Исследование методов встраивания полупроводниковых наночастиц в липосомальные контейнеры

Временная автокорреляционная функция согласно определению имеет следующий вид:

(2)

где интенсивность I имеет различные значения во время t и (t-ф). t m - это время интегрирования (время накопления корреляционной функции), ф - время задержки между двумя точками во времени. Очевидно, что при ф = 0, автокорреляционная функция равна среднеквадратичной интенсивности . Для больших времен корреляция отсутствует, и автокорреляционная функция равна квадрату средней интенсивности рассеяния:

(3)

В соответствии с гипотезой Онзагера, релаксация микроскопических флуктуаций концентрации к равновесному состоянию может быть описана первым законом Фика (уравнением диффузии):

(4)

Где r - вектор позиции, c(r, t) - концентрация и D - коэффициент диффузии частиц. Можно показать, что автокорреляционная функция интенсивности экспоненциально затухает во времени и характерное время релаксации однозначно связано с D. Корреляционная функция интенсивности рассеянного света имеет вид:

(5)



где в соответствии с решением уравнения диффузии обратное время корреляции равно:

(6)

Флуктуации волнового вектора света описывается следующим выражением:

(7)

В выражениях 4-6: a и b - экспериментальные константы, n- показатель преломления жидкости, в которой взвешены дисперсные частицы, л - длина волны лазерного света и и - угол рассеяния.

Рис. 6. Схема процесса рассеяния света

Рис. 7. Автокорреляционная функция рассеянного света.

Константы tc, a и b могут быть найдены путем аппроксимации измеренной корреляционной функции теоретической экспоненциальной функцией. Если форма частиц известна или задана, их размер может быть рассчитан с использованием соответствующей формулы.



Например, для сферических частиц можно использовать формулу Стокса-Эйнштейна:

(8)

где kB - константа Больцмана, T - абсолютная температура и з - сдвиговая вязкость среды, в которой взвешены частицы радиуса R.

С помощью динамического рассеяния света может быть решена также задача измерения вязкости жидкости. Для случая рассеяния света на дисперсных частицах известного размера, измеренное характерное время флуктуаций позволяет рассчитать вязкость жидкости. Проблема аппроксимации экспериментальных данных проста для рассмотренного случая рассеяния света монодисперсными сферическими частицами. Для полидисперсных образцов интерпретация экспериментальных данных усложняется. Для реально достижимой точности измерений могут быть получены только два-три параметра полидисперсного распределения: средний размер частиц, ширина распределения и асимметрия распределения.

Microtrac Zetatrac -- один из самых современных анализаторов динамического светорассеяния, позволяющий работать с высокодисперсными системами в субмикронном диапазоне размеров. Внешний вид показан на рисунке 8, а схема его измерительной ячейки на рисунке 9. Анализатор размеров частиц лазерный Zetatrack предназначен для измерения размеров частиц в суспензиях, эмульсиях и порошкообразных материалах. Областью применения анализатора является контроль технологических процессов и качества продукции в фармацевтической и химической промышленностях, а также научные исследования в области коллоидной химии и биотехнологии. В основу работы установки положен метод лазерной дифракции. Суть этого метода определения размеров частиц основывается на том, что регистрируются не сами частицы, а рассеянный свет от этих частиц (или дифракционная картинка) и угол рассеяния света универсально пропорционален размеру частиц. Рассеянное частицами излучение регистрируется под разными углами с помощью высокочувствительного многоэлементного кремниевого детектора - фотодиодной матрицы. Излучение полупроводниковых лазеров с помощью линзы фокусируются в плоскость детектора, проходя при этом через измерительную кювету в которой осуществляется проток анализируемой суспензии, эмульсии или сухого порошкообразного материала. При наличии в кювете частиц наблюдается рассеяние света (дифракция). Индикатриса рассеяния (угловая зависимость интенсивности рассеянного излучения) определяется размером частиц и длиной волны лазера (последняя постоянна). Измерение индикатриссы и последующая программная обработка результатов позволяет за считанные минуты определить характер распределения частиц по размерам (дисперсионный состав) данной системы. Фотодиодные матрицы обеспечивают одновременное измерение интенсивности рассеянного излучения. Экспериментальные значения индикатриссы рассеяния получаются в результате усреднения данных о светорассении, регистрируемых через каждые 2 мс. Установив программно длительность анализа например 2 минуты, вы тем самым фактически выполните 6000 измерений. Ни один из традиционных методов дисперсионного анализа (седиментационный, ситовой или микроскопический) не позволят в такой короткий промежуток времени выполнить такое количество измерений. Кроме того, при исследовании, например суспензий и эмульсий, за две минуты все исследуемые частицы успевают пройти через измерительную кювету несколько раз, что обеспечивает получение устойчивых и в высокой степени воспроизводимых результатов. Огромным преимуществом такой скорости анализа, становится возможность не только контроля необходимой дисперсности материала, но и наблюдение в режиме реального времени за процессами агломерации.



Рис. 8. Внешний вид прибора Zetatrac

Рис. 9. Измерительная ячейка анализатора частиц Microtrac Zetatrac

В базовой комплектации предназначен для оперативного определения распределения частиц по размерам при помощи динамического рассеяния света материалов в виде суспензий и эмульсий, диапазон измеряемых размеров 0,8 нм...6,5 мкм.

Конструкция прибора оптимизирована для решения сразу трех задач: определения размеров дисперсной фазы, её зета-потенциала и средневзвешенной молекулярной массы. Оптическая система анализатора не требует юстировки, и за счет этого обеспечивается высокая воспроизводимость результатов и долговечность прибора.

Анализатор размера частиц и зета-потенциала частиц Zetatrac (Зетатрак) управляется посредством программного обеспечения Microtrac FLEX. Пример диалоговых окон контроля уровня измеряемого сигнала программного интерфейса показан на рисунке 10, а результатов измерений на рисунке 11.

Microtrac соответствует стандарту ISO 22412, принятому для измерения динамического светорассеяния. Технические характеристики прибора представлены в таблице 1.

Рис. 10. Диалоговое окно интерфейса программного обеспечения Microtrac FLEX для контроля уровня измеряемого сигнала

Рис. 11. Вид окна интерфейса программного обеспечения Microtrac FLEX с результатами измерений

Таблица 1 - Технические характеристики прибора Microtrac Zetatrac

характеристика	значение
Общие
модель	Microtrac Zetatrac
объем интегрированной ячейки образца	От 0,7 до 3 мл
диапазон измерений частиц	от 0,8 нм до 6.5 мкм
концентрация	от 0.01% мин. до 40% макс. (типовой образец)
Диапазон рН	от 3 до 11
Зета-потенциал
диапазон	От -125 до +125 мВ
точность	±4 мВ
Электрофоретическая подвижность
диапазон	От -10 до +10 нм/сек на вольт/см
точность	±0,3 нм/сек на вольт/см
угол измерения	180°
Пределы концентрации
верхний	до 40%
нижний	0,1 мг/мл Ликозина
Оптические компоненты
лазерный диод	780 нм длина волны, 3 мВт номинал класс 111Б
Эксплуатационные характеристики
требования электропитания	От 100 до 240 ВА, от 47 до 63 Гц, 10 Ватт максимально
температура	От 10 до 50°C, ±0,1°C
влажность	до 90% без конденсации
габаритные размеры (ШхГхВ)	16,8 х 40,6 х 16,5 см
вес	5,2 кг

3.2 Атомно-силовой микроскоп Agilent AFM 5420

Атомно-силовой микроскоп относится к классу сканирующих зондовых микроскопов, предназначенных для получения изображения поверхности и её локальных характеристик. Процесс построения изображения основан на сканировании поверхности зондом. В общем случае позволяет получить трёхмерное изображение поверхности (топографию) с высоким разрешением.

Принцип работы АСМ основан на регистрации межатомных (Ван-дер-Ваальсовых) взаимодействий между острием исследующего зонда и исследуемой поверхностью. Принципиальная схема устройства атомно-силового микроскопа представлена на рисунке 12. Ключевым элементом прибора является зонд, расположенный на свободном конце упругой консоли, называемой кантилевером. Взаимодействие зонда с исследуемой поверхностью приводит к изгибу кантилевера, величина которого пропорциональна величинам действующих сил. Кантилеверы, как правило, изготавливаются из кремния.



Рис. 12. Схема работы атомно-силового микроскопа. 1.Фотодетектор; 2.Лазер; 3.Зонд; 4.Образец; 5.Система обратной связи; 6. Пъезокерамический привод XYZ сканера.

Изгибающийся под действием поверхностных сил кантилевер перемещает отраженный от поверхности свободного конца луч, положение которого в пространстве регистрируется с помощью четырехсекционного фотоприемника.

Относительное перемещение зонда и образца осуществляется пьезоэлектрическим сканером, точность перемещения которого составляет десятые доли ангстрема. Во время сканирования электронная система прибора регистрирует и поддерживает постоянной величину взаимодействия зонда с поверхностью (т.е. постоянный изгиб кантилевера), сближая или отдаляя их. Таким образом, в процессе (рисунок 13) сканирования зонд огибает поверхность, а совокупность траекторий его перемещения повторяет рельеф поверхности выбранного участка.

Рис. 13. Иллюстрация процесса сканирования поверхности зондом атомно-силового микроскопа



Получаемые измерительные данные преобразуются компьютером в трехмерное изображение, которое выводится на экран монитора.

Высокая чувствительность и разрешающая способность делает АСМ эффективным средством для изучения геометрических и физических свойств объектов с молекулярной и кристаллической структурами.

Значительную роль в точности регистрации данных и в выборе их диапазона играют характеристики используемого зонда - радиус закругления кончика его острия и коэффициент упругости кантилевера. Кончик может иметь форму тетраэдра, пирамиды или конуса. На рисунке 14 представлены микрофотографии зондов на консоли кантилевера.

Рис. 14. Микрофотографии зондов

Выбор зонда и геометрии кончика, силы упругости кантилевера и резонансных частот определяется областью применения, типос поверхности исследуемого образца, средой сканирования и типом получаемого в результате исследования изображения. Их упругие константы колеблются от 0,001 до 150 Н/м, а резонансные частоты - от 50 до 300 кГц.

Технически характеристики

Сканнер.

Диапазоны сканирования:

по осям X и Y - 9 мкм;

по оси Z - 2 мкм.

Уровень шума сканера:

в плоскости XY - <1 Е (СКО);

по оси Z - <0,2 Е (СКО).

Кантилевер.

Кремниевый кантилевер Type II MACLever фирмы Agilent Technologies со следующими номинальными характеристиками:

резонансная частота - 75 КГц;

постоянная силы - 2.8 Н/м;

радиус кончика зонда - до 10 нм.

Методы измерений

В контактном режиме зонд сканирует в постоянном контакте с поверхностью. Главная особенность этого метода - это пространственное разрешение, вплоть до атомного. Атомное разрешение обуславливается наличием сил трения во время сканирования, которые периодически удерживая зонд, изгибют при этом кантилевер. Разрешение определяется усредненным по площади эффективным контактом зонда с поверхностью. Эффективность контактного режима сильно ограничена возможностью механического перемещения исследуемых объектов; возможностью неконтролируемого разрушения адсорбированных слоев, зонда и/или образца; искажением данных и препятствованием сканированию поверхностными слоями, и практической невозможностью исследования поверхностей с развитым рельефом. При относительно сильных взаимодействиях зонд-поверхность контактный режим либо совсем нечувствителен к мягким поверхностям (зонд их прокалывает и соскребает), либо наличие этих объектов приводит к появлению артефактов и искажениям на изображении топографии (зонд вязнет в них или перемещает). На поверхности с развитым рельефом зонд либо быстро стирается, теряя свою остроту, либо застревает в каком-либо углублении и стоит, раскачиваясь во время сканирования.

Для сканирования образцов с развитым рельефом или хрупкой структурой применяется модуляционный метод. Отличительной чертой данного метода является сканирование зондом, который колеблется около положения равновесия. При взаимодействии зонда с поверхностью параметры колебательного процесса изменяются в зависимости от расстояния и ее свойств. В процессе сканирования над исследуемым участком электронная система управления поддерживает постоянным среднее расстояние между зондом и поверхностью таким, чтобы амплитуда или частота колебаний зонда сохранялась равной заданной величине. В результате, траектория перемещения зонда без учета гармонической составляющей огибает рельеф поверхности. Так что координаты этой траектории составляют образ исследуемой поверхности. К модуляционному методу относится прерывисто-контактный режим. В этом режиме зонд колеблется на резонансой частоте с довольно большой амплитудой (до 500 нм) вблизи поверхности, касаясь ее. В процессе сканирования амплитуда колебаний поддерживается постоянной за счет изменения среднего расстояния зонд-образец электронной системой управления. Так как колебания производятся на резонансной частоте зонда, то резкий контакт зонда с поверхностью образца отсутствует и не регистрируется, а траектория перемещения зонда имеет форму циклоиды. Большая амплитуда колебаний обеспечивает отрыв зонда от поверхности, затрудняемый адгезионными силами, которые приводят к сдвигу фазы регистрируемого сигнала. Таким образом, в формирование регистрируемой траектории сканирования основной вклад вносят адгезионные силы, величина скачка зонда к поверхности, рельеф поверхности и рельеф адсорбированных слоев.

Контактный и прерывисто-контактный методы включают в себя следующие режимы измерения:

а) Режим фазовых изображений.

В прерывисто-контактном методе за счет уменьшения сил трения в нем уменьшились воздействия на исследуемые объекты и связанные с этими проблемы перемещения и повреждения из и зонда. При этом, из-за уменьшения расстояния между зондом и образцом, метод обладает хорошей разрешающей способностью. Режим фазовых изображений, относящийся к прерывисто-контактной методике, выделяет информацию об адгезионных силах. В этом режиме отображается не рельеф, а механическое свойство поверхности. В прерывисто-контактном методе измеряется, одновременно с топографией, сдвиг фазы между подаваемым и регистрируемым сигналами. По сути своей, это задержка измеряемого сигнала, которая определяется временем, которое зонд находится в контакте с поверхностью, и , которое, очевидно, пропорционально величине силы адгезии зонда с поверхностью. Таким образом, результатом использования этого режима является карта, которая косвенно характеризует распределение силы адгезии по исследуемому участку.

б) Режим токовой чувствительности.

В данном режиме используется зонд, покрытый токопроводящей пленкой, для измерения проводимости и рельефа поверхности исследуемого образца. К токопроводящим кантилеверу и подложке с исследуемым образцом прикладывается напряжение смещения. В результате этого возникает ток, значение которого определяется сопротивлением образца в зоне контакта с кантилевером, и который регистрируется системой. Результатом является картина распределения сопротивления измеренной области образца.

в) Магнитный режим.

С помощью магнитного режима исследуется взаимодействие между зондом покрытым ферромагнитным покрытием и ферромагнитным или парамагнитным образцом для построения картины распределения доменных структур. Система регистрирует изменения фазы кантилевера, обусловленные межатомной магнитной силой, которая оказывает более сильное влияние на отталкивание наконечника и образца, чем силы Ван-дер-Ваальса. Стандартное изображение рельефа поверхности измеренного участка образца можно получить при помощи прерывисто-контактного режима. Затем два изображения отображаются одновременно и с их помощью определяется зависимость между магнитной структурой и рельефом поверхности образца.

г) Электростатический режим.

Электростатический режим является качественным режимом исследования изменений естественного и наведенного электростатического поля на поверхности образца. Между зондом и исследуемым образцом прикладывается напряжение смещения, что позволяет определить локальные участки статических зарядов и измерить их концентрацию.

Система регистрирует изменения фазовой характеристики кантилевера, которые обусловливаются взаимодействием токопроводящего зонда и электростатического поля поверхности исследуемого образца. Как правило, изображения получаются путем регистрации изменения фазы колебаний при заданной частоте.

Состав оборудования АСМ Agilent AFM 5420

Фотография АСМ-микроскопа Agilent AFM 5420, который применялся в ходе исследований представлена на рисунке 15.

Рис.15. Фотография атомно-силового микроскопа Agilent AFM 5420

Оборудование АСМ состоит из следующих функциональных компонентов, обеспечивающих методики измерения, которые были изложены выше:

Контроллер;

Блок электроники;

Виброзащитная камера;

Микроскоп;

Компьютер.

Программное обеспечение.

Контроллер (рисунок 16) подает высокое напряжение на пъезоэлектрические элементы сканнера и обеспечивает проведение измерения в разных режимах сканирования.

Рис. 16. Фотография контроллера для управления АСМ Agilent AFM 5420

Блок электроники (рисунок 17) принимает измерительные данные от детектора, передает их на контроллер и отображает на цифровых индикаторах 1 и 2.

Рис. 17. Блок электроники. 1,2. Индикаторы; 3. Тумблер “Open/Close”; 4. Кнопка выключения

Тумблер “Open/Close” (3) необходим для установки положения кантилевера перед измерением и служит для перемещения кантилевера относительно исследуемого образца по высоте в ручном режиме. Также, блок электроники формирует напряжение колебаний, необходимые для сканирования образца в прерывисто-контактном режиме.

Виброзащитная камера (рисунок 18) с мраморной платформой, подвешенной на демпфирующих жгутах, защищает микроскоп от вибраций, воздушной турбулентности и акустических шумов, которые отрицательно влияют на процесс измерения. Кроме этого, камера компенсирует колебания температур.

Рис. 18. Виброзащитная камера

Микроскоп

Фотография микроскопа приведена на рисунке 19.

Рис. 19. Фотография микроскопа, где: 1 - видеосистема; 2 - сканер; 3 - детектор; 4 - насадка и зонд; 5 - предметный столик с регулировкой по осям Х и У; 6 - основание микроскопа.

Микроскоп из следующих основных компонентов:

Видеосистема. Видеосистема предназначена для исследования поверхности образца с целью выбора интересующего участка, в котором будет проводиться измерение. В состав видеосистемы входит видеокамера и оптика, встроенные в основание микроскопа.

Сканер. Сканер содержит систему прецизионного позиционирования зонда, элементы которого изготовлены из пьезокерамических материалов. Сканер обеспечивает позиционирование с высокой точностью в трех координатах Х, У и Z.

Детектор. Съемный фотодиодный детектор принимает отраженный от кантилевера лазерный луч. Детектор размещается в корпус сканера. Детектор делится на четыре сегмента, что обеспечивает одновременную регистрацию изгиба и скручивания зонда для анализа взаимодействия зонда с поверхностью образца.

Насадка и зонд. Насадка предназначена для крепления зонда. Зонд надежно удерживается насадкой при сканировании.

Предметный столик с регулировкой по осям Х и У. Предметный столик позволяет надежно закрепить исследуемый образец. С помощью поворотных ручек осуществляется ручное позиционирование.

Основание микроскопа.

Программное обеспечение

Микроскоп комплектуется программным обеспечением PicoView, представляющий мощный программный пакет для управления настройкой режимов измерения, сканированием, калибровкой системы и т.д. Также, программа позволяет подстраивать параметры измерения в процессе сканирования, сохранять и обрабатывать полученные результаты измерения. Программа имеет окна управления видеокамерой. Окна интерфейса программы представлены на рисунках 20 и 21.



Рис. 20. Окно настройки и управления атомно-силовым микроскопом

Agilent AFM 5420

Рис. 21. Окно интерфейса с результатами измерений на атомно-силовым микроскопе Agilent AFM 5420



4. Экспериментальные исследования

4.1 Описание процедуры формирования липосомальных контейнеров со встроенными полупроводниковыми наночастицами

Процесс формировании липосом методом гидратации сухой пленк сводится к следующей последовательности операций:

70 мг (94 µмоль) фосфолипидов (Lipoid S75) и 30 пмоль гидрофобных квантовых точек (em = 577 nm) в толуоле (52 µл) растворяются в 1 мл хлороформа в круглодонной колбе (V = 10 мл) при воздействии ультразвуком при 45оС;

В образовавшийся раствор добавляется 3 мл воды;

Выпаривается хлороформ с помощью роторного испарителя;

Добавляется еще 3 мл воды;

В течение 60 минут перемешивается раствор с образовавшимися липосомами при температуре 45оС;

Раствор подвергается воздействию ультразвука в течение 5 минут для достижения необходимого размера частиц (оценочно - 100 нм).

Схема данного метода представлена на рисунке 22,а.

Процесс формировании липосом методом выпаривания в обращенной среде сводится к следующей последовательности операций:

Порядок формирования липосомальных наноконтейнеров, наполненных квантовыми точками CdSe/ZnS методом выпаривания:

70 мг (94 µмоль) фосфолипидов (Lipoid S75) было растворено в 1 мл хлороформа в круглодонной колбе (V = 10 мл);

Выпаривается хлороформ с помощью роторного испарителя до образования пленки фосфолипидов на стенках колбы;

Добавляется 6 мл воды, содержащей 5 µмоль квантовых точек CdSe/ZnS;

Перемешивание в течение 30 минут при 45оС;

Воздействие ультразвука в течение 5 минут для достижения приемлемого размера частиц (оценочно - 100 нм).

Схема данного метода представлена на рисунке 22,б.

Рис. 22. а) схема получения липосом по методу гидратации сухой пленки, б) схема получения липосом с помощью выпаривания в обращенной фазе.

Липосомы были изготовлены с использованием следующих материалов:

- Фосфолипиды марки Lipoid S80 (Lipoid GMBH, Германия);

- Хлороформ (ЗАО "База№1Химреактивов", Россия);

- Полупроводниковые наночастицы (квантовые точки) CdSe/ZnS, предоставленные СГУ имени Н.Г. Чернышевского.

Для изготовления липосом применялось следующее оборудование:

- Магнитная мешалка Magnetic stirrer MMS 3000;

- Магнитная мешалка с подогревом Heidolph MR Hei-Tec;

- Ванна 1 л;

- Печь Binder.

Приготовленные для исследования суспензии липосом со встроенными наночастицами на рисунках 23 и 24.



Рис.23. Липосомы полученные методом гидратации сухой пленки.

Рис.24. Липосомы, полученные методом выпаривания в обращенной фазе.

4.2 Калибровка атомно-силового микроскопа

Калибровка микроскопа Agilent 5420 AFM/STM с помощью калибровочных мер длины TGZ1, TGZ2, TGZ3.

Меры TGZ1, TGZ2, TGZ3 (далее - меры TGZ) относятся к классу мер рельефных нанометрового диапазона и предназначены для передачи размера единицы длины в диапазоне 10-9 ч 10-4 м и поверки (калибровки) оптических ближнего поля, растровых электронных, сканирующих туннельных и атомно-силовых микроскопов и других средств измерений малой длины.

Область применения: оснащение органов государственной и ведомственной метрологических служб, оснащение лабораторий и испытательных центров, оснащение научных и учебных лабораторий, применяющих указанное оборудование для калибровки.

Меры представляет собой совокупность шаговых структур на поверхности квадратной кремниевой монокристаллической пластины с размерами квадрата со стороной не более 5 мм, поверхность которой ориентирована параллельно кристаллографической плоскости (100). Мера состоит из одинаковых шаговых структур с прямоугольной геометрической формой элемента рельефа шаговой структуры (Рисунки 25, 26 и 27). Основные технические характеристики мер приведены в таблице 1.

Рисунок 25 - Схематическое изображение фрагмента меры

Рисунок 26 - РЭМ-изображение фрагмента меры

Рисунок 27 - АСМ-изображение фрагмента меры



Таблица 2 - Основные технические характеристики мер.

Наименование	Значение
Номинальное значение шага шаговой структуры меры, мкм	3,00
Допустимое отклонение от номинального значения шага периодической структуры не более, мкм	± 0,01
Диапазоны значений высоты выступов в шаговых структурах меры, нм - мера TGZ1 - мера TGZ2 - мера TGZ3	21,4 107 560
Пределы допускаемых значений абсолютной погрешности определения высоты выступов в шаговых структурах не более, нм - мера TGZ1 - мера TGZ2 - мера TGZ3	±1,5 ±2 ±2,6
Условия эксплуатации: а) При работе на воздухе - температура окружающего воздуха, °С - относительная влажность, % - атмосферное давление, Па б) При работе в вакуумных условиях - диапазон значений остаточного давления в камере образцов микроскопа, Па - температура держателя образца, оС	20 ± 3 65 ± 15 (100 ±4)·103 1·10-4 ч 270 20 ± 3
Масса меры должна быть не более, кг	0,005
Габаритные размеры меры, мм	5.0Ч5.0Ч0.5
Размеры рабочей области меры, мм	3.0Ч3.0

Калибровка атомно-силового микроскопа включает выполнение следующих действий:

1) Включить микроскоп в соответствии с его руководством по эксплуатации;

2) Установить меру TGZ1 в держатель микроскопа, подлежащего калибровке;

3)Установить кантилевер;

4) Навести источник лазерного излучения на основание кантилевера;

5) Установить скорость сканирования исходя из технических характеристик микроскопа;

6) Произвести сканирование;

7) На полученном фотоизображении измерения выполняются на аттестованной части меры;

8) Сделать снимок;

9) Построить 5 сечений одного периода профиля мер, записать полученный результат измерения.. Повторить измерение в двух точках со сдвигом вдоль аттестованной части меры;

10) Построить 5 сечений профиля меры, записать полученный результат измерения. Повторить измерение в двух точках со сдвигом вдоль аттестованной части меры;

11) Построить 5 измерений высоты профиля меры, записать полученный результат измерения. Повторить измерение в двух точках со сдвигом вдоль аттестованной части меры;

12) Повторить измерения высоты профиля . и согласно п.5.2 - 5.10 для мер TGZ2, TGZ3;

13) Для ,произвести обработку результатов измерений по п.6.1-6.5;

14) Если заказчик заявляет калибровку двух и более сканеров, производится его замена и повторение операций по п. 5.2 - 5.13.

Обработка результатов измерений производится в следующем порядке:

1) Рассчитать среднее арифметическое значение результатов измерений для ,по формуле 9.

= ,

где N - число измерений, N=15;

- среднее значение;

- значение i-го результат измерения

2) Рассчитать средние квадратические отклонения результатов измерений, для по формуле 10:

где N - число измерений, N=15;

- среднее значение;

- значение i-го результат измерения

3) Определить границы неисключенной систематической погрешности результата измерений путем суммирования неисключенных систематических погрешностей средств измерений, метода и погрешностей , вызванные другими источниками. Эти границы вычисляются по формуле 11:

,

где K = 1,1 при доверительной вероятности 95 %;

и1 - погрешность, обусловленная неопределенностью калибровочной меры, указанное в паспорте на меру;

и2 - неисключенная погрешность, определяемая отклонением среднего арифметического значения результатов измерений,, калибруемого прибора от действительного значения меры по формуле (12)

и2=,

- действительное значение меры указанное в паспорте на меру.

4) В соответствии с РМГ 43-2001 рассчитать неопределенность результата измерений калибруемого прибора.

=S(,

Рассчитать стандартную неопределенность, оцененную по типу В, по формуле 6:

,

Рассчитать суммарную стандартную неопределенность по формуле 7:

,

Рассчитать расширенную неопределенность при коэффициенте охвата k=2 по формуле 8

,

5) За результаты измерений расширенной неопределенности принимают наибольшее полученное значение во всем диапазоне измерений.

В ходе измерений были получены АСМ-изображения, которые обрабатывались с помощью ПО Gwiddyon. На рисунках 28 и 29 представлены пример полученного изображения и его 3D-реконструкция.



Рис. 28. 2D-изображение меры

Рис. 29. 3D-реконструкция меры

Результаты были получены при следующих параметрах сканирования:

Скорость сканирования: 0,5 Гц;

Чувствительность обратной связи (Gain): 8.6

Размер области сканирования: 35х35 мкм2;

Разрешение кадра: 512х512.

Результаты калибровки, включая неопределенность, представлены в таблицах 3 - 7.

Таблица 3 - Результаты измерений шага шаговой структуры TGZ1 (3,00±0,01) мкм

№	Измеренное значение, мкм	Среднее значение, мкм	Неопределенность
			по типу А, мкм	по типу B, мкм	Суммарная, мкм	Расширенная, мкм
1	2,94	2,94	0,01	0,01	0,03	0,06
2	2,94
3	2,94
4	2,97
5	2,94
6	2,94
7	2,94
8	2,95
9	2,95
10	2,94
11	2,95
12	2,96
13	2,94
14	2,95
15	2,94

Таблица 4 - Результаты измерений высоты выступов шаговой структуры TGZ1 (21,4±1,5) нм

№	Измеренное значение, нм	Среднее значение, нм	Неопределенность
			по типу А, нм	по типу B, нм	Суммарная, нм	Расширенная, нм
1	21,84	21,9	0,1	0,9	0,9	1,8
2	22,11
3	21,9
4	21,85
5	21,1
6	22,05
7	22,03
8	22,08
9	21,95
10	22,11
11	22,01
12	22,01
13	21,09
14	22,04
15	22,38

Таблица 5 - Результаты измерений шага шаговой структуры TGZ2 (3,00±0,01) мкм

№	Измеренное значение, мкм	Среднее значение, мкм	Неопределенность
			по типу А, мкм	по типу B, мкм	Суммарная, мкм	Расширенная, мкм
1	3,03	2,95	0,02	0,06	0,12	0,12
2	2,94
3	2,94
4	2,93
5	2,94
6	2,95
7	2,94
8	2,95
9	2,94
10	2,94
11	2,94
12	2,95
13	2,94
14	2,94
15	2,95

Таблица 6 - Результаты измерений высоты выступов шаговой структуры TGZ2 (107±2) нм

№	Измеренное значение, нм	Среднее значение, нм	Неопределенность
			по типу А, нм	по типу B, нм	Суммарная, нм	Расширенная, нм
1	113,2	112,0	0,1	3	3	6
2	111,8
3	111,3
4	111,7
5	111,0
6	111,8
7	112,3
8	112,5
9	112,8
10	111,7
11	112,0
12	112,1
13	112,0
14	112,0
15	111,8



Таблица 7 - Результаты измерений высоты выступов шаговой структуры TGZ3 (560±2,6) нм

№	Измеренное значение, нм	Среднее значение, нм	Неопределенность
			по типу А, нм	по типу B, нм	Суммарная, нм	Расширенная, нм
1	551,4	553,3	0,3	4,1	4,1	8,2
2	551,4
3	551,4
4	551,4
5	552,4
6	554,1
7	554,1
8	554,4
9	554,1
10	554,1
11	554,4
12	554,1
13	554,1
14	554,4
15	554,1

Значения параметров сканирования не регламентируются методикой калибровки. Дается лишь рекомендация установить скорость сканирования в соответствии с техническими характеристиками микроскопа.

В ходе работы были получены топографии мер TGZ1 при различных скоростях сканирования (0,3/0,5/0,7 Гц).

Профили рельефа представлены на рисунках 30 - 31.



Рис. 30. Профиль рельефа, полученного при сканировании со скоростью 0,3 Гц

Рис. 31. Профиль рельефа, полученного при сканировании со скоростью 0,5 Гц

Рис. 32. Профиль рельефа, полученного при сканировании со скоростью 0,9 Гц

Среднее значение шага меры, измеренных с помощью профилей, составило: при скорости сканирования 0,3 Гц - 3,0 мкм; при скорости 0,5 Гц - 2,95 мкм, при скорости 0,9 Гц - 2,97 мкм.

4.3 Калибровка анализатора частиц

Для калибровки анализатора частиц использовался стандартный образец суспензии монодисперсных частиц фирмы Duke Scientific Corporation (Thermo Fisher Scientific Corporation). Частицы были аттестованы с помощью ТЭМ Национального Института Стандартов и Технологий (NIST, Гейтерсберг). Частицы представляют собой полимерные микросферы диаметром (102±3)нм. В Таблице приведены технические характеристики стандартного образца. Сертификат калибровки приведен в Приложении.

Таблица 8 - Технические характеристики стандартного образца 3100А

Материал	Полистирол
Относительное объемное содержание частиц твердой фазы, %	1
Диаметр, нм	102±3
Концентрация частиц, г/см3	1,05
Показатель преломления на длине волны 589 нм	1,59

4.4 Измерение геометрических параметров липосомальных контейнеров и полупроводниковых наночастиц методами атомно-силовой микроскопии

Измерения образцов липосомальных контейнеров и полупроводниковых наночастиц выполнялись по следующей методике:

1) Включить все блоки измерительного комплекса;

2) В зависимости от исследуемого образца и режима измерения выбрать необходимый тип кантилевера;

3) В зависимости от области, которую необходимо исследовать, выбрать сканер на 9 мкм или на 90 мкм;

4) При помощи специальных приспособлений установить кантилевер в насадку;

5) Установить насадку в сканер;

6) Установить сканер в станину микроскопа, подключить разъемы;

7) Устновить в сканер фотодетектор, подключить разъемы;

8) В программе микроскопа выбрать требуемый режим измерения - контактный или прерывисто-контактный;

9) Произвести юстировку лазерного луча и фотодетектора;

10) В случае измерения в осцилляционном режиме выполнить настройку на рабочую частоту кантилевера;

11) Установить исследуемый образец на предметный столик;

12) Сфокусировать видеосистему на кончик кантилевера;

13) Используя видеосистему для контроля, нажатием тумблера “Close/Open” (на блоке электроники) подвести кончик кантилевера максимально близко к поверхности исследуемого образца;

14) Далее действия производятся в программе;

15) Нажатием кнопки “Approach” выполнить автоматическое "приземление" кантилевера на поверхность образца;

16) Установить начальное значение параметров чувствительности “I Gain” и “P Gain” (как правило - 10 %);

17) Ввести значение скорости сканирования “Scan Speed” в линиях в секунду. Как правило, для начала устанавливается 1 линия в секунду;

18) Установить разрешение сканирования 1024;

19) Задав сначала большую область сканирования, выполнить несколько проходов сканера, с помощью кнопки “Down”;

20) Найти на полученном изображении интересующие области, и исследовать их, уменьшив область сканирования;

21) Для получения оптимального качества изображения и уменьшения количества шума, экспериментировать с настройками чувствительности и усиления;

22) После получения изображений интересующих областей остановить процесс сканирования повторным нажатием кнопки “Down”;

23) Сохранить измерительные данные с указанием названия образца;

24) По завершении измерения необходимо отвести кантилевер от поверхности образца, нажав кнопку “Withdraw”;

25) В ПО для обработки результатов выполнить действия для получения данных о профиле поверхности, шероховатости, получить изображения 3D-модели поверхности и т.д.;

26) Сохранить обработанные данные;

27) Выйти из ПО микроскопа, выключить питание всех блоков измерительного комплекса.

Методами атомно-силовой микроскопии (АСМ) определялись геометрические параметры исследуемых образцов в составе сухих пленок. В связи с тем, что липосома имеет в своей основе хрупкую конструкцию для контактных методов АСМ диагностики, был выбран амплитудно-модуляционный режим измерения топологии поверхности пленки. В таком режиме сканирующий зонд АСМ (кантелевер), совершая колебания с контролируемой амплитудой, касается измеряемого объекта не постоянно, а с частотой, соответствующей резонансу колебаний зонда, что приводит к уменьшению давления зонда на поверхность.

АСМ данные топологии участков пленок на основе липосом были получены с помощью АСМ оборудования фирмы Agilent Technologies Inc (USA) AFM 5420. В ходе исследования использовался пьезосканер с диапазонами перемещений по осям XY и Z - 9х9х2 мкм3. Уровень шума для данного сканера составляет <1 Е (СКО) в плоскости XY и <0.2 Е (СКО) по оси Z. Перед началом исследований микроскоп был откалиброван на тестовых образцах TGX11 и TGZ02 . Определение геометрических параметров осуществлялось с помощью программного модуля Gwyddion предназначенного для визуализации и анализа данных, полученных с помощью измерительных средств сканирующей зондовой микроскопии (в том числе АСМ).

Сканирование поверхности образца осуществлялось на нескольких участках (до 5). Максимальный размер области сканирования составил 9х9 мкм2, минимальный - 1х1 мкм. Частота развертки сканирования составила до 1 Гц. В качестве зонда применялся кремниевый кантилевер Type II MACLever фирмы Agilent Technologies со следующими номинальными характеристиками: резонансная частота - 75 КГц; постоянная силы - 2.8 Н/м; радиус кончика - до 10 нм.

На рисунке 29 представлены результаты исследования образцов, содержащих полупровониковые наночастицы, липосомы без квантовых точек и липосомы, наполненные квантовыми точками.

Рис. 29. Результаты исследования образцов, содержащих а) полупроводниковые наночастицы, б,в) липосомы со встроенными наночастицами.

В таблице 9 представлены результаты определения геометрических параметров (значение высоты по Z) полупроводниковых наночастиц, липосомальных контейнеров, изготовленных методом гидратации сухой пленки и липосомальных контейнеров, изготовленных методом выпаривания в обращенной фазе.

Таблица 9 - Результаты определения диаметра полупроводниковых наночастиц, липосомальных контейнеров

Название образца	Выборка (N), шт.	Размер частиц, нм	Ст.отклонение (у), нм
Полупроводниковые наночастицы	50	10±1,8	2
Липосомальные контейнеры, изготовленные методом гидратации сухой пленки	20	70±1,8	5,6
Липосомальные контейнеры, изготовленные методом выпаривания в обращенной фазе	20	80±1,8	13

Следует отметить, что АСМ методы малопригодны для измерения липосом. При исследовании липосом в воздушной среде, контейнеры при испарении воды начинают разрушаться. Дополнительно искажение геометрии контейнеров вызвано воздействием зонда при измерениях в режиме постоянного контакта и прерывистого контакта.

При измерениях в водной среде липосомы не фиксируются на подложке, что приводит к нарушению стабильности контакта зонда и поверхности контейнера.

5.5 Измерение геометрических параметров липосомальных контейнеров и полупроводниковых наночастиц с помощью метода динамического лазерного рассеяния

Измерения образцов липосомальных контейнеров и полупроводниковых наночастиц выполнялись по следующей методике:

1) Включить анализатор частиц. Включить компьютер и запустить программу FLEX. Дать анализатору прогреться в течение 15 минут. Температура в помещении также должна быть постоянной.

2) В программе FLEX, нажав на кнопу «SOP» на панели управления, выставить параметры растворителя (показатель преломления, вязкость при температурах 20 и 30о.С), параметры исследуемых частиц (показатель преломления, если частицы не являются поглощающими), время анализа, количество актов анализа, название образца.

3) Поместить в рабочую ячейку анализатора раствор сравнения, представляющий собой растворитель, для записи сигнала фона. Следить, чтобы во время внесения раствора не образовывались пузырьки воздуха.

4) Записать фоновый сигнал растворителя, нажав на кнопку «S/Z» на панели управления.

5) Удалить растворитель из ячейки анализатора частиц и поместить туда исследуемый раствор. Следить, чтобы во время внесения раствора не образовывались пузырьки воздуха.

6) Нажать на кнопку "LD" на панели инструментов программы FLEX, чтобы запустить экран загрузки анализатора частиц. Программа определит концентрацию образца. Точные показатели преломления для частиц и растворителя необходимы имеено здесь для правильного расчета концентрации. Если «полоса загрузки» слева находится в допустимых пределах, в верхней части окна появится статус «Ready», после чего можно приступить к измерениям, нажав на кнопку «RUN». Если концентрация образца слишком высока («полоса загрузки» слева выше верхнего допустимого предела) необходимо разбавить образец и повторить операцию. Если концентрация слишком низка, и «полоса загрузки» ниже допустимого предела, появится статус «ADD SAMPLE» (добавьте образец).

7) Закрыть программу, сохранив полученные данные.

8) Тщательно промыть рабочую ячейку анализатора сначала специальным раствором, поставляемым в комплекте с прибором, затем - дистиллированной водой.

9) Выключить анализатор частиц. Выключить компьютер.

В таблице 10 представлены результаты определения геометрических параметров полупроводниковых наночастицчастиц, липосомальных контейнеров, изготовленных методом гидратации сухой пленки и липосомальных контейнеров, изготовленных методом выпаривания в обращенной фазе.

Таблица 10 - Результаты измерений полупроводниковых наночастиц и липосомальных контейнеров

Название образца	Размер частиц (пиковоезначение), нм	Разброс, нм
Полупроводниковые наночастицы	8	±4 нм
Липосомальные контейнеры, изготовленные методом гидратации сухой пленки	90	±10 нм
Липосомальные контейнеры, изготовленные методом выпаривания в обращенной фазе	95	±30 нм

На рисунках 30 и 31 представлены графики распределения частиц по размерам в исследованных образцах, полученные на анализаторе частиц Zetatrack (Microtrac, США).



Рис. 30. Графики распределения частиц по размерам в исследованных образцах, полученные на анализаторе частиц. а) полупроводниковые наночастицы, б) липосомальные контейнеры, изготовленные методом гидратации сухой пленки.

Рис. 31. График распределения частиц по размерам в исследованных образцах липосомальных контейнеров, изготовленных методом выпаривания в обращенной фазе, полученные на анализаторе частиц



Заключение

В рамках дипломной работы были решены следующие задачи:

- Был проведен сравнительный анализ 8 методов формирования липосомальных контейнеров со встроенными в них полупроводниковыми наночастицами CdSe/ZnS. По результатам анализа были выбраны для исследования 2 метода изготовления липосом и встраивания в них полупроводниковых наночастиц: метод обращения фаз и метод гидратации сухой пленки. Исследование методов заключалось в измерении среднего значения диаметра липосомальных контейнеров формируемых двумя методами и определении разброса значений диаметра;

- Были выбраны рациональные методы и средства измерения геометрических свойств полупроводниковых частиц и липосомальных контейнеров со встроенными полупроводниковыми наночастицами. Для измерения полупроводниковых наночастиц рациональными методами являются АСМ и ДРС, для измерения липосомальных контейнеров;

- В целях обеспечения единства измерений была проведена калибровка выбранных средств измерений;

- Были проведены измерения геометрических свойств полупроводниковых наночастиц CdSe/ZnS. Среднее значение диаметра полупроводниковых наночастиц измеренных методами АСМ составило 10 нм с неопределенностью ±1,8 нм. Среднее значение диаметра полупроводниковых наночастиц измеренных методами ДРС составило 8 нм;

- Были проведены измерения геометрических свойств липосомальных контейнеров изготовленных исследуемыми методами. Среднее значение диаметр липосомальных контейнеров, изготовленные методом гидратации сухой пленки составил 90 нм с разбросом по диаметру - ±10 нм. Среднее значение диаметра липосомальных контейнеров, изготовленных методом выпаривания в обращенной фазе составил 95 нм с разбросом по диаметру - ±30 нм.

На основании измерений липосомальных контейнеров можно сделать вывод, что метод гидратации сухой пленки обеспечивает минимальный разброс значений диаметра.



Список использованных источников

1. В. Л. Миронов «Основы сканирующей зондовой микроскопии». Учебное пособие для студентов старших курсов высших учебных заведений;

2. Нагорнов Ю.С., Ясников И.С., Тюрьков М.Н. «Способы исследования поверхности методами атомно-силовой и электронной микроскопии». Уч...