТФ - залежна кальцієва помпа ЕПР, відносно якої білок А стафілококу є конкурентним (щодо іонів Ca2+) інгібітором.

Новий підхід до кінетичної характеристики дії оборотних ефекторів на ферментативну (транспортну) активність білків із застосуванням коефіцієнтів інгібування чи активації базується на визначенні таких параметрів ферментативного (транспортного) процесу, як:

- класичних констант V0, max (максимальної швидкості ферментативного процесу) та KS (субстратної константи);

- уявних констант <V0, max> та <Km> (за однакової фіксованої концентрації ефектора [E]0);

- коефіцієнту інгібування i0,5 (у випадку дії оборотного інгібітора) чи коефіцієнту активації а0,5 (у випадку дії оборотного активатора) (за однакової фіксованої концентрації субстрату S0).

Алгоритм розрахунку вище зазначених кінетичних параметрів такий:

1. Провести експеримент з каталітичного титрування ферменту (транспортної системи) субстратом ферментативного перетворення (транспортного процесу) у відсутності та присутності оборотного ефектора (у фіксованій концентрації е0). З одержаних графічних залежностей розрахувати стандартні кінетичні параметри: у відсутності ефектора - V0,max та KS; за присутності ефектора за даної концентрації е0 - <V0,max> та <Km>.

2. Провести експеримент із титрування ферменту (транспортної системи) оборотним ефектором, використовуючи субстрат у фіксованій концентрації S0. З одержаної графічної залежності розрахувати значення коефіцієнту інгібування i0,5 (при дії інгібітора) чи коефіцієнту активації а0,5 (при дії активатора).

3. Розрахувати ефективні відносні параметри: = <V0,max>/V0,max та = <Km>/KS (за даної концентрації ефектора е0), а також xs=KS/S0 (S0 - концентрація субстрату, яка використовувалась у дослідах із титрування білка ефектором) та yi=i0/i0,5 - за дії інгібітора чи yА=а0/а0,5 - за дії активатора (i0 чи а0 - концентрація інгібітора чи активатора, яка використовувалась у дослідах із титрування білка субстратом).

4. Розрахувати значення коефіцієнтів модифікації б і в та константи інгібування Ki (при вивченні дії оборотного інгібітора):

І, відповідно, використати такі формули при вивченні дії оборотного активатора:



Очевидно, що критерієм коректності визначення значень коефіцієнтів модифікації б і в та ефекторної константи Kе (константи інгібування Кi чи константи активації Kа) є незалежність їх величин від концентрацій ефектору E0 та субстрату S0, які використовували у дослідах.

Як приклад, цей підхід був використаний для з`ясування кінетичних закономірностей дії еозину Y (2',4',5',7'-тетрабромофлуоресцеїну) -оборотного інгібітору Mg2+-залежних АТФ-гідролазних ферментативних систем на Ca2+-транспортуючу АТФ-азу (Ca2+, Mg2+ АТФ-азу), що була солюбілізована з ПМ клітин міометрію (експерименти з каталітичного титрування еозином Y солюбілізованої високоочищеної транспортної Ca2+, Mg2+ АТФ-ази були проведені у відділі біохімії м`язів Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України к.б.н. Н.М. Слінченко).

В рамках концепції субстратного протектування проаналізована роль ефекторів ферментативної активності міозину, що важливо для дослідження функціонування ГМ в цілому.

Вплив іонів H+ на функціонування ГМ. При вивченні рН залежності ферментативної активності „базальної” Mg2+ АТФ-ази співавторами було знайдено, що в режимі визначення початкової швидкості реакції гідролізу АТФ V0 у діапазоні значень рН 6,0-8,0 ця залежність не є типовою куполоподібною, а характеризується лінійністю.

Узагальнений кінетичний аналіз рН-залежності ферментативної активності доцільно проводити у термінах так званих “рН-функцій Міхаеліса”, які описують вплив концентрації іонів Н+ на початкову швидкість ферментативної реакції V0 відповідно до найпростішого „мінімального” механізму, що базується на ідеї щодо існування шістьох іонізаційних станів ферменту F (три - у відсутності субстрату S та три - за його наявності)

де F2-, FH- та FH2 - депротонований, монопротонований та біпротонований стани активного центру ферменту відповідно (молярні концентрації a, с та е, відповідно), а [F2-]S, [FH-]S та [FH2]S - депротонований, монопротонований та біпротонований стани фермент-субстратного комплексу, відповідно (молярні концентрації b, d та f відповідно та сумарна концентрація f0); Ка, Кb та К'а, К'b - константи іонізації для відповідних рівноважних стадій „протонування - депротонування” ферменту; г та щ - так звані кінетичні коефіцієнти модифікації (безрозмірні), які характеризують значення константи швидкості першого порядку (“числа обертів”) для стадій розкладу фермент-субстратних комплексів [F2-]S та [FH2]S, відповідно, у напрямку звільнення продукту реакції Рі порівняно зі стадією розкладу фермент-субстратного комплексу [FH-]S, для якою є властивою константа швидкості k2; Ks, K's та K''s - рівноважні субстратні константи, які характеризують спорідненість субстрату S до ферменту у депротонованому F2-, монопротонованому FH- та біпротонованому FH2 станах, відповідно.

Відповідно до закону діючих мас, вираз для початкової швидкості ферментативної реакції V0, згідно зі схемою (19), має вигляд: V0 = гk2b + k2d + щk2f = k2(гb + d + щf). Кінцеве рівняння для залежності V0 від початкової концентрації субстрату S0 має вигляд класичного (стосовно субстрату S) рівняння Міхаеліса - Ментен але містить ефективні константи - уявну максимальну швидкість ферментативної реакції <V0,max> та уявну константу Міхаеліса <Km>, які є складними функціями багатьох змінних, таких як константи іонізації Ка, Кb та К'а, К'b; кінетичні коефіцієнти модифікації г та щ; концентрації іонів H+ та субстратної константи. Підстановкою цих виразів у формулу (20) для залежності початкової швидкості V0 ферментативної реакції Mg2+-залежного гідролізу АТФ від концентрації іонів H+ h, з урахуванням умов

де x=Ks/S0 - нормована (на початкове значення концентрації субстрату) величина субстратної константи, отримуємо гіперболічну залежність V0(h), яка є ідентичною лінійній залежності у координатах [V0; pH]:

На рис.4 наведені експериментальні значення V0(h) (позначені зірочками) та крива, що була розрахована за формулою (22). Як бачимо, теоретичний розрахунок дає дуже добре співпадіння з експериментальними даними з дослідження ферментативної активності “базальної” Mg2+ АТФ-ази, які були проведені у відділі біохімії м`язів Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України к.б.н. Т.О. Векліч.

Враховуючи експериментальні дані, а саме значення V0(h) у трьох експериментальних точках за різних значень рН - при концентраціях іонів H+ h=10-6, 10-7 і 10-8 М, а також експериментально встановлені значення величини k2f0 =V0,max=28 мкмоль Pi/мг білка за 1 год та x=Ks/S0=0,034<<1, однозначно знаходимо з виразу (22) три невідомі параметри:

б 200,

Ka=10-8,5 M,

г=0,8.

Якщо проаналізувати відомі значення pK для амінокислотних залишків, можна прийти до висновку, що одержана величина Ka відповідає або б-аміногрупі, або сульфгідрильній групі в цистеїні.

Отже, причина того, що зі збільшенням рН має місце лінійне зростання ферментативної активності “базальної” Mg2+ АТФ-ази сарколеми полягає у наступному: при зменшенні концентрації іонів H+ в діапазоні рН 6-8 зсувається рівновага в напрямку дисоціації монопротонованого стану ферменту [FH-] до його депротонованого стану F2-. Тоді схема реакції (19) може бути трансформована таким чином:

Відповідно до схеми (23) можна стверджувати, що причина лінійності рН-залежності ферментативної активності “базальної” Mg2+-АТФ-ази сарколеми ГМ полягає у тому, що іон водню є конкурентним інгібітором цього ферменту.

Для міозину ГМ шлунка свині нами було виявлено два максимуми АТФ-азної активності в залежності від рівня рН середовища, а саме при рН 6,0 та 9,3 та мінімум при рН 8,5 (Рис. 5). Класична схема, яка описує механізм взаємодії ферментативного білка з двома іонами Н+, призводить до появи єдиного локального максимуму на кривій залежності максимальної швидкості ферментативної реакції гідролізу АТФ від рівня рН. Тому можна припустити, що участь чотирьох іонів водню у такому ферментативному процесі ініціюватиме появу двох локальних максимумів.

Залучення до схеми реакції закону діючих мас разом із принципом незалежного протікання реакцій дає змогу записати залежність значення уявної, тобто залежної від ефектора, а не від субстрату, максимальної швидкості ферментативної реакції від парамету h=10-pH:

Аналіз рівняння (24) засвідчив, що максимальна швидкість ферментативної реакції , як функція рН, може мати три дійсних додатних локальних екстремуми, а саме єдиний мінімум та два максимуми (Рис. 6). Отже, одержана теоретична крива в рамках запропонованої кінетичної моделі задовільно відтворює результати експерименту: тестується фаза зростання до деякої максимальної точки (рН=8), далі - фаза спадання до мінімуму (рН=8,8) і знову зростання до максимуму (рН=9,5) з подальшим спаданням кривої.

Пошук штучних інгібіторів АТФ-азної активності міозину методами молекулярного моделювання. Серед штучно синтезованих речовин проводився відбір тих, які з найбільшою вірогідністю інгібуватимуть АТФ-азну активність міозину, впливаючи, таким чином, на скорочення м`язу.

Для відбору потенційних інгібіторів АТФ-азної активності міозину була використана база з 400000 комерційно доступних органічних сполук. Для докінгу була обрана 3-D структура S1 фрагмента міозину (PDB код 1KWO, роздільна здатність 3,8 Е). Використання вбудованих інструментів програмного пакету QXP/Flo+ для створення моделі сайту зв`язування білка мішені дало змогу, зокрема, виключити з розрахунків молекули води та долучити до розрахунків лише амінокислоти в радіусі 5 Е від ліганду та наступний за ними шар. Обрані амінокислоти відіграють головну роль у зв`язуванні з природним лігандом, тому впливом решти білка в розрахунках можна знехтувати. На основі вивчення літературних даних було проведено протонування необхідних амінокислот моделі сайту зв`язування білка. Гідроксильна група бічного радикалу Glu 184 було депротоновано, a NH2, відповідно, протоновано - Lys 677, Lys 188, Lys 182.

У цьому дослідженні застосовували докінг з рухомим лігандом та нерухомим сайтом білку за алгоритмом систематичного докінгу SDOCK+ у модифікованому силовому полі AMBER. Максимальна кількість кроків при пошуку потенційних інгібіторів АТФ-азної активності міозину становила 300. Подальше фільтрування проводили як за геометричними показниками положення ліганду в центрі зв`язування “білок-ліганд” комплексу, так і за енергетичними показниками, використовуючи вбудовані в програмі QXP функції розрахунку енергії зв`язування в “білок-ліганд” комплексі.

За результатами докінгу та наступного фільтрування були обрані 82 сполуки.

Розглянемо результати проведеного докінгу на прикладі 4-(3,4-Дигідрокси-феніл)-6-метил-2-тіоксо-1,2-дигідро-піримідин-5-карбонової кислоти метилового естеру (Рис. 7). Досліджувана речовина формує чотири водневі зв'язки в активному центрі білка. Довжина водневого зв'язку між гідроксильною групою в пара- положенні та Tyr 113 становить 1,92 Е, а між гідроксилом в мета- положенні та Tyr 132 - 1,53 Е. Карбонільна група утворює два водневі зв'язки: з аміно- групами Tyr 126 та Arg 127 з кутом між ними 49,85°. Довжина цих зв'язків становить 2,19 та 2,31 Е, відповідно. Має місце електростатична взаємодія між залишком Arg 128 та складно-ефірною групою, сіркою та амідною групою Asn 237, що знаходяться, відповідно, на відстані 3,87 та 3,12 Е один від одного. Також цей тип взаємодії можна спостерігати між гідроксилом в пара- положенні та амідною групой Asn 185, що знаходяться на відстані 4,24 Е.

Проведені розрахунки вказують на можливість створення нових фармакологічних засобів регуляції ферментативної активності міозину.



Висновки

1. Методами математичного та молекулярного моделювання побудовані коректні моделі Са2+ - регульованого впливу та дії оборотних ефекторів (інгібіторів чи активаторів), включаючи іони водню, на ферментативну і транспортну активність білків ГМ.

2. Розроблено кінетичну модель Ca2+- залежного контролю скоротливої активності ГМ. Проаналізовано вплив величини константи Міхаеліса Km і максимальної швидкості транспорту іонів Ca2+ Vmax на скоротливу активність та запропоновано тлумачення ролі інгібітора кальцієвої помпи ЕПР білку А золотистого стафілококу у модуляції тензометричних характеристик ГМ.

3. Запропоновано новий метод розрахунку ефекторних констант, що дозволило оптимізувати визначення кінетичних характеристик на прикладі дії еозину Y на ферментативну активність Ca2+, Mg2+ АТФ-ази.

4. Запропоновано коректну щодо відповідності результатам експериментів модель pH-модульованого процесу розщеплення АТФ за участі АТФ-ази міозину ГМ. Аналіз моделі дозволив коректно визначити кількість іонів водню, які беруть участь у протіканні цієї ферментативної реакції. Дано тлумачення лінійної pH-залежності ферментативної активності „базальної” Са2+-незалежної Mg2+ АТФ-ази через характеристику ролі іонів Н+ як фактора негативного оберненого зв`язку.

5. У результаті проведеного молекулярного моделювання ідентифіковано групу сполук з властивостями високоафінних інгібіторів АТФ-азної активності міозину.



Список опублікованих праць за темою дисертації

1. Бориско П.О. Пошук штучних інгібіторів АТФ-азної активності міозину методами молекулярного моделювання / П.О. Бориско, О.О. Судаков, Ю.І. Прилуцький // Доповіді НАН України. - 2009. - №4. С. 182-187. Особистий внесок здобувача - провів передбачення фармакокінетичних властивостей та подальше фільтрування за параметрами лікоподібності бази лігандів для докінгу, зробив докінг та фільтрування результатів, опрацював літературні джерела за темою.

2. Dubinina G.G. Novel 5,7-disubstituted 6-amino-5H-pyrrolo[3,2-b]pyrazine-2,3-dicarbonitriles, the promising protein kinase inhibitors with antiproliferative activity / G.G. Dubinina, M.O. Platonov, S. M. Golovach, P.O. Borysko, A.O. Tolmachov, Y.M. Volovenko // European J. Med.Chem. - 2006.- Т. 41, №6. С. 727-37. Особистий внесок здобувача - провів передбачення фармакокінетичних властивостей та подальше фільтрування за параметрами лікоподібності бази лігандів для проведення докінгу, опрацював літературні джерела за темою та інтерпретував отримані дані для друку.

3. Данилова В.М. Експериментальне та теоретичне дослідження pH-залежності АТФазної активності міозину гладеньких м'язів / В.М. Данилова, К.І. Богуцька, П.О. Бориско, Ю.І. Прилуцький // Доповіді НАН України. - 2006. - №8. С. 187-191. Особистий внесок здобувача - провів експериментальне визначення рН-залежності гідролізу АТФ міозином, побудував та дослідив математичну модель взаємодії 4-х іонів Н+ з міозином, підібрав оптимальні параметри функціонування даної моделі.

4. Бориско П.О. Концепція субстратного протектування у ферментативному каталізі: математична модель / П.О. Бориско, Ю.І. Прилуцький // Біофізичний вісник. - 2005. - Т. №2. С. 65-69. Особистий внесок здобувача - розробив математичну модель для дослідження ролі ефекторів ферментативної активності міозину в рамках концепції субстратного протектування, опрацював літературні джерела за темою.

5. Костерін С.О. Кінетичний аналіз дії оборотних ефекторів (інгібіторів та активаторів) на ферментативну (транспортну) активність білків / С.О. Костерін, Ю.І. Прилуцький, П.О. Бориско, М.С. Мірошниченко // Укр. Біохім. Журн. - 2005. - Т. 77, №1. С. 113-125. Особистий внесок здобувача - дослідив математичну модель дії оборотних ефекторів на ферментативну активність білків, встановив оптимальні параметри функціонування моделі.

6. Костерін С.О. Кінетичне тлумачення лінійної рН-залежності ферментативної активності “базальної” Мg2+ATPази сарколеми гладенького м'язу / С.О. Костерін, Т.О. Векліч, Ю.І. Прилуцький, П.О. Бориско // Укр. Біохім. Журн. - 2005. - Т. 77, №6. С. 37-45. Особистий внесок здобувача - побудував математичну модель та аналітично визначив параметри взаємодії “базальної” Мg2+ATPази сарколеми гладенького м'язу з іонами Н+, опрацював літературні джерела за темою, інтерпретував отримані дані для друку.

7. Мірошниченко М.С. Математична модель Са2+ - залежного контролю скоротливої активності гладеньких м'язів / М.С. Мірошниченко, П.О. Бориско, Ю.І. Прилуцький // Фізика живого. - 2004. - Т. 12, №2. С. 59-66. Особистий внесок здобувача - побудував і провів кількісний та якісний аналіз моделі Са2+ - залежного контролю скоротливої активності, на основі розробленої моделі запропонував пояснення механізмів впливу білку А стафілококу на скорочення гладенького м'язу.

8. Бориско П. Застосування молекулярного моделювання для пошуку штучних інгібіторів АТФ-азної активності міозину. / П. Бориско, К. Андрейченко, М. Платонов, О.Судаков, Ю.Прилуцький // IV з'їзд українського біофізичного товариства; 2006; Донецьк.

9. Бориско П.О. Модельні дослідження рН-залежності АТФ-азної активності міозину гладеньких м'язів. / Бориско П.О., Прилуцький Ю.І., Богуцька К.І. // Психофізіологічні та вісцеральні функції в нормі і патології: Тези доповідей ІІІ Всеукраїнської наукової конференції, присвяченої 70-річчю з дня народження Г.М. Чайченка; 2006; К.: Знання України.

10. Костерін С.О. Щодо кінетичної інтерпретації механізму дії оборотних ефекторів на ферментативну (транспортну) активність білків / Костерін С.О., Мірошниченко М.С., Прилуцький Ю.І., Бориско, П.О. // І Українська наукова конференція “Проблеми біологічної и медичної фізики”. Тези доповідей; 2004; Харків.

11. Kosterin S.O. Kinetic model of Ca2+ transport in the smooth muscle cell. / S.O. Kosterin, Yu.I. Prylutskyy, P.O. Borysko // Proc. Conference for Young Scientists, PhD Students and Students on Molecular Biology and Genetics dedicated to the 30 anniversary of the Institute of Molecular Biology and Genetics NAS of Ukraine; 2003; Kiev.

12. Prylutskyy Yu. I. Modeling of Ca2+ Transport in the Smooth Muscle Cell. / Yu.I. Prylutskyy, P.O. Borysko // Neurophysiology; 2003.



Анотація

Бориско П.О. Ca2+, H+ - залежна регуляція кінетичних характеристик скорочення гладеньких м`язів та її модуляція оборотними ефекторами. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.02 - біофізика. Київський національний університет імені Тараса Шевченка, Київ, 2009.

Використовуючи методи математичного та молекулярного моделювання побудовано математичні моделі впливу деяких оборотних ефекторів, включаючи іони Са2+ та водню, на ферментативну і транспортну активність білків гладеньких м`язів.

На основі запропонованої математичної моделі скорочення гладенького м`язу надано тлумачення впливу білка А золотистого стафілокока на процес скорочення-розслаблення.

Запропонований новий оптимізований математичний підхід до кінетичної характеристики дії оборотних ефекторів на ферментативну (транспортну) активність білків гладеньких м`язів.

У роботі пояснена лінійна залежність швидкості ферментативної реакції „базальної” Са2+-незалежної Mg2+ АТФ-ази від рівня рН у гладенько-м`язових клітинах, яку спостерігали в експерименті, а також були знайдені числові значення коефіцієнтів модифікації кінетичних констант.

Методами молекулярного моделювання відібрано 82 сполуки з властивостями специфічних інгібіторів АТФ-азної активності міозину.

Ключові слова: гладенькі м`язи, математичне моделювання, ферментативна кінетика, кальцій, pH.



Аннотация

Бориско П.А. Ca2+, H+ - зависимая регуляция кинетических характеристик сокращения гладких мышц и ее модуляция оборотными эффекторами. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.02. - биофизика. - Киевский национальный университет имени Тараса Шевченко, Киев, 2009.

Используя методы математического и молекулярного моделирования, построены математические модели влияния некоторых оборотных эффекторов, включая ионы Са2+ и H+, на ферментативную и транспортную активность белков гладких мышц.

В работе дано математическое описание процесса сокращения гладкой мышцы с точки зрения кинетической интерпретации функционирования Mg2+, АТФ-зависимой кальциевой помпы плазматической мембраны и ЭПР, как основных регуляторов транспорта ионов Са2+ в клетках гладких мышц.

Результаты моделирования были сопоставлены с экспериментом по изменению профиля механокинетических кривых гиперкалиевой контрактуры в присутствии ряда концентраций (10-3 - 10-1 мг/мл) белка А стафилококка. Изменения модельной кривой, которые наблюдаются при имитации уменьшения сродства субстрата, качественно хорошо воспроизводят эксперимент по действию эффектора на исследуемую систему, что позволяет сделать предположение о роли белка А стафилококка как о конкурентном ингибиторе кальциевой помпы ЭПР гладкомышечной клетки.

Предложен новый математический подход к кинетической характеристике действия оборотных эффекторов на ферментативную (транспортную) активность белков гладких мышц с использованием коэффициентов ингибирования/активации. Данный подход позволил оптимизировать определение важнейших кинетических параметров, которые характеризуют кинетические закономерности действия оборотных эффекторов - коэффициентов модификации и эффекторной константы.

В рамках концепции субстратного протектирования проанализирована роль эффекторов ферментативной активности миозина, что важно для исследования функционирования гладких мышц в целом.

При изучении рН зависимости ферментативной активности „базальной” Са2+-независимой Mg2+ АТФ-азы в гладкомышечных клетках было обнаружено, что в режиме определения начальной скорости реакции гидролиза АТФ в диапазоне значений рН 6,0-8,0 эта зависимость не является типичной куполообразной, а характеризуется линейностью. На основе предложенной в работе математической модели дано объяснение линейной рН-зависимости скорости ферментативной реакции. Аналитически получена формула для расчета максимальной скорости ферментативной реакции в зависимости от уровня рН, а также были найдены численные значения коэффициентов модификации кинетических констант.

Для миозина гладких мышц обнаружено два максимума АТФ-азной активности в зависимости от уровня рН среды, а именно: при рН 6,0-6,5 и 9,5. Классическая схема, которая описывает механизм взаимодействия ферментативного белка с двумя ионами водорода H+, приводит к появлению единственного локального максимума на кривой зависимости максимальной скорости ферментативной реакции гидролиза АТФ от уровня рН. Таким образом, можно предположить, что участие четырех ионов водорода в таком ферментативном процессе будет инициировать появление двух локальных максимумов. В рамках предложенной кинетической модели полученная кривая удовлетворительно воспроизводит результаты эксперимента.

В данном исследовании использовался молекулярный докинг с подвижным лигандом и неподвижным активным центром белка по алгоритму систематического докинга SDOCK+ в модифицированном силовом поле AMBER. Максимальное количество шагов при поиске потенциальных ингибиторов АТФ-азной активности миозина составляло 300. Дальнейшее фильтрование проводили как по геометрическим критериям положения лиганда в центре связывания комплекса “белок-лиганд”, так и по энергетическим показателям, используя встроенные в программу QXP функции расчета энергии связывания комплекса.

Используя методы молекулярного моделирования, из базы коммерчески доступных соединений (400000) было отобрано 82 соединения со свойствами специфических ингибиторов АТФ-азной активности миозина. Для докинга была выбрана 3-D структура S1 фрагмента миозина (PDB код 1KWO, разрешение 3,8 Е).

Ключевые слова: гладкие мышцы, математическое моделирование, ферментативная кинетика, кальций, pH.



Annotation

Borysko P.O. Ca2+, H+ - dependent kinetic characteristics regulating of smooth muscle contraction and its reverse effectors modulation. Manuscript.

Dissertation for Candidate of Biological Sciences scientific degree 03.00.02. - biophysics. - Taras Shevchenko Kyiv National University, Kyiv, 2009.

Mathematical and molecular modeling was used to create the models of the influence on enzymatic and transport activity of smooth muscles' proteins for certain reverse effectors, including Ca2+, H+ ions.

The background of staphylococcus' protein A action on smooth muscles is proposed according to the designed mathematical model.

New optimized mathematical approach determining kinetic characteristics of reverse effectors' action on enzymatic (transport) smooth muscles' proteins activity is proposed.

Explanation for linear pH-dependence of the „basal” Са2+-independent Mg2+ ATP-ase reaction rate is proposed. Meaning of kinetic constants modification coefficients was discovered from the created mathematical model.

Mathematical model proposed an explanation for non-typical two-peaks pH-dependence of smooth muscles' myosin ATP-ase activity.

82 potent myosin ATP-ase inhibitors were selected according to the molecular modeling procedure.

Key words: smooth muscles, mathematical modeling, enzyme kinetics, calcium, pH.

Размещено на Allbest.ru

...