Рис. 1. Нормированные по максимуму интенсивности спектры люминесценции водного раствора БТШ70 (1, 2) и его комплекса с АТФ (3, 4) при лвозб = 260 нм (1, 3) и лвозб = 295 нм (2, 4)

Несмотря на значительное превышение количества фенилаланина над триптофаном и тирозином, вклад люминесценции этой аминокислоты (лmax = 282 нм) в люминесценцию БТШ70 не наблюдается изза более низкого коэффициента молярной экстинкции и низкого квантового выхода флуоресценции. Обычно квантовый выход флуоресценции тирозина в белке значительно меньше квантового выхода тирозина в растворе за счет усиления различных процессов диссипации энергии возбуждения в белке, в том числе и путем переноса энергии возбуждения на триптофан [5]. БТШ70 принадлежит к немногочисленному классу белков, в которых наблюдается люминесценция тирозина (лmax = 303 нм) (рис. 1, спектр 1). Присоединение АТФ не меняет форму спектра люминесценции БТШ70 при лвозб = 260 нм (рис. 1, спектр 3), несмотря на то, что поглощение АТФ при данной длине волны значительно больше поглощения ароматических аминокислот. Квантовый выход флуоресценции АТФ в воде при комнатной температуре очень низкий (?10-4 [6]), и отсутствие изменений в спектре БТШ70 при связывании с АТФ говорит о том, что квантовый выход флуоресценции АТФ при этом не увеличивается.

Рис. 2. Изменение интенсивности люминесценции водного раствора БТШ70 (1) и его комплекса с АТФ (2) при повышении температуры. лвозб = 295 нм, лрег = 335 нм

Триптофановые остатки в составе молекулы БТШ 70 расположены по одному в каждом функциональном концевом домене [7], поэтому спектр испускания БТШ70 с максимумом 335 нм при лвозб = 295 нм (рис. 1, спектр 2) обусловлен только люминесценцией триптофана в гидрофобном неполярном окружении. При увеличении полярности среды максимум спектра люминесценции триптофана должен сдвигаться в длинноволновую сторону до 350 нм в водном растворе [5]. Взаимодействие АТФ с NН2-концевым доменом БТШ 70 приводит к незначительному гипсохромному сдвигу максимума спектра люминесценции триптофана на 3 нм (рис. 1, спектр 4). Такой же незначительный сдвиг наблюдался в люминесценции бактериального белка теплового шока DnaK при связывании с АТФ [8]. Т. о., можно полагать, что в комплексе БТШ70-АТФ-Mg2+ микроокружение триптофана становится чуть более гидрофобным, возможно, за счет стабилизации белковой глобулы.

Стабилизацию вторичной структуры БТШ70 при добавлении АТФ подтверждают полученные нами данные по тепловой денатурации БТШ70 и комплекса БТШ70-АТФ-Mg2+, представленные на рис. 2 и рис. 3.

На рис. 2 показаны зависимости интенсивности люминесценции БТШ70 и его комплекса с АТФ (возбуждение 295 нм, испускание 335 нм) от температуры. Видно, что при повышении температуры до 42оС интенсивность люминесценции БТШ70 (рис. 2, кривая 1) падает, что связано, очевидно, с увеличением эффективности безызлучательной деградации возбужденного состояния люминофора (температурное тушение). Далее, в диапазоне температур 42-52оС, интенсивность увеличивается. Известно [5], что для триптофана при переходе в полярное водное окружение кроме батохромного сдвига спектра наблюдается также и возрастание квантового выхода флуоресценции. Таким образом, можно заключить, что подобный ход кривой 1 на рис. 2 связан с изменением конформации макромолекулы белка, в результате которого микроокружение триптофанов меняется с гидрофобного на гидрофильное, т. е. происходит разворачивание макромолекулы (тепловая денатурация). При этом, как было показано в [4], денатурация БТШ70 необратима. При повышении температуры выше 52оС снова наблюдается уменьшение интенсивности люминесценции денатурированного белка за счет температурного тушения.

Как видно из рис. 2, добавление АТФ к БТШ70 приводит к значительному температурному сдвигу конформационного перехода. По нашему мнению, первая производная интенсивности по температуре (рис. 3) лучше подчеркивает различия в характере тепловой денатурации БТШ70 и его комплекса с АТФ.

Температура плавления комплекса, определенная по максимуму первой производной интенсивности перехода от температуры, на 9оС больше температуры плавления БТШ70 (Рис. 3). Наблюдается также большая высота и значительно меньшая полуширина пика первой производной комплекса по сравнению и пиком БТШ70, что говорит о более сильной кооперативности и более «тонкой настройке» вторичной структуры комплекса БТШ70-АТФ-Mg2+.

Рис. 3. Первая производная интенсивности люминесценции водного раствора БТШ70 (1) и его комплекса с АТФ (2) по температуре. Исходные данные приведены на рис. 2

Таким образом, показано, что связывание БТШ70 с АТФ в присутствии ионов Mg2+слабо меняет форму спектров люминесценции, но приводит к стабилизации конформации белка и сдвигу температуры плавления приблизительно на 9оС.

Работа выполнена с использованием оборудования ресурсного центра «Оптические и лазерные исследования» научного парка СПбГУ.

Литература

1. Bukau B., Horwich, A.L. The Hsp70 and Hsp60 chaperone machines // Cell. 1998. V. 92. P. 351-366.

2. Srivastava P. K., Menoret A., Basu S., Binder R. J., McQuade K. L. Heat shock proteins come of age: primitive functions acquire new roles in an adaptive world // Immunity. 1998. V. 8. P. 657-665.

3. Mayer M. P, Bukau B. Hsp70 chaperones: cellular functions and molecular mechanism // Cell.Mol.Life Sci. 2005. V. 62. № 6. P. 670-684.

4. Букина М. Н., Бакулев В. М., Бармасов А. В., Жахов А. В., Ищенко А. М. Спектральнолюминесцентные проявления изменения конформации белка БТШ70 в процессе тепловой денатурации // Оптика и Спектроскопия. 2015. Т. 118. № 6. С. 930-932.

5. Lakowicz J. R. Principles of Fluorescence Spectroscopy, NY.: Plenum Press, 1999. 954 p.

6. Kononov A. I., Bukina M. N. Luminescence excitation spectra reveal low-lying excited states in stacked adenine bases // J. Biom. Struct. Dyn. 2002. V. 20. P. 465-472.

7. Черников В. А., Гороховец Н. В., Савватеева Л. В., Северин С. Е. Функциональная характеристика доменов и междоменных взаимодействий в рекомбинантных белках HSP70 человека // Молекулярная биология. 2011. Т. 45. № 5. С. 903-913.

8. Vogel M., Mayer M. P., Bukau B. Allosteric Regulation of Hsp70 Chaperones Involves a Conserved Interdomain Linker // J. Biol. Chem. 2006. V. 281. P. 38705-38711.

Размещено на Allbest.ru