Рентгеноспектральний аналіз

Размещено на http://www.allbest.ru/

Вступ

Рентгеноструктурний аналіз - метод дослідження атомної будови речовини шляхом експериментального вивчення дифракції рентгенівських променів в цій речовині. Як відомо, атоми і іони в кристалі розміщені впорядковано і утворюють решітку для рентгенівських променів.

Для дослідження атомної структури застосовують випромінювання з довжиною хвилі порядку 1 А, тобто порядку розмірів атомів. Разом із нейтронографією і електронографією метод належить до дифракційних методів дослідження структури речовини.

Метод дозволяє визначати атомну структуру речовини, що включає просторову групу елементарної комірки, її розміри і форму, а також визначити групу симетрії кристалу. За допомогою методу можна досліджувати метали і їх сплави, мінерали, неорганічні і органічні сполуки полімери, аморфні матеріали, рідини і гази, молекули білків, нуклеїнових кислот та інші речовини. Найлегшим і найуспішнішим є застосовування методу для встановлення атомної структури кристалічних тіл, які вже мають строгу періодичність будови і фактично є створеними природою дифракційними ґратками для рентгенівських променів. Для решти речовин кристал повинен бути створеним, що є важливою і складною частиною методу рентгеноструктурного аналізу.

Факт явища дифракції рентгенівських променів на кристалах відкритий Лауе, теоретичне обґрунтування явищу дали Вульф і Брегг (умова Вульфа-Брегга). Як метод рентгеноструктурний аналіз розроблений Дебаєм і Шеррером. Рентгеноструктурний аналіз і до цього дня залишається одним з найпоширеніших методів визначення структури речовини через його простоту і відносну дешевизну.

1. Фізичні основи методу

Рентгеноспектральний аналіз - це розділ аналітичної хімії, який використовує рентгенівські спектри елементів для хімічного аналізу речовин. Рентгеноспектральний аналіз по положенню і інтенсивності ліній характеристичного спектра дозволяє встановити якісний і кількісний склад речовини і служить для експресного неруйнівного контролю складу речовини.

У рентгенівської спектроскопії для отримання спектру використовується явище дифракції променів на кристалах або, в області 15-150 А, на дифракційних штрихових гратах, що працюють при малих (1-12) кутах ковзання. Основою рентгенівської спектроскопії високого дозволу є закон Вульфа-Брега, який пов'язує довжину хвилі рентгенівських променів l, відбитих від кристала в напрямку q, з межплоскостним відстанню кристала d.

рентгеноспектральний атомний спектроскопія біологічний

nl = 2 d sinq

Кут q називається кутом ковзання. Він напрямом падаючих на кристал або відбитих від нього променів з відображає поверхнею кристала. Число n характеризує так званий порядок відображення, в якому при заданих l і d може спостерігатися дифракційний максимум.

Рентгенівське збудження атомів речовини може виникати в результаті бомбардування зразка електронами високих енергій або при його опроміненні рентгенівськими променями. Перший процес називається прямим порушенням, останній - вторинним або флуоресцентним. В обох випадках енергія електрона або кванта первинної рентгенівської радіації, бомбардують випромінює атом, повинна бути більше енергії, необхідної для виривання електрона з певної внутрішньої оболонки атома. Електронна бомбардування досліджуваної речовини призводить до появи не тільки характеристичного спектра елемента, але і, як правило, досить інтенсивного безперервного випромінювання. Флуоресцентне випромінювання містить тільки лінійчатий спектр.

В ході первинного збудження спектру відбувається інтенсивне розігрівання досліджуваної речовини, відсутнє при вторинному порушенні. Первинний метод збудження променів припускає приміщення досліджуваної речовини всередину відкачаної до високого вакууму рентгенівської трубки, в той час як для отримання спектрів флуоресценції досліджувані зразки можуть розташовуватися на шляху пучка первинних рентгенівських променів поза вакууму і легко змінювати один одного. Тому прилади, що використовують спектри, флуоресценції (незважаючи на те, що інтенсивність вторинного випромінювання в тисячі разів менше інтенсивності променів, отриманих первинним методом), останнім часом майже повністю витіснили з практики установки, в яких здійснюється порушення рентгенівських променів за допомогою потоку швидких електронів.

2. Історія відкриття методу

Дифракція рентгенівських променів на кристалах була відкрита в 1912 році німецькими фізиками Максом фон Лауе, Вільямом Фридріхом і Паулем Кніппінгом. Направивши вузький пучок рентгенівських променів на нерухомий кристал, вони зареєстрували на поміщеній за кристалом фотопластині дифракційну картину, яка складалася з великого числа регулярно розташованих плям. Кожна пляма -- слід дифракційного променя, розсіяного кристалом. Рентгенограма, отримана таким методом, пізніше отримала назву лауеграми . Падаючи на кристал рентгенівські промені розсіюються атомами (вузлами) кристалічної решітки. Розсіяні рентгенівські промені інтерферують між собою так, що в одних напрямках виникають максимуми інтенсивності розсіяних хвиль, а в других спостерігається їх повне погашення. Це явище, що об'єднує розсіювання і наступну інтерференцію хвиль, називають дифракцією рентгенівських променів.

Розроблена Лауе теорія дифракції рентгенівських променів на кристалах дозволила зв'язати довжину хвилі випромінювання за параметрами елементарної комірки кристалу. У 1913 році Лоренс Брегг і одночасно з ним Г. В. Вульф запропонували наочніше трактування виникнення дифракційних променів в кристалі. Вони показали, що дифракційні промені можна розглядати як віддзеркалення падаючого променя від однієї з систем кристалографічних площин (дифракційне віддзеркалення або умова Брегга -- Вульфа).

Така інтерпретація дифракції чисто умовна і не пояснює природи явища, але вона спрощує його тлумачення. Розглядаючи дифракцію рентгенівських променів, як відбивання від атомних площин, Вульф і Брегг вивели формулу -- одне з основних співвідношень, що описують положення дифракційних максимумів.

Формула Вульфа-Брегга вказує на селективність (вибірковість) появи відбитих рентгенівських променів. Якщо для оптичних променів неперервно змінювати кут між дзеркалом і первинним променем, то відбитий промінь буде дуже мало змінювати свою інтенсивність. Для рентгенівських променів відбиті промені будуть тільки при певних -- кутах ковзання. В цьому полягає різниця між відбиванням рентгенівських променів від атомних площин кристалу і відбиванням оптичних променів від дзеркала.

Після з'ясування просторової будови білка міоглобіну були отримані рентгенівські знімки кристалічних білків. Лауреат Нобелевської премії Д. Ходжкін провела рентгено-структурний аналіз пеніциліну. Під її керівництвом була також визначена дуже складна просторова атомна структура білкового гормону - інсуліну. Рентгеноструктурні дослід ження будови складних біологічно активних молекул крис талів дають змогу встановити зв'язок між біологічною функцією молекули і її будовою.

Рентгено-структурні дослідження будови складних біологічно активних молекул кристалів дозволяють встановити зв'язок між біологічною функцією молекули і її будовою.

У тому ж році Лоренс Брегг разом із своїм братом Генрі Бреггом вперше дослідили атомні структури простих кристалів за допомогою рентгенівських дифракційних методів. У 1916 році американський фізик Петер Дебай і німецький Пауль Шеррер запропонували використання дифракції рентгенівських променів для дослідження структури полікристалічних матеріалів.

Можливість використання рентгеноструктурного аналізу для дослідження широкого класу речовин та велика цінність цих досліджень стимулювали розвиток методів розшифровки структур. У 1953 році дані рентгенострустурного аналізу, отримані Морісом Вілкінсом і Розаліндою Франклін дозволили Джеймсу Ватсону і Френсісу Кріку створити модель молекули дезоксирибонуклеїнової кислоти. З 50-х років почали бурхливо розвиватися методи обробки дифракційної інформації і аналізу цих даних за допомогою комп'ютерів. В Україні в Донецькому національному технічному університеті на кафедрі «Прикладна екологія та охорона навколишнього середовища» професор Масляєв Віктор Семенович створив сучасну лабораторію рентгеноструктурного аналізу.

3. Застосування методу

Зразу ж після відкриття рентгенівського випромінювання його було застосовано в медицині. Цьому сприяла його велика проникна здатність та особливості поглинання. Кістки і тканини по-різному поглинають рентгенівське випромінювання, оскільки в перші входить кальцій, а в другі -вода, і відношення їх коефіцієнтів поглинання дорівнює приблизно 68. Тому на рентгенівських знімках тінь від кісток різко виділяється.

Пізніше була розроблена рентгенівська дефектоскопія - виявлення наявності, місця і розмірів внутрішніх дефектів у виробах шляхом їх рентгенівського просвічування.

Після того, як досконало була вивчена природа рентгенівського випромінювання, одержана дифракція, його почали застосовувати для дослідження будови кристалів. Так було створено рентгенівський структурний аналіз, за допомогою якого визначено атомні структури мінералів, неорганічних сполук, сплавів, структури складних органічних сполук, проводиться наукове прогнозування добування нових матеріалів із наперед заданими властивостями та ін.

Одна з основних завдань рентгеноструктурного аналізу - визначення речовинного або фазового складу матеріалу. Рентгеноструктурний метод є прямим і характеризується високою достовірністю, експресному та відносною дешевизною. Метод не вимагає великої кількості речовини, аналіз можна проводити без руйнування деталі. Області застосування якісного фазового аналізу дуже різноманітні і для науково-дослідних робіт, і для контролю у виробництві. Можна перевіряти склад вихідних матеріалів металургійного виробництва, продуктів синтезу, переділу, результат фазових змін при термічній і хіміко-термічній обробці, вести аналіз різних покриттів, тонких плівок і т.д.

Рентгеноспектральний аналіз дає змогу з великою точністю визначити довжини хвиль та інтенсивності тонкої структури рентгенівських спектрів випромінювання і поглинання. На основі таких відомостей можна визначити енергію зв'язку електронів у різних стаціонарних станах, стежити за змінами величин енергії зв'язку при зміні взаємодії і характеру взаємодії в конденсованих системах, тобто одержати відомості про енергетичний спектр електронів.

Велике практичне значення має рентгеноспектральний хімічний аналіз елементарного складу речовини. Один з його нових методів (так званий локальний рентгеноспектральний хімічний аналіз) дає змогу визначити елементарний хімічний склад усіх елементів таблиці Менделєєва в мікроскопічних об'ємах близько кубічного мікрометра. У наш час це єдиний метод визначення складу окремих вузлів схем мікроелектроніки, перехідних шарів у приладах квантової електроніки.

На практиці використовують кілька методів рентгеноспектрального і рентгеноструктурного аналізу, а саме: метод Лауе -- нерухомий монокристал опромінюється вузьким пучком рентгенівського випромінювання, спектр якого неперервний (суцільний); метод обертового кристала - монокристал, що обертається, опромінюють монохроматичними променями; метод порошків (метод Дебая -- Шеррера - Хелла) -- полікристалічне тіло опромінюють монохроматичним рентгенівським випромінюванням.

Широкого практичного застосування набула також рентгенівська мікроскопія. Хоч роздільна здатність рентгенівських мікроскопів на 2--3 порядки нижча від роздільної здатності електронних, проте велика проникна здатність рентгенівського випромінювання дає змогу розв'язувати ряд практичних задач металознавства, біології та інших галузей знань.

4. Апаратура для рентгеноспектрального аналізу

Рентгенівський флуоресцентний спектрометр складається з трьох основних вузлів: рентгенівської трубки, випромінювання якої збуджує спектр флуоресценції досліджуваного зразка, кристала - аналізатора для розкладання променів у спектр і детектора для вимірювання інтенсивності спектральних ліній.

У найбільш часто використовуваної на практиці конструкції спектрометра джерело випромінювання і детектор розташовуються на одній окружності, званої окружністю зображення, а кристал - у центрі. Кристал може обертатися навколо осі, що проходить через центр цієї окружності. При зміні кута ковзання на величину q детектор повертається на кут 2q.

Поряд зі спектрометрами з плоским кристалом широкого поширення набули фокусують рентгенівські спектрометри, що працюють «на відображення» (методи Капіци - Йоганна і Іогансона) і на «проходження» (методи коуша і Дю-Монд). Вони можуть бути одно- і багатоканальними. Багатоканальні, так звані рентгенівські квантометри, аутрометри та інші, дозволяють одночасно визначати велику кількість елементів і автоматизувати процес аналізу. зазвичай вони забезпечуються спеціальними рентгенівськими трубками і пристроями, що забезпечують високий ступінь стабілізації інтенсивності рентгенівських променів. Область довжин хвиль, в якій може використовуватися спектрометр, визначається межплоскостним відстанню кристала - аналізатора (d).

Число кристалів, які використовуються в рентгеноспектрального аналізу, досить велика. Найбільш часто застосовують кварц, слюду, гіпс і LiF.

5. Рентгеноструктурний аналіз білка

У природі зустрічається приблизно 1012 різних білків, що виконують найрізноманітніші функції. Це і білки-ферменти, що каталізують біохімічні процеси в живій клітині; і білки-переносники, що дозволяють іншим молекулам проходити через ядерні або клітинні мембрани або переміщатися між клітинами всього організму; і іммуноглобулярние білки, що відрізняються високою специфічністю взаємодії з антигенами, що призводить до активації сигнальних шляхів, які забезпечують імунну відповідь клітин.

При всьому своєму структурному і функціональному різноманітті всі природні білки побудовані з 20 амінокислот, з'єднаних відповідно з кодом білкового синтезу. Залежно від послідовності амінокислотних залишків у поліпептидному ланцюзі формується певна стабільна тривимірна структура білка, що визначає його структурні і функціональні властивості.

З'ясування просторової організації білків - один з основних напрямків сучасної біохімії. У багатьох випадках знання структури білка і його комплексу з інгібіторами є вирішальним фактором при створенні лікарських препаратів.

Одним з найважливіших експериментальних методів, що дозволяють з атомарної точністю дізнатися, що являє собою тривимірна структура білка, тобто визначити просторові координати всіх атомів досліджуваного об'єкта, є рентгеноструктурний, або Кристалографічний, аналіз. Знаючи положення кожного атома, можна обчислити міжатомні відстані, валентні кути, кути обертання навколо зв'язків, розподіл поверхневого заряду та інші деталі молекулярної геометрії.

Застосування рентгеноструктурного аналізу для дослідження складно-організованих біологічних об'єктів почалося після 1953, коли співробітник Кавендішськой лабораторії Кембриджського університету Макс Перутц знайшов спосіб визначення структури великих молекул, таких як міоглобін і гемоглобін. З тих пір рентгеноструктурний аналіз молекул білка допомагає нам зрозуміти хімію біологічних реакцій. На сьогоднішній день відомі структури близько 15 тис. Білків та їх комплексів з біологічно важливими молекулами.

Як же ставиться рентгенівський експеримент? Принципова схема проста: досліджуваний об'єкт поміщають в пучок рентгенівських променів і вимірюють інтенсивність розсіяного в різних напрямках випромінювання. Найпростіший спосіб - помістити на шляху пучка променів фотоплівку і за ступенем потемніння плями після прояву судити про інтенсивність розсіювання в цьому напрямку. Звичайно, на сьогоднішній день існують і більш досконалі методи, але зараз це не важливо. В даному випадку важливо те, що ми не дивимося на інтенсивність променів, що пройшли крізь об'єкт, а на інтенсивність променів, що виникли там, де їх начебто і не повинно було бути.

Отже, на вході ми маємо невідомий об'єкт, на виході - набір інтенсивностей розсіяних в різних напрямках променів, або дифракційну картину. Тепер необхідно пов'язати отриману в експерименті інформацію з атомною структурою досліджуваного об'єкта.

Метод рентгеноструктурного аналізу заснований на дифракції рентгенівських променів на кристалічній решітці і тому застосовується лише до речовин в кристалічному стані. Це пов'язано з тим, що для реєстрації дифракційної картини розсіювання необхідно мати достатню кількість розсіюють електронів. Але якщо зразок складається з великої кількості довільно орієнтованих ідентичних молекул (розчин), то картина розсіювання визначатиметься якимись усередненими по всіляких орієнтаціям характеристиками і навряд чи дозволить отримати детальну інформацію про атомну структуру. Інша справа, якщо велика кількість однакових молекул орієнтовані однаково. Таку можливість дають нам кристалічні зразки.

Говорячи простими словами (і не вдаючись у складні математичні формулювання), кристал - це такий зразок досліджуваної речовини, в якому багато (~ 1012) ідентичних молекул знаходяться в однаковій орієнтації та їх центри утворюють правильну тривимірну грати.

Основна особливість структури кожного кристала полягає в тому, що він побудований з регулярно розташованих в просторі окремих атомів або груп атомів. Якщо кожну повторювану структурну одиницю замінити крапкою, або вузлом, то вийде тривимірна кристалічна решітка. Грати можна уявити собі як систему однакових паралелепіпедів. Кожен такий паралелепіпед носить назву «елементарна комірка кристала» і описується шістьма параметрами: довжинами ребер (a, b, c) і кутами між ними (,,).

Одна з основних претензій до методу рентгеноструктурного аналізу з самого початку дослідження структур білків - це те, що в житті білки знаходяться в розчині, а при дослідженні ми їх крісталізуємо. Виникає логічне запитання: чи не відбувається принципових спотворень структури молекул білка при кристалізації? Прийнято вважати, що сильних спотворень все-таки не відбувається. Доводи на користь такої позиції наступні.

По-перше, ряд білків зберігають ферментативну активність і закристалізованому стані, тобто структура змінюється не настільки, щоб білок став «непрацездатний».

Ще одне підтвердження: альтернативне визначення структур деяких білків методом двовимірного ядерного магнітного резонансу не дало суттєвих розбіжностей зі структурами, розшифрованими рентгенівськими методами.

Монохроматичне рентгенівське випромінювання, проходячи через кристал, розсіюється в основному на електронних оболонках періодично повторюваних атомів і утворює дифракційну картину, або рентгенограму. Тому експериментальні рентгенівські дані дозволяють судити про особливості розташування електронів в елементарних кристалічних осередках.

Основні етапи визначення структури білка

Виділення, очистка. З цього етапу починаються практично всі експериментальні дослідження білкових структур. Для отримання потрібного білка використовують різні біохімічні методи. Послідовність операцій по виділенню білків зазвичай зводиться до подрібнення біологічного матеріалу (гомогенізація), вилучення з нього білків, а точніше - переведення білків в розчинений стан (екстракція) і виділенню досліджуваного білка з суміші інших білків, тобто очищення та отримання індивідуального білка. На цьому етапі найбільша складність полягає в напрацюванні достатнього для експерименту кількості чистого білка.

Кристалізація. Отримання кристалів, придатних для рентгеноструктурного аналізу, часто процес трудомісткий і далеко не тривіальний, особливо для складних сполук, таких як білки і нуклеїнові кислоти. Наявність пересичені розчину - необхідна умова кристалізації. Для отримання такого розчину використовують різні способи. Один з них полягає в поступовому видаленні розчинника звичайним випаровуванням, що призводить до зростання концентрації речовини в розчині, який в якийсь момент стає пересиченим. Інший спосіб пов'язаний з використанням залежності розчинності від температури. Наприклад, якщо розчинність зі збільшенням температури підвищується, можна приготувати насичений розчин при більш високій температурі, а потім повільно охолодити його. Завдяки зниженню розчинності в процесі охолодження виходить пересичений розчин. Третій спосіб пов'язаний з введенням в розчин якої-небудь речовини, що викликає пониження розчинності. В якості таких речовин використовують або солі, або органічні розчинники. Крім того, розчинність білків і нуклеїнових кислот сильно залежить від pH розчину, це теж можна використовувати для отримання пересичених розчинів.

Вибір кристалів для рентгенівського експерименту проводять за допомогою мікроскопа. Для цієї мети особливо корисний поляризаційний мікроскоп, що дозволяє за допомогою поляризаційного світла встановити наявність дефектів в кристалі.

На жаль, далеко не завжди вдається отримати кристал досліджуваного білка, тому цей етап є головним обмеженням методу рентгеноструктурного аналізу білків.

Рентгенівський експеримент, обробка результатів. Як джерело рентгенівських променів в даний час намагаються використовувати синхротронного прискорювач. Це досить дороге спорудження. Лабораторні рентгенівські установки теж використовуються, але синхротронне випромінювання має суттєві переваги.

Таким чином, центральна проблема методу рентгеноструктурного аналізу, звана фазової проблемою, полягає в неможливості отримання всіх необхідних для розрахунку даних безпосередньо з експерименту.

Висновки

Рентгеноструктурний аналіз - це метод дослідження будови тіл, що використовує явище дифракції рентгенівських променів, метод дослідження структури речовини з розподілу в просторі та інтенсивностям розсіяного на аналізованому об'єкті рентгенівського випромінювання.

Методами рентгеноструктурного аналізу вивчають метали, сплави, мінерали, неорганічні й органічні сполуки, полімери, аморфні матеріали, рідини і гази, молекули білків, нуклеїнових кислот і т.д. Рентгеноструктурний аналіз є основним методом визначення структури кристалів. При дослідженні кристалів він дає найбільшу інформацію. Це обумовлено тим, що кристали володіють строгою періодичністю будови і являють собою створені самою природою дифракційні грати для рентгенівських променів. Однак він доставляє цінні відомості і при дослідженні тіл з менш впорядкованою структурою, таких, як рідини, аморфні тіла, рідкі кристали, полімери та інші. На основі численних вже розшифрованих атомних структур може бути вирішена і зворотне завдання: по рентгенограмі полікристалічного речовини, наприклад легованої сталі, сплаву, руди, місячного грунту, може бути встановлений кристалічний складу цієї речовини, тобто виконаний фазовий аналіз.

У ході рентгеноструктурного аналізу досліджуваний зразок поміщають на шляху рентгенівських променів і реєструють дифракційну картину, яка виникає в результаті взаємодії променів з речовиною. На наступному етапі дослідження аналізують дифракційну картину і розрахунковим шляхом встановлюють взаємне розташування частинок в просторі, що викликало появу цієї картини.

Основними рентгенівської зйомки кристалів є: метод Лауе, метод порошку (метод дебаєграм), метод обертання і його різновид - метод гойдання і різні методи рентгенгоніометра.

У методі Лауе на монокристалічний зразок падає пучок немонохроматичним («білих») променів. Дифрагують лише ті промені, довжини хвиль яких задовольняють умові Вульфа - Брегга. Дифракційні плями на лауграммі розташовуються по еліпсах, гіпербол і прямим, обов'язково проходить через пляма від первинного пучка.

За характером плям на лауеграммах можна виявити внутрішні напруження і деякі інші дефекти кристалічної структури.

У методі порошку, так само як і у всіх інших описуваних нижче методах рентгенівської зйомки, використовується монохроматичні випромінювання. Змінним параметром є кут q падіння так як в поликристалічному порошковому зразку завжди присутні кристали будь-якої орієнтації по відношенню до напрямку первинного пучка.

Размещено на Allbest.ru