Характеристика оптической микроскопии

Размещено на http://www.allbest.ru/

План

1. Определение микроскопии

2. Краткая история микроскопии

2.1 Хронология развития микроскопии

3. Виды микроскопии

4. Оптическая микроскопия. Устройство и принцип работы оптического микроскопа. Достоинства и недостатки оптической микроскопии

4.1 Устройство микроскопа

4.2 Достоинства и недостатки оптической микроскопии

5. Методы оптической микроскопии

1. Определение микроскопии

Микроскопия (МКС) (греч. мйксьт -- мелкий, маленький и укпрЭщ -- вижу) -- изучение объектов с использованием микроскопа. Подразделяется на несколько видов: оптическая микроскопия, электронная микроскопия, многофотонная микроскопия, рентгеновская микроскопия, рентгеновская лазерная микроскопия и предназначается для наблюдения и регистрации увеличенных изображений образца.

В данной работе будет рассмотрена оптическая микроскопия.

2. Краткая история микроскопии

История микроскопа чрезвычайна разнообразна, длительна и интересна. Люди издавна хотели разглядеть, сделать крупнее, изучить. Так появились шлифованные стекла - лупы, которые уже можно назвать предком современного микроскопа. Люди научились смотреть далеко над землей и в небеса, когда им захотелось заглянуть внутрь того, что рядом. Так сначала появились простейшие световые микрокопы двухлинзовой системы, когда же назрела необходимость изучить то, что ещё глубже - появились электронные и атомные микроскопы.

2.1 Хронология развития микроскопии

· 1590 -- Голландские изготовители очков Ганс Янсен и его сын Захарий Янсен, по свидетельству их современников, изобрели составной оптический микроскоп.

· 1609 -- Галилео Галилей изобретает составной микроскоп с выпуклой и вогнутой линзами.

· 1619 -- Корнелиус Дреббель (1572--1633) презентует в Лондоне составной микроскоп с двумя выпуклыми линзами.

· 1625 -- Джованни Фабер (1574--1629), друг Галилея из Академии рысеглазых, предлагает для нового изобретения термин микроскоп по аналогии со словом телескоп.

· 1664 -- Роберт Гук публикует свой труд «Микрография», собрание биологических гравюр микромира, где вводит термин клетка для структур, которые им были обнаружены в пробковой коре. Книга, вышедшая в сентябре 1664 (часто датируется 1665 годом), оказала значительное влияние на популяризацию микроскопии, в основном из-за своих впечатляющих иллюстраций.

· 1674 -- Антони ван Левенгук улучшает микроскоп до возможности увидеть одноклеточные организмы. Микроскоп Левенгука был крайне прост и представлял собой пластинку в центре которой была линза. Наблюдателю нужно было смотреть через линзу на образец, закреплённый с другой стороны, через который проходил яркий свет от окна или свечи. Несмотря на простоту конструкции она позволяла получить увеличение в несколько раз превышающее микроскопы того времени, что позволило впервые увидеть эритроциты, бактерии (1683), дрожжи, простейших, сперматозоиды (1677), строение глаз насекомых и мышечных волокон, инфузории и многие их формы. Левенгук отшлифовал более пятисот линз и изготовил, по крайней мере, 25 микроскопов различных типов, из которых сохранилось только девять. Сохранившиеся до наших дней микроскопы способны увеличивать изображение в 275 раз, однако, есть подозрения, что Левенгук обладал микроскопами, которые могли увеличивать в 500 раз.

· 1863 -- Генри Клифтон Сорби разрабатывает поляризационный микроскоп, чтобы исследовать состав и структуру метеоритов.

· 1866-1873 -- Эрнст Аббе открывает число Аббе и первым разрабатывает теорию микроскопа, что становится прорывом в технике создания микроскопов, которая до того момента в основном основывалась на методе проб и ошибок. Компания «Карл Цейс» использует это открытие и становится ведущим производителем микроскопов того времени.

· 1931 -- Эрнст Руска начинает создание первого электронного микроскопа по принципу просвечивающего электронного микроскопа (Transmission Electron Microscope -- TEM). В качестве самостоятельной дисциплины формируется электронная оптика. За эту работу в 1986-м году ему будет присвоена Нобелевская премия.

· 1936 -- Эрвин Вильгельм Мюллер изобретает полевой эмиссионный микроскоп .

· 1951 -- Эрвин Мюллер изобретает полевой ионный микроскоп и первым видит атомы.

· 1953 -- Фриц Цернике, профессор теоретической физики, получает Нобелевскую премию по физике за своё изобретение фазово-контрастного микроскопа.

· 1955 -- Ежи Номарский, профессор микроскопии, опубликовал теоретические основы дифференциальной интерференционно-контрастной микроскопии.

· 1967 -- Эрвин Мюллер добавляет время-пролётный масс-анализатор к своему полевому ионному микроскопу, создав первый зондирующий атомный микроскоп и позволив тем самым производить химическую идентификацию каждого индивидуального атома.

· 1981 -- Герд Бинниг и Генрих Рорер разрабатывают сканирующий туннельный микроскоп (Scanning Tunneling Microscope -- STM).

· 1986 -- Герд Бинниг, Куэйт и Гербер создают сканирующий атомно-силовой микроскоп (Atomic Force Microscope -- AFM).

· 1988 -- Альфред Церезо, Теренс Годфри, и Джордж Смит применили позиционно-чувствительный детектор в зондирующем атомном микроскопе, позволяя с помощью него видеть положение атомов в трёхмерном пространстве.

· 1988 -- Кинго Итайя (Kingo Itaya) изобретает Электрохимический сканирующий туннельный микроскоп

3. Виды микроскопии

Флюоресцентная микроскопия -- метод получения увеличенного изображения с использованием люминесценции возбуждённых атомов и молекул образца. В флюоресцентном микроскопе образец облучается светом с большей частотой, а изображение получают в оптическом спектре. Излучение образца, соответственно, пропускается через фильтр, отсекающий свет на частоте возбуждения. Изображение флюоресцентного препарата может сфотографировано специализированной цифровой камерой, позволяющей делать снимки с большой выдержкой. Для некоторых изображений это время может достигать 60 минут. Одним из видов флюоресцентной микроскопии является конфокальная микроскопия -- метод, позволяющий получать изображения с некоторой глубины в середине образца.

Рентгемновская микроскопия -- метод исследования очень малых объектов, размеры которых сопоставимы с длиной рентгеновской волны. Основан на использовании электромагнитного излучения с длиной волны от 0,01 до 1 нанометра. Рентгеновские микроскопы по разрешающей способности находятся между электронными и оптическими микроскопами. Теоретическая разрешающая способность рентгеновского микроскопа достигает 2-20 нанометров, что на порядок больше разрешающей способности оптического микроскопа (до 150 нанометров). В настоящее время существуют рентгеновские микроскопы с разрешающей способностью около 5 нанометров

Электромнная микроскопия -- метод, позволяющий получать изображение объектов с максимальным увеличением до 106 раз, благодаря использованию, в отличие от оптического микроскопа, вместо светового потока пучка электронов с энергиями 200 эВ -- 400 кэВ и более (например, просвечивающие электронные микроскопы высокого разрешения с ускоряющим напряжением 1 МВ).

Разрешающая способность электронного микроскопа в 1000--10000 раз превосходит разрешение традиционного светового микроскопа и для лучших современных приборов может быть меньше одного ангстрема. Для получения изображения в электронном микроскопе используются специальные магнитные линзы, управляющие движением электронов в колонне прибора при помощи магнитного поля.

Сканирующие зондовая микроскопия -- вид микроскопии для получения изображения поверхности и её локальных характеристик. Процесс построения изображения основан на сканировании поверхности зондом. В общем случае позволяет получить трёхмерное изображение поверхности (топографию) с высоким разрешением.

4. Оптическая микроскопия. Устройство и принцип работы оптического микроскопа. Достоинства и недостатки оптической микроскопии

Оптическая микроскопия обеспечивает увеличение до 2-3 тысяч раз, цветное и подвижное изображение живого объекта, возможность микрокиносъемки и длительного наблюдения одного и того же объекта, оценку его динамики и химизма.

4.1 Устройство микроскопа

Оптическая система микроскопа состоит из основных элементов -- объектива и окуляра. Они закреплены в подвижном тубусе, расположенном на металлическом основании, на котором имеется предметный столик. Увеличение оптического микроскопа без дополнительных линз между объективом и окуляром равно произведению их увеличений.

В современном микроскопе практически всегда есть осветительная система (в частности, конденсор с ирисовой диафрагмой), макро- и микро- винты для настройки резкости, система управления положением конденсора.

В зависимости от назначения, в специализированных микроскопах могут быть использованы дополнительные устройства и системы.

Схема устройства простейшего микроскопа

Вообще можно предположить, что всячески экспериментируя с линзами с разными фокусными расстояниями можно было бы добиться сколько угодно большого увеличения, но, к сожалению, на практике увеличение световых микроскопов не превышает значения в 1500-2000 раз, так как существуют такие понятия как предел разрешения и разрешающая способность. микроскопия оптический контраст увеличивающий

В 1873 году немецкий учёный Э. Аббе разработал дифракционную теорию оптического микроскопа .Согласно этой теории формированию изображения сопутствуют два процесса: сначала дифракция света на микроскопических деталях объекта, а потом прохождение дифракционных лучей через линзу и их интерференция. Нельзя сказать, что теория Аббе сразу же произвела в оптической микроскопии революцию, но она поставила световую микроскопию на подлинную научную основу, позволила понять специфические детали формирования светового изображения и привела ко многим достижениям. Не удивительно, что фирма, основанная учеником и другом Аббе К. Цейсом приобрела всемирную известность, а производимые ею приборы долгое время служили и служат эталоном в световой оптике.

Предел разрешения-это такое наименьшее расстояние между точками предмета, когда эти точки различимы, то есть воспринимаются в микроскопе как две точки

Lmin=

А-апертура объектива

-длина волны

Разрешающая способность-способность микроскопа давать раздельные изображения мелких деталей рассматриваемого предмета.

R=

Не менее важной характеристикой также является контраст . Контраст изображения - это различие яркостей изображения и фона. Если это различие составляет менее 3 -4 %, то его невозможно уловить ни глазом, ни фотопластинкой; тогда изображение останется невидимым, даже если микроскоп разрешает его детали. На контраст влияют как свойства объекта, которые изменяют световой поток по сравнению с фоном, так и способности оптики уловить возникающие различия в свойствах луча.

4.2 Достоинства и недостатки оптической микроскопии

Как и говорилось ранее максимально возможное увеличение светового микроскопа не превышает 1500-2000 раз . Всё это связано с волновой природой света , а именно с таким явлением как дифракция . Кроме того при достижении больших увеличений интенсивность освещения исследуемого объекта заметно уменьшается , также может возникнуть дисторсия картинки, когда детали объекта, расположенные на разных расстояниях, отображаются с различным увеличением (возникают бочковидные или подушковидные картинки). Если кривизна поверхностей линз в разных плоскостях, не строго одинакова, возникает искажение изображения - астигматизм.

Борьба с этими и другими погрешностями потребовала от учёных и инженеров серьёзного анализа физических причин их возникновения и большой изобретательности . Шаг за шагом, продвигаясь в этом направлении, находя новые приёмы и усовершенствуя конструкцию микроскопов, они сильно расширили возможности световой микроскопии, создали в ней новые направления.

Собственно, таким образом можно сказать, что даже несмотря на тот факт, что световые микроскопы имеют массу недостатков, ими будут пользоваться, так как они относительно дешёвые ( в сравнении с тем же электронным микроскопом), не такие громоздкие . Кроме того в группе немецкого учёного Штефана Хелля (Stefan Hell) из Института Биофизической Химии научного сообщества Макса Планка (Гёттинген) в сотрудничестве с аргентинским учёным Мариано Босси (Mariano Bossi) в 2006 году был разработан оптический микроскоп под названием наноскоп (флуоресцентный наноскоп), позволяющий преодолевать барьер Аббе и наблюдать объекты размером около 10 нм (а на 2010 год и ещё меньше), оставаясь в диапазоне видимого излучения, получая при этом высококачественные трёхмерные изображения объектов, ранее недоступных для обычной световой и конфокальной микроскопии .

Сущность метода наноскопии состоит в том, что покрашенные флуоресцентными красителями образцы просматриваются с разрешениями в границах 10-30 нанометров -- откуда и пошло «наноскопия». Это способ получения изображения с помощью микроскопа содержит:

· оптическую систему для визуального наблюдения и проецирования изображения образца на видеокамеру, способную регистрировать и оцифровывать с низким уровнем шума изображения одиночных флуоресцирующих молекул и наночастиц;

· компьютер для записи и обработки изображений;

· держатель образца, расположенный напротив объектива;

· источник возбуждения флуоресцентного излучения;

· набор сменных запирающих фильтров (дихроидных зеркал) для выделения света флуоресценции образца.

В случайном порядке возбуждаются и люминесцируют отдельные молекулы. Излучаемые ими фотоны фиксируются камерой, затем "засвеченные" молекулы гаснут и начинают люминесцировать соседние. Этот процесс повторяется много раз, пока отдельные точки, найденные благодаря люминесценции, не образуют общую картинку.

За данное открытие Штефан Хелль в 2014 году стал лауреатом премии Кавли в области нанотехнологий и Нобелевской премии по химии (совместно с Эриком Бетцигом и Уильямом Мернером) за создание флуоресцентного микроскопа, позволившего сделать множество открытий в других областях науки.

Флуоресцентный наноскоп

Изображение, получаемое при помощи обычной оптической микроскопии (слева) и при помощи метода Хелля (справа).

5. Методы оптической микроскопии

Вследствие ряда недостатков оптического микроскопа, учёным необходимо было искать новые методы, которые смогли бы справиться с той или иной задачей . Поэтому и неудивительно, что подавляющему большинству открытий, сделанных с помощью светового микроскопа, предшествовал этап усовершенствования прибора и методик наблюдения .И не случайно авторы этих открытий занимают почётное место также в ряду микроскопистов- людей, внёсших наибольший вклад в развитие техники микроскопов и методики микроскопического анализа.

Измерение размеров микроскопических объектов с помощью микроскопа.

Для этого применяют окулярный микрометр - круглую стеклянную пластинку, на которой нанесена шкала с делениями. Микрометр устанавливают в плоскости изображения, получаемого от объектива . При рассматривании в окуляр изображения объекта и шкалы сливаются, и можно отсчитать, какое расстояние по шкале соответствует измеряемой величине . Отсчёт по шкале ещё не даёт размера объекта, так как совмещаемое со шкалой изображение не равно размеру предмета. Надо найти цену одного деления окулярного микрометра, для этого применяют объектный микрометр- шкалу с делениями по 0.01-0.02 мм. Рассматривая объектный микрометр как предмет, совмещают в одном поле зрения две шкалы - объектную и окулярную -и определяют цену деления окулярной шкалы микрометра.

Вместо объектного микрометра может применяться любой предмет, размеры которого известны либо счётная камера Горяева, применяемая в медицинских целях.

Микропроекция, микрофотография и микрокиносъёмка

Формирование микроскопического изображения происходит с участием человека и завершается образованием действительного изображения в глазу. Обычный микроскоп сам по себе не создаёт действительного изображения, однако для фотографирования (микрофотография, микрокиносъёмка) или проекции микроскопического изображения на экран (микропроекция) должно быть получено действительное изображение . Для этого изображение, даваемое объективом, надо расположить дальше фокусного расстояния окуляра.

Микропрепарат миокарда при внезапной смерти от острой коронарной недостаточности, полученный методом микрофотографии

Метод ультрамикроскопии (метод тёмного поля)

К началу нашего века казалось, что главные открытия в световой микроскопии уже сделаны, теория создана и новые возможности вряд ли целесообразно искать . однако оставалась невысокая разрешающая способность микроскопа, то есть было невозможно увидеть объекты размером меньше 200-300 нм и почти полностью выпадали из сферы микроскопии объекты, прозрачные для света . А их существует великое множество, причём и биологические, представляющие огромный интерес для развития областей медицины и биологии.

Учёные и инженеры, биологи Германии, Франции, Англии и др. стран . используя световой микроскоп в своих исследованиях непременно (хотя и медленно) улучшали его конструкцию.

Серьёзный успех пришёл в 1903 г. к австрийским учёным Г. Зидентопфу и Р.Зигмонди . нашедшим новый метод наблюдения мелких объектов - так называемый метод темного поля . Его идея состоит в том, что исследуемый прозрачный объект освещается косыми лучами, которые при отсутствии преломления в образце не попадают в объектив микроскопа .Если же в образце имеются включения, причём тоже прозрачные, но с другим показателем преломления, то прошедшие через включения и изменившие своё направление световые лучи попадают в объектив, а значит включения становятся видимыми . Поскольку большая часть лучей минует объектив - поле зрения тёмное, а на его фоне видны светлые изображения микровключений.

В микроскопе, реализовавшем метод темного поля(ультрамикроскопе), видимыми стали частицы размером в 2нм (20В ангстрем 20*10-10м). Но этот факт ни в коем случае не отрицает теорию Аббе : разрешающая способность микроскопа не превысила предел ,ею(теорией) установленный. Да и видимость в таком приборе специфична : видно ,что частица есть, присутствует в образце, но нельзя точно определить их размеры и геометрическую форму.

Удачная конструкция микроскопа была предложена в начале 50-х годов советскими учёными Б. В. Дерягиным и Г. Я. Власенко. Поток золя (или аэрозоля, то есть жидкости или воздуха со взвешенными в них микровключениями) помещался в камеру с прозрачными окнами . Осветительная система ультрамикроскопа проектирует изображение узкой прямоугольной щели в зону наблюдения . Наблюдение микрочастиц ведётся с помощью светового микроскопа обычного типа . Если в камере находится однородная прозрачная среда, то рассеяния света не происходит, а значит не попадают в окуляр - поле тёмное. Попавшая в поле зрения частица вызывает дифракцию света. В результате дифракции в окуляре регистрируются вспышки на тёмном поле. Таким образом каждая вспышка соответствует одной микрочастице в золе.

Поскольку интенсивность рассеянного света на микрочастицах невелика, их наблюдение возможно только при использовании мощных осветительных систем. Причём чем меньше частица, тем больше света требуется для её наблюдения и наоборот. Следовательно, регулируя яркость освещённой зоны, можно выделить для регистрации микрочастицы определённых размеров . С помощью данного прибора можно довольноточно определить концентрацию микрочастиц в золях вплоть до 1010 в 1 см3 . регистрация числа вспышек ведётся не визуально, а с помощью специального фотометрического устройства.

Таким образом можно сделать вывод, что данный метод позволяет определить лишь наличие микрочастиц, но не как их форму и размеры.

Метод тёмного поля внёс неоценимый вклад в науку, позволив обнаруживать новые типы микробов, невидимых в обычном световом микроскопе, получать информацию о характере поведения коллоидных растворов. Сейчас же ультрамикроскопия используется при контроле чистоты воздуха,питьевой воды

Метод светлого поля

Метод светлого поля в проходящем свете применяется при исследовании прозрачных препаратов, у которых различные участки структуры по-разному поглощают свет (тонкие окрашенные срезы животных и растительных тканей, тонкие шлифы минералов и другие).Пучок лучей из осветительной системы проходит препарат и объектив и дает равномерно освещенное поле в плоскости изображения. Элементы структуры препарата частично поглощают и отклоняют падающий на них свет, что и обусловливает появление изображения.

Метод может быть полезен и при наблюдении непоглащающих объектов, но лишь в том случае, если они рассеивают освещающий пучок настолько сильно, что значительная часть его не попадает в объектив. Метод светлого поля в отраженном свете применяется для наблюдения непрозрачных объектов, к примеру, травленых шлифов металлов, биологических тканей и различных минералов. Освещение препарата производится сверху, через объектив, который одновременно выполняет и роль осветительной системы.

Метод светлого поля в отраженном свете, как и при проходящем свете, создается за счет того, что разные участки препарата неодинаково отклоняют падающий на них свет, а отраженные лучи имеют различную интенсивность.

Интерференционный метод

Изображённый на рисунке микроскоп был впервые предложен советским учёным В.П. Линником в 1923 г. Белый свет от осветительной системы, пройдя светофильтр и превратившись в монохроматическое излуч. попадает на полупрозрачное зеркало, частично отражающее и частично пропускающее световые лучи. Лучи, отразившиеся от зеркальной поверхности, фокусируются объективом на поверхности непрозрачного (в данной схеме) образца и, отражаясь от него снова попадают в объектив. Лучи, прошедшие через зеркальный слой, попадают на тщательно отполированную поверхность отражателя и, испытав на нём отражение, возвращаются на полупрозрачное зеркало.

В плоскости изображения световые лучи, отражённые отражателем и объектом интерферируют. В результате, интерференционная картинка будет сильно отличаться от «идеальной», так как световые лучи будут менять свою фазу на поверхности исследуемого объекта. Получаемое таким образом изображение очень специфично, но оно несёт важную информацию о структуре поверхности . размерах микрообъектов, их распределению и т.п. Реализация интерференционного метода позволяет выявить неоднородности объекта, которые не могут быть выявлены другими приёмами.

Метод фазового контраста

Метод фазового контраста подобен интерференционному . В нём лучи, претерпевшие на образце фазовые изменения, интерферируют в плоскости изображения с нерассеянными лучами, искусственно сдвинутыми по фазе .

Свет от осветителя попадает на объект АВ ( в данном случае прозрачный ), пройдя через апертурную диафрагму в непрозрачной пластинке. Если рассеяния света нет, то все световые лучи попадают на кольцевое утолщение фазовой пластинки - в этом месте объектив формирует изображение апертурной диафрагмы, и она меняет фазу лучей на заданную величину (обычно л/4 ). В случае, когда объект неоднороден (содержит детали или включения с отличным от общей массы преломлением ), световые лучи отклоняются (рассеиваются) и минуют утолщение на фазовой пластинке, то есть проходят сквозь неё без изменения. В плоскости первичного изображения А1В1 лучи . прошедшие через объект без преломления (не рассеянные ) и преломлённые интерферируют и дают изображение .

Таким образом, метод фазового контраста применим для выявления деталей объектов или обнаружения и исследования самих объектов, линейные размеры которых сравнимы с длиной волны используемого для их отображения света . В то же время он открывает богатые возможности исследования однородных прозрачных объектов.

Поляризационная микроскопия

Поляризационная микроскопия - это метод наблюдения в поляризованном свете за объектами, обладающими изотропией, т.е. упорядоченной ориентацией субмикроскопических частиц. Перед конденсором поляризационного микроскопа помещается поляризатор, который пропускает световые волны с определенной плоскостью поляризации. После препарата и объектива помещается анализатор, который может пропускать свет с этой же плоскостью поляризации. Если анализатор повернуть затем на 900 по отношению к первой, то свет проходить не будет. В том случае, когда между такими скрещенными призмами будет находиться объект, обладающий способностью поляризовать свет, он будет виден как светящийся на темном поле. С помощью поляризационного микроскопа можно убедиться, например, в ориентированном расположении мицелл в клеточной стенке растений.

Витальное изучение клеток

Методы световой микроскопии дают нам возможность наблюдать живые клетки. Для короткого наблюдения клетки обычно помещают в жидкую среду на предметное стекло. Но для более длительного времени нужны другие способы. Часто для длительного наблюдения используют специальные камеры (плоские флаконы с отверстиями, закрытыми тонкими стеклами, или разборные плоские камеры). Клетки изучают в специально подобранных для них средах. Обычно для простейших это сбалансированные солевые растворы с добавками микроорганизмов и других простейших, служащих для объекта изучения пищей. Свободные клетки многоклеточных могут изучаться в плазме крови или в специальных синтетических средах. Для изучение клеток и тканей животных используют метод клеточных культур.

Метод микрохирургии

Метод микрохирургии применяется для исследования живых клеток. Это метод оперативного вмешательства и воздействия на клетку, в т.ч. удаление или вживление отдельных органелл. Этот метод также предусматривает пересадку органелл из клетки в клетку, введение крупных макромолекул в клетку. Обычно микроманипулятор совмещается с микроскопом, который служит для наблюдения за ходом оперативного вмешательства. Микрохирургическими инструментами являются стеклянные крючки, иглы, капилляры, которые изготавливаются на "микрокузницах". При микрооперациях клетку помещают в специальную камеру, куда также вводят инструменты. В последнее время также широко используются лазерные микропучки и микропучки UV спектра. Их применяют для точечного поражения клетки в ходе исследования.

Размещено на Allbest.ru