Универсальная шкала хроматографических времен удерживания биомакромолекул в задачах "скорострельной" протеомики

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Автореферат

диссертации на соискание учёной степени кандидата физико-математических наук

Универсальная шкала хроматографических времен удерживания биомакромолекул в задачах «скорострельной» протеомики

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы

В последние годы одним из наиболее быстро развивающихся направлений в науках о живых организмах стала «протеомика». Основной задачей протеомики является исследование белкового состава клеток живых организмов (протеом). Сложность этой задачи требует использования мощных аналитических средств, способных отслеживать карту протеома, изменяющуюся в зависимости от физиологических и патогенных состояний организма, что оказывает стимулирующее влияние на развитие высокопроизводительных методов так называемой «скорострельной» (в англоязычной литературе «shotgun») протеомики.

К аналитическим средствам, используемым в протеомике, в первую очередь, относятся такие физико-химические методы как масс-спектрометрия и жидкостная хроматография. В настоящее время масс-спектрометрия позволяет проводить измерения масс сложных биоорганических молекул с относительной точностью порядка одной миллионной в широком массовом диапазоне, в то время как воспроизводимость хроматографического разделения сложных смесей биомолекул достигает нескольких секунд в рамках продолжительного (до нескольких часов) хромато-масс-спектрометрического эксперимента. Благодаря прогрессу, достигнутому в последние годы в области хромато-масс-спектрометрических методов анализа биомолекул, одним из перспективных методов высокопроизводительной идентификации белков является подход, основанный на создании и использовании баз данных точных масс и хроматографических времен удерживания пептидных маркеров белков (Accurate Mass and Time tags, AMT). Создание баз данных AMT требует одновременных усилий со стороны разных исследовательских групп в рамках совместных проектов, однако, хроматографические данные в них оказываются привязанными к конкретным экспериментальным условиям и не переносимы с одной инструментальной платформы на другую. В диссертации рассматривается подход к решению этой проблемы. Актуальность темы исследования обусловлена необходимостью развития хромато-масс-спектрометрических методов «скорострельной» протеомики для использования в масштабных исследованиях протеомов живых организмов и их количественного анализа в рамках совместных исследований, включая реализацию международного проекта «Протеом человека».

Цель и задачи исследования

Основной целью работы является развитие метода жидкостной хроматографии на основе баз данных точных масс и времен удерживания пептидных маркеров белков для использования его в задачах «скорострельной» протеомики. Для реализации поставленной цели в рамках представленной работы были определены следующие конкретные задачи исследований:

(1) создание единой универсальной временной шкалы на основе концепции линейной корреляции времен удерживания, получаемых в различных экспериментальных условиях;

(2) экспериментальное исследование диапазона хроматографических условий, в которых наблюдается линейная зависимость хроматографических времен удерживания пептидов;

(3) проведение модельных экспериментов, создание прототипов баз данных AMT в универсальной шкале времен удерживания для статистически значимых массивов экспериментальных данных сложных смесей протеолитических пептидов, а также исследование точности представленных в них времен;

(4) теоретическое описание нелинейных эффектов в хроматографии полипептидов, в частности, инверсии времен удерживания пептидов при изменении хроматографических условий разделения;

(5) проверка возможности предсказания времен удерживания белков в обращено-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) и идентификация точечных модификаций их аминокислотных последовательностей с целью возможного расширения применимости метода AMT для прямой идентификации белков, минуя стадию протеолитического гидролиза.

Используемые методы исследований

Эксперименты по разделению и идентификации индивидуальных пептидов и их смесей проводились на трех нано ВЭЖХ системах: две Agilent 1100 и одна Ultimate 3000 (Dionex). Каждая из трех ВЭЖХ систем была соединена с гибридными масс-спектрометрами LTQ-FT (Thermo Fisher, Бремен, Германия) с использованием хроматографических колонок со стационарной фазой C₁₈. Для идентификации пептидов применялось несколько методов фрагментации ионов: фрагментация в результате столкновения с молекулами буферного газа (ДАС, CAD) в ионной ловушке и фрагментация в результате захвата медленных электронов (ДЭЗ, ECD) в ловушке ионного циклотронного резонанса (ИЦР). Спектры фрагментации использовались для восстановления пептидов по базе данных NCBI с помощью поисковых систем Mascot и X! Tandem.

В качестве образцов были использованы следующие коммерческие стандарты: триптические гидролизаты белка Cytochrome с и смеси шести белков (6 Protein Mixture: Bovine serum albumin, в-Galactosidase, Lysozyme, Alcohol dehydrogenase, Cytochrome c, Apo-transferrin) производства компании Dionex/LCPacking (США).

Эксперименты по разделению модельных белков (Cytochrome с из организмов Equine, Bovine, Canine, производства Sigma-Aldrich и Calbiochem) и их пепсиновых гидролизатов были проведены на ВЭЖХ системе Janeiro CNS (Thermo Scientific, Швейцария) с использованием хроматографической колонки со стационарной фазой C₁₈. Хроматографическая система была соединена с масс-спектрометром LTQ XL (Thermo Scientific, Бремен, Германия), в качестве метода фрагментации родительских ионов был выбран метод CAD.

Расчеты хроматографических времен удерживания производились с помощью модели критической хроматографии биомакромолекул BioLCCC (Liquid Chromatography of Biomolecules at Critical Conditions).

Научная новизна

Впервые было предложено использование физико-химической модели жидкостной критической хроматографии для идентификации полипептидов и белков на основе метода точных масс и времен удерживания AMT, а также предложен и реализован метод приведения хроматографических данных полипептидов и белков к единой временной шкале для создания универсальных баз данных AMT. Обнаружено и впервые описано явление инверсии порядка выхода пептидов с близкими временами удерживания при ВЭЖХ разделении на обращенной фазе в зависимости от их аминокислотного состава и их последовательности при изменении параметров хроматографической колонки (длина, размер пор, внутренний диаметр) и профиля градиента сильного растворителя. Определен масштаб явления инверсии в протеомных исследованиях при изменении профиля градиента сильного растворителя.

Положения, выносимые на защиту

1. Концепция линейности хроматографических данных, получаемых при разделении пептидов в различных экспериментальных условиях.

2. Результаты экспериментальных исследований условий разделения для определения границ применимости концепции линейности хроматографических данных.

3. Метод многоточечной нормализации экспериментальных хроматографических времен пептидов к универсальной временной шкале, основанный на использовании модели критической жидкостной хроматографии макромолекул для предсказания времен удерживания.

4. Результаты определения точности приведения хроматографических данных к единой универсальной шкале времен на основе создания прототипа базы данных AMT для смесей протеолитических пептидов модельных белков.

5. Результаты исследования явления инверсии порядка выхода пептидов с близкими временами удерживания при ВЭЖХ разделении на обращенной фазе в зависимости от их аминокислотного состава и их последовательности при изменении параметров хроматографической колонки (длина, размер пор, внутренний диаметр) и профиля градиента сильного растворителя. Определение масштаба явления инверсии в протеомных исследованиях.

6. Результаты исследования возможности предсказания времен удерживания целых белков при их разделении методом обращено-фазовой ВЭЖХ. Результаты разделения модельных белков, включая белки-гомологи, отличающиеся точечными мутациями аминокислотных последовательностей и теоретических расчетов их времен удерживания.

Научная и практическая ценность

Полученные результаты могут быть использованы специалистами в области высокоэффективной жидкостной хроматографии, а также протеомных исследований для решения следующих задач: развитие новых методов разделения смесей сложных веществ органического и биоорганического происхождения; разработка новых разделительных сред, обладающих высокой специфичностью по удерживанию макромолекул с заданными физико-химическими свойствами; фильтрация масс-спектрометрических идентификаций, получаемых при анализе протеомов живых организмов; создание баз данных времен удерживания для высокопроизводительного анализа белков; реализация хроматографически зависимых методов количественного анализа протеолитических смесей на основе мониторинга уникальных фрагментационных переходов MRM/SRM; разработка методов «скорострельной» протеомики на основе многомерной «предсказательной» хроматографии в сочетании с масс-спектрометрией; а также разработка новых поисковых протеомных машин, основанных на использовании хроматографических данных.

Личный вклад автора

Материал, представленный в диссертации, получен при непосредственном участии автора в реализации задач исследований, в выполнении экспериментов, в обсуждении и анализе полученных результатов. Диссертационная работа выполнена в период с 2007 по 2011 год.

Апробация работы

Результаты работы докладывались и обсуждались на следующих российских и международных конференциях: 35-ом конгрессе Международного хроматографического общества по высокоэффективной жидкостной хроматографии HPLC-2010 (Бостон, США, 2010), 57-ой и 58-ой конференции Американского масс-спектрометрического общества (Денвер, США, 2008 и Солт-Лейк-Сити, США, 2010), VI-ом Российском симпозиуме «Белки пептиды» (Казань, 2009), 50-ой, 51-ой и 52-ой научной конференции МФТИ (Москва, 2008, 2009, 2010), 3-ей международной конференции - школе «Масс-спектрометрия в химической физике, биофизике и энергетике» (Звенигород, 2007), III, IV и V Всероссийской конференции с международным участием Всероссийского масс-спектрометрического общества «Масс-спектрометрия и ее прикладные проблемы» (Москва, 2007, 2009, 2011).

Работы, вошедшие в диссертацию, были выполнены при поддержке РФФИ (гранты №№09-08-00663, 08-04-01339), программы президиума РАН №П8, Американского фонда гражданских исследований и развития АФГИР (грант CDRF RUB1-2909-MO-07) и Международного фонда поддержки науки ИНТАС (гранты №04-83-2643 и Genomics-05-1000004-7759).

Объем и структура диссертации

Работа изложена на 150 страницах, иллюстрирована 25 рисунками и содержит 13 таблиц. Диссертация состоит из введения, пяти глав, включая литературный обзор, основных результатов и выводов, списка цитируемой литературы, насчитывающей 70 наименований, трех приложений.

Содержание работы

хроматография пептид белок

Во введении обоснована актуальность темы диссертации и сформулирована цель исследования, приведены положения, выносимые на защиту.

Глава 1 является литературным обзором, посвящена хромато-масс-спектрометрии как основному методу исследования в протеомике. Рассмотрены основные проблемы, возникающие при идентификации белков в биологических смесях, представлены возможные пути их решения. Показаны роль высокоэффективной жидкостной хроматографии в анализе макромолекул и потенциальные возможности теоретических аналитических расчетов хроматографических данных разделяемых биомакромолекул. Приведен обзор существующих математических и полуэмпирических подходов к расчету времен удерживания пептидов.

Глава 2 содержит теоретическое описание модели жидкостной хроматографии биополимеров в критических условиях (BioLCCC). Рассматриваются основные предположения, которые легли в основу модели BioLCCC. Также в главе представлено теоретическое описание подхода многоточечной нормализации (МТН) хроматографических данных пептидов и обоснованы критерии выбора единой временной шкалы для реализации такой нормализации.

Основные уравнения градиентной хроматографии. Модель критической жидкостной хроматографии биомакромолекул BioLCCC аналитически описывается следующей системой уравнений:

(1)

В системе уравнений (1), определяющей объем удерживания V_R биомакромолекул в условиях градиентного элюирования, главным является уравнение (1с), связывающее коэффициент распределения K_d, численно совпадающий со статистической суммой цепи в поре, с ее микроскопическим строением. Состояние макромолекулы в поре задается цепью случайных блужданий, описываемых переходной матрицей W. Уравнение (1с) описывает конкуренцию между энергией притяжения, стремящейся упорядочить состояние звеньев на поверхности, и потерями энтропии. Произведение переходных матриц в (1с) некоммутативно и зависит от последовательности аминокислотных остатков. Таким образом, в диссертации показано, что текст последовательности заложен порядком произведения матриц. Модель одновременно учитывает и химическую природу аминокислотных остатков через их энергию адсорбции , и их последовательность, место в цепи, а также описывает все возможные режимы разделения - адсорбционный (LAC), эксклюзионный (SEC) и критический (LCCC).

Остальные параметры в системе уравнений (1): V₀ - объем межчастичного пространства (объем подвижной фазы), V_P - объем пор (объем неподвижной фазы), D - размер пор, выраженный в единицах размера звена, N_B - мольная доля одного из компонентов растворителя, V - объем прокачанного через колонку растворителя. U - единичный вектор-столбец, задающий начальное распределение С-концевой группы в поре. Феноменологическими параметрами модели являются эффективные энергии адсорбции , описывающие взаимодействие аминокислотных остатков с поверхностью. Стандартные энергии адсорбции аминокислотных остатков X⁰_i (выраженные в единицах kT) при pH 2.0 на обращенной фазе C₁₈ приведены в таблице 1.

Обозначения аминокислотных остатков соответствуют общепринятым. Параметры, описывающие энергии адсорбции молекул воды и ацетонитрила, равны, соответственно, е_A=0 kT, е_B=2,40 kT. В диссертации использовался тот факт, что природные белки обычно имеют концевые группы H₂N- и - COOH, энергии которых составляют - 1,69 kT и - 0,03 kT, соответственно.

Таблица 1. Стандартные энергии адсорбции природных аминокислот X⁰_i, выраженные в единицах kT.

Рис. 1. Схематическое представление стандартизации экспериментальных времен удерживания пептидов методом многоточечной нормализации с использованием модели BioLCCC для расчёта теоретических времен удерживания

Многоточечная нормализация хроматографических времен удерживания к универсальной шкале времен. В диссертации показано, что, используя предсказанные времена удерживания для выбранного пептидного стандарта и свойство линейной корреляции хроматографических данных, получаемых в различных условиях разделения, можно ввести новую шкалу времени, в которой экспериментальные значения времен удерживания исследуемых пептидов будут иметь одни и те же (для одних и тех же пептидов) нормализованные времена. Шкала нормализованных времен строится следующим образом: выбирается пептидный стандарт, для которого рассчитываются теоретические значения времен удерживания в условиях единого, заранее определенного протокола разделения («базисный» протокол). Далее теоретические времена удерживания для пептидов стандарта нормализуются в диапазоне [0; 1], где время удерживания для наиболее гидрофобного пептида стандарта выбирается равным единице. Подставляя экспериментальные и нормализованные теоретические значения времен удерживания для пептидов стандарта в линейное уравнение (2а):

(2а)

определяются калибровочные коэффициенты a и b. Используя полученные калибровочные коэффициенты a и b, все экспериментальные времена для исследуемых пептидов переводятся в новую шкалу нормализованных времен с помощью линейного уравнения:

(2b)

Такой подход к стандартизации хроматографических времен удерживания был назван авторами методом многоточечной нормализации (МТН).

Подробное пошаговое описание процедуры стандартизации времен, использованной в данной работе, схематически представлено на Рис. 1. В работе в качестве стандартного («базисного») протокола предлагается использовать протокол, являющийся стандартным в микроколоночной хроматографии пептидов. В качестве стандартной смеси для построения шкалы и калибровки разделительных систем были использованы пептиды Cytochrome c.

Глава 3 посвящена экспериментальному исследованию диапазона хроматографических условий, в которых наблюдается линейная зависимость хроматографических времен удерживания пептидов, а также проведению модельных экспериментов, созданию прототипов баз данных AMT в универсальной шкале времен удерживания для статистически значимых массивов экспериментальных данных сложных смесей протеолитических пептидов и исследованию точности представленных в них времен.

При определении диапазона были рассмотрены условия, типичные для протеомных исследований с использованием методов ВЭЖХ-МС/МС: обращенная фаза C₁₈ в качестве адсорбента, размер пор в диапазоне от 90 до 300Е, смесь вода / ацетонитрил (АЦН) в качестве бинарного растворителя со значениями pH в диапазоне 2,0ч3,0 и линейные профили градиентов с наклоном 0,2ч1,7% АЦН/мин. В качестве ион-парных агентов в ВЭЖХ-МС, как правило, использовалась муравьиная кислота. Хроматографические колонки, применявшиеся в этих исследованиях, представлены в Таблице 2А. Эксперименты по разделению и идентификации пептидов из гидролизата шести белков проводились в рамках совместной работы с учеными из Университета Уппсалы в Швеции, лаборатории исследования динамики протеомов Министерства атомной энергетики Франции в Гренобле и Института биохимической физики РАН в Москве с использованием различных инструментальных систем и протоколов ВЭЖХ, представленных в Таблице2Б.

Таблица 2. Условия хроматографических экспериментов, использованных при тестировании концепции линейности хроматографических данных

При определении диапазона применимости концепции линейности хроматографических данных было показано, что для обращенных фаз C₁₈ различного типа (силикагелевые, монолитные и полимерные) наблюдается высокая степень линейной корреляции хроматографических данных (в среднем R² = 0,985ч0,995). В Таблице 3 представлены результаты некоторых экспериментов, в которых изменялись следующие условия разделения: (1) профиль градиента (при фиксированных колонке I и скорости подачи растворителя (300 нл/мин)); (2) скорость подачи растворителя (при фиксированных колонке I и наклоне градиента 0,8% В/мин); а также (3) параметры колонок при разделении в двух различных градиентах 1,7% В/мин и 0,3% В/мин и фиксированном потоке - 300 нл/мин.

Таблица 3. Коэффициенты линейной корреляции экспериментальных времен удерживания пептидов белка Cytochrome c для различных условий разделения, колонок и протоколов.

Создание прототипа базы данных AMT для смесей протеолитических пептидов модельных белков методом МТН. Экспериментальная проверка предложенной процедуры нормализации осуществлялась на примере смеси триптических пептидов шести белков. В состав смеси также входили пептиды белка Cytochrome c, по которым осуществлялась нормализация времен удерживания всех пептидов смеси («внутренняя калибровка»). Данные, полученные в различных лабораториях, были объединены в три группы: (1) пептиды, идентифицированные в Москве и Гренобле (174 пептида); (2) пептиды, идентифицированные в Москве и Упсале (103 пептида); а также (3) идентификации, общие для всех трех лабораторий (69 пептидов). При этом стандартные отклонения для полученных нормализованных хроматографических времен идентифицированных пептидов составляли, соответственно: 1,4%, 1,6% и 1,5%. В диссертации показано, что приведение хроматографических времен удерживания, полученных на разных инструментальных платформах и при различных параметрах разделения протеолитической смеси, к единой шкале выявило соответствие между нормализованными временами удерживания для одних и тех же пептидов с точностью порядка 1,5% при калибровке системы ВЭЖХ по внутреннему стандарту.

Продемонстрировано, что использование альтернативных моделей предсказания времен удерживания позволяет получать сопоставимые данные по точности нормализованных времен удерживания. Так, точность «внутренней калибровки» с использованием доступного алгоритма SSRCalc (Sequence Specific Retention Calculator) для расчёта времен удерживания варьировалась в пределах 0,9-1,5%. Следует отметить, что полуэмпирический алгоритм SSRCalc считается наиболее точным алгоритмом вычисления времен удерживания триптических пептидов и широко используется в протеомных исследованиях. Однако, в настоящее время этот алгоритм разработан, во-первых, для ограниченного количества экспериментальных условий разделения, и изменение, например, размера поры, профиля градиента, требует перенастройки алгоритма, а во-вторых, только для триптических пептидов. Модель BioLCCC не имеет указанных недостатков и позволяет рассчитывать времена удерживания при любых условиях ВЭЖХ на обращенной фазе C₁₈ для произвольно заданных профилей градиента и параметров колонки. При этом в силу малого количества феноменологических параметров модель BioLCCC может быть легко адаптирована для работы с различными фазами.

Предложенная в диссертации процедура нормализации времен удерживания пептидов позволяет стандартизовать экспериментальные данные, полученные в рамках градиентной ВЭЖХ на обращенной фазе типа C₁₈ при различных профилях градиента, параметрах колонок и мобильных фазах. Предложенный подход к нормализации времен удерживания пептидов и приведения их к единой временной шкале может быть использован в задачах идентификации белков методами «скорострельной» протеомики и при создании баз данных точных масс и времен удерживания пептидных маркеров белков AMT.

В Главе 4 представлены результаты изучения нелинейных эффектов в хроматографии полипептидов, в частности, явления инверсии времен удерживания пептидов при изменении хроматографических условий разделения и результаты исследования масштаба их влияния на идентификацию пептидов на основе использования баз данных AMT.

Модель BioLCCC позволяет вычислить изменения коэффициентов распределения K_d для выбранных пептидов в зависимости от процентного содержания органического растворителя % АЦН в мобильной фазе и построить кинетические кривые K_d(%АЦН). В случае пересечения кинетических кривых даже незначительные вариации экспериментальных параметров (габариты колонки при фиксированном размере пор, наклон профиля градиента, скорость подвижной фазы) могут приводить к изменениям времен выхода полипептидов вплоть до инверсии времен удерживания. В связи с этим, интересным представляется ряд вопросов, связанных с масштабом этого явления. К таким вопросам относятся: зависимость количества пар пептидов с измененными порядками выхода от состава и размера выборки пептидов; масштаб изменения профиля градиента, при котором число пар пептидов с инверсией становится значимым при работе с базами данных AMT; возможность теоретической оценки числа пар пептидов с изменившимися порядками выхода в зависимости от условий хроматографического эксперимента.

В модели BioLCCC при фиксированных энергиях адсорбции аминокислот и компонент мобильной фазы с поверхностью адсорбента, а также при фиксированном размере пор адсорбента, на угол наклона ц кинетической кривой влияет не только длина пептида, но и его аминокислотный состав и последовательность. На Рис. 2 показана ситуация, когда более длинный пептид в инверсионной паре сильнее удерживается в пологом градиенте, а при более крутом градиенте - наоборот, имеет меньшее время удерживания. Это наиболее распространенная ситуация (примерно 95% всех случаев инверсии порядка выхода) в проанализированных экспериментальных данных. Кинетическая кривая для пептида TGPNLHGLFGR (количество аминокислотных остатков в цепи N = 12, средняя энергия адсорбции пептида = 0.891 kT) характеризуется большим углом наклона ц в резко возрастающей части кривой, в то время как для более короткого пептида MIFAGIK (N = 8, = 1.099 kT) этот наклон меньше. При этом оказывается, что в медленном градиенте (Рис. 2В) более короткий пептид на протяжении всего эксперимента движется быстрее длинного пептида. В градиенте с резким наклоном (Рис. 2Б) характер движения пептидов в колонке меняется: на начальном этапе короткий пептид движется быстрее, но по мере нарастания концентрации АЦН скорость перемещения короткого пептида уменьшается относительно скорости перемещения длинного пептида. В определенный момент времени координаты их положения в колонке становятся равными - эта точка обозначена на рисунке как точка инверсии - после прохождения этой точки длинный пептид начинает обгонять короткий. С точки зрения модели BioLCCC, такая картина разделения трактуется следующим образом. В медленном градиенте при разделении преобладает адсорбционный режим, при котором большим удерживанием характеризуются молекулы большего размера. В то время как, при разделении в градиентах с резким наклоном, по мере нарастания концентрации АЦН происходит смена режима с адсорбционного на эксклюзионный, что приводит к изменению порядка выхода пептидов. Графики 2А-В демонстрируют, что пептиды в течение градиентного элюирования движутся в критической области с ускорениями, зависящими от скорости нарастания концентрации более сильного растворителя. При этом для пептидов с близкими временами удерживания существуют экспериментальные параметры разделения, при которых изменение профиля элюирования приводит к инверсии порядка выхода пептидов из колонки. В более нетривиальном случае существуют пары пептидов одинаковой длины, и даже одинакового состава аминокислотных остатков, но разной последовательности, для которых модель предсказывает изменение порядка выхода.

Рис. 2. (А) Зависимость коэффициента распределения для пептидов TGPNLHGLFGR и MIFAGIK от процентного содержания ацетонитрила в подвижной фазе, где K_d* = 1/(1+K_d), (Б) и (В) кинетические кривые коэффициента распределения от времени для выбранных пептидов в резком (1,3% АЦН/мин) и пологом (0,2% АЦН/мин) градиентах

Результаты обработки как полученных автором, так и литературных данных показали, что количество пептидов, вовлеченных в перестановки друг относительно друга при смене градиента, может достигать 90% от общего числа пептидов в выборке. При этом в диссертации показано, что для всех используемых экспериментальных условий минимальное количество пептидов, участвующих в перестановках при смене градиента составило не менее 50% от общего числа пар в рассмотренной выборке. Отмечено, что явление инверсии порядка выхода пептидов необходимо учитывать при использовании хроматографических времен в качестве фильтра ложно-положительных идентификаций пептидов для предотвращения потери правильных идентификаций (как показал анализ экспериментальных данных, проведенный в работе, такие потери могут достигать ~ 20%).

В главе 5 представлены результаты исследования возможности предсказания времен удерживания целых белков в обращено-фазовой ВЭЖХ и идентификации точечных модификаций их аминокислотных последовательностей с целью возможного расширения применимости метода AMT для прямой идентификации белков без использования протеолитического гидролиза.

Исследование возможности предсказания времен удерживания целых белков при их разделении методом обращено-фазовой ВЭЖХ. В работе на примере литературных данных была продемонстрирована возможность модели BioLCCC предсказывать разделение целых белков в широком диапазоне длин аминокислотных последовательностей. В Таблице 4 представлены хроматографические системы, которые были использованы для разделения следующих белков: Cytochrome с Equine (N = 104, = 1,026 kT), Ribonuclease a bovine (N = 124, = 1,014 kT), Lysozyme chicken (N = 129, =1,091 kT), Rabbit skeletal troponin (N = 159, = 1,175 kT), Chymotrypsinogen A bovine (N = 245, = 1,164 kT), Tropomyosin-1 rabbit (N = 284, = 1,080 kT), Enolase baker's yeast (N = 436, =1,155 kT), Bovine Serum Albumin BSA (N = 583, =1,173 kT), Ovalbumin chicken (N = 386, =1,240 kT), myoglobin (N = 152, =1,159 kT), и Insuline Chain B (N = 36, =1,132 kT). Последовательности белков были взяты из базы данных UniProt (http://www.uniprot.org/).

В работе было показано, что модель BioLCCC позволяет предсказывать времена удерживания целых белков с высокой точностью. В частности, для описанных выше белков коэффициент линейной корреляции экспериментальных и расчетных данных составил R²=0,86-0,97. Следует отметить, что такая точность недостижима для альтернативных моделей расчета времен удерживания. Более того, большинство существующих алгоритмов позволяют рассчитывать времена удерживания полипептидов с длинами аминокислотных последовательностей, не превышающими N ~ 50.

В работе была продемонстрирована высокая корреляция (R²=0,99-1,00) между расчетными и экспериментальными временами удерживания для одного и того же белка на разных системах. При этом было сделано заключение, что макроскопические свойства хроматографических систем, а также конкретные условия разделения, достаточно точно учитываются моделью, а их случайные различия усредняются. Другими словами, даже если предсказанное и экспериментальное время удерживания какого-то белка различаются, это различие воспроизводимо на разных системах, т.е. можно использовать времена удерживания, получаемые теоретически, в качестве единой временной шкалы.

Таблица 4. Хроматографические системы, применяемые для разделения белков (ТФА - трифторуксусная кислота, АЦН - ацетонитрил).

Разделения модельных белков-гомологов, возможность теоретического расчета времен удерживания. Возможность предсказывать времена удерживания белков и пептидов в зависимости от их аминокислотной последовательности позволяет решать задачи, связанные с идентификацией белков с незначительными отличиями в последовательности (мутациями) или имеющими модифицированные аминокислотные остатки. Влияние перестановки двух разных аминокислот в цепи (или изменение места модифицированной группы в цепи, что является, по сути одинаковыми задачами) на адсорбционное взаимодействие макромолекулы можно условно разделить на химическое и физическое. Под первым (химическим) подразумевается взаимное влияние ближайших соседей переставляемых групп. Второе (физическое) влияние более универсально и вытекает непосредственно из связывания аминокислот в цепь и некоммутативности произведения матриц, описывающих такое связывание. В соответствии с этим, даже если перестановка разных аминокислот не приводит к изменению их эффективной энергии и, следовательно, средней энергии звена гомополимера, адсорбционное взаимодействие всей макромолекулы может заметно измениться. Какой из факторов более значим для адсорбционного взаимодействия, зависит от конкретного белка и его последовательности. При определенных обстоятельствах физический фактор усиливается с ростом длины цепи и для длинных макромолекул белков может оказаться определяющим.

Рис. 3. Сравнение расчетных и экспериментальных времен удерживания для белков Cytochrome c разных организмов. Представлены кандидаты, выданные поисковой машиной Mascot по результатам ВЭЖХ/МС/МС анализа протеолитических пептидов этих белков. Условия элюирования белков: A:5% АЦН+0.1% FA в H₂O; B:95% АЦН+0.1% FA в H₂O; градиент 0-35% B за 120 мин; скорость потока 0,2 мл/мин; при комнатной температуре; ЖХ колонка BIO WidePore C₁₈ 300 ?, 150х2,1 мм, 5 мкм

В диссертации показано, что можно хроматографически различить два близких по последовательности белка, отличающихся, например, заменой или перестановкой нескольких остатков (так называемыми, точечными мутациями). В качестве таких белков с точечными мутациями нами были выбраны белки-гомологи Cytochrome c, принадлежащие разным организмам - Bovine, Equine и Canine. Cytochrome c Bovine отличается от Equine заменой остатков T S (47) в положении 47, K G (60), T G (88), а Canine, соответственно, заменой T S (47), K G (60), K T (87), T G (88), E A (92) и N K (103). Средние энергии адсорбции для этих белков (без учета концевых групп, дающих одинаковый небольшой вклад) равны: =1,043 kT (Equine, Bovine) и =1,047 kT (Canine), т.е. очень близки или совпадают. При этом времена удерживания этих белков существенно различаются. Результат сопоставления экспериментальных и расчетных времен удерживания для этих последовательностей приведен на Рис. 3 и демонстрирует высокую точность модели BioLCCC при предсказании времен удерживания таких сложных (с точки зрения масс-спектрометрической идентификации) систем. Этот пример показывает, что «предсказательная» хроматография белков может служить дополнительным инструментом для анализа биомакромолекул с небольшими отличиями в последовательности.

Основные результаты и выводы

1. Предложена процедура создания универсальной шкалы времен удерживания для баз данных AMT и процедура приведения экспериментальных хроматографических данных к этой шкале на основе метода многоточечной нормализации и модели жидкостной критической хроматографии биомакромолекул. Продемонстрировано на примере пептидной смеси гидролизата шести белков, что точность приведения хроматографических данных пептидов к единой временной шкале составляет 1-2%.

2. Экспериментально исследован диапазон хроматографических условий, в которых применим метод многоточечной нормализации и приведения времен удерживания к единой нормализованной шкале. Показано, что этот диапазон покрывает хроматографические протоколы, широко используемые в современных протеомных исследованиях.

3. Теоретически исследовано и экспериментально показано явление инверсии порядка выхода пептидов при смене профиля градиентного элюирования. Предложен механизм этого явления. Показано, что если не учитывать явление инверсии порядка выхода при работе с хроматографическими фильтрами, потери правильных пептидных идентификаций могут достигать ~20%.

4. Показана возможность предсказания времен удерживания целых белков в обращенно-фазовой ВЭЖХ, и экспериментально продемонстрирована применимость «предсказательной» хроматографии на основе модели BioLCCC для идентификации белков, различающихся точечными заменами аминокислотных остатков.

Основные результаты диссертации изложены в следующих публикациях

1. Толмачев Д.А., Вилков А.Н., Агапов А.Ю., Тарасова И.А., Новоселов К.Р., Сагуленко П.Н., Шитов С.С., Придатченко М.Л., Дорошенко В.М., Горшков М.В. Масс-спектрометр ионного циклотронного резонанса на постоянном магните с атмосферным источником ионизации // Масс-спектрометрия. 2008. Т. 5, №2. С. 83-102.

2. Tarasova I.A., Guryca V., Pridatchenko M.L., Gorshkov A.V., Kieffer-Jaquinod S., Evreinov V.V., Masselon C.D., Gorshkov M.V. Standardization of retention time data for AMT tag proteomics database generation // Journal of Chromatography B. 2009. Т. 877, С. 433-440.

3. Придатченко М.Л., Тарасова И.А., Гурыча В., Кононихин А.С., Адамс К., Толмачов Д.А., Агапов А.Ю., Евреинов В.В., Попов И.А., Николаев Е.Н., Зубарев Р.А., Горшков А.В., Масселон К.Д., Горшков М.В. Использование моделей хроматографического разделения для создания баз данных AMT в задачах «скорострельной» протеомики // Биохимия. 2009. Т. 74, №11, С. 1469-1478.

4. Придатченко М.Л., Тарасова И.А., Масселон К.Д., Горшков А.В., Горшков М.В. Единый подход к созданию универсальных баз данных точных масс и времен удерживания на основе модели критической хроматографии биомакромолекул // Труды МФТИ. 2009. Т. 1, №1, Долгопрудный С. 94-103.

5. Perlova T. Yu., Margolin Y., Pridatchenko M.L., Tarasova I.A., Goloborodko A.A., Gorshkov A.V., Moskovets E., Ivanov A.R., Gorshkov M.V., Retention time prediction using the model of liquid chromatography of biomacromolecules at critical conditions in LC-MS phosphopeptide analysis // Proteomics. 2010. Т. 10, №19, С. 3458-68.

6. Pridatchenko M.L., Perlova T. Yu., Hamidane H.B., Goloborodko A.A., Tarasova A.A., Gorshkov A.V., Evreenov V.V., Tsybin Yu.O., Gorshkov M.V., On the utility of predictive chromatography to complement mass spectrometry-based intact protein identification // Analytical and Bioanalytical Chemistry. 2011. принято в печать.

7. Горшков А.В., Евреинов В.В., Придатченко М.Л., Тарасова И.А., Филатова Н.Н., Роздина И.Г., Горшков М.В., О применимости концепции критической хроматографии к анализу белков. Зависимость времен удерживания от последовательности аминокислотных остатков в цепи // Высокомолекулярные соединения А. 2011. Т. 53, №12, С. 1-16.

8. Придатченко М.Л., Тарасова И.А., Горшков М.В. Тарасова И.А., Универсальная шкала времен удерживания биомакромолекул в задачах «скорострельной» протеомики // V Всероссийская конференция «Масс-спектрометрия и ее прикладные проблемы». 2011. Москва, РФ, МБУ-2, С. 66.

9. Перлова Т.Ю., Горшков А.В., Евреинов В.В., Придатченко М.Л., Горшков М.В., Хроматомасс-спектрометрически анализ пептидов: инверсия хроматографических порядков выхода и ее влияние на точность ВЭЖХ-МС идентификаций // Четвертая Всероссийская конференция с элементами научной школы для молодежи «Фундаментальные вопросы масс-спектрометрии и ее аналитические применения». 2010. Звенигород, РФ. С. 90.

10. Горшков А.В., Придатченко М.Л., Голобородько А.А., Тарасова И.А., Перлова Т.Ю., Евреинов В.В., Горшков М.В., Жидкостная хроматография как комплементарный масс-спектрометрическому метод анализа биомакромолекул // Четвертая Всероссийская конференция с элементами научной школы для молодежи «Фундаментальные вопросы масс-спектрометрии и ее аналитические применения». 2010. Звенигород, РФ. С. 92.

11. Голобородько А.А. Перлова Т.Ю., Придатченко М.Л., Горшков А.В. Иванов А.Р., Зубарев Р.А., Горшков М.В., Экспериментальный подход к анализу достоверности масс-спектрометрических идентификаций пептидов // Четвертая Всероссийская конференция с элементами научной школы для молодежи «Фундаментальные вопросы масс-спектрометрии и ее аналитические применения». 2010. Звенигород, РФ. С. 113.

12. Pridatchenko M.L., Perlova T. Yu., Tarasova I.A., Goloborodko A.A., Gorshkov A.V., Evreinov V.V., Tsybin Yu.O., and Gorshkov M.V., On the utility of critical chromatography of biomacromolecules to predict protein retention in gradient HPLC // 35th International Symposium on High Performance Liquid Phase Separations and Related Techniques. 2010. Boston, Massachussets, USA. P-308-T.

13. Perlova T. Yu., Gorshkov A.V., Evreinov V.V., Goloborodko A.A., Pridatchenko M.L., Tarasova I.A., Moskovets E., Ivanov A.R., and Gorshkov M.V., Basics of the model of liquid chromatography of biomacromolecules at critical conditions: theory and experimental applications // 35th International Symposium on High Performance Liquid Phase Separations and Related Techniques. 2010. Boston, Massachussets, USA. P-2806-W.

14. Goloborodko A.A., Perlova T. Yu., Pridatchenko M.L., Gorshkov A.V., Tarasova I.A., Moskovets E., Gorshkov M.V., and Ivanov A.R., Calibration of user-defined LC-MS systems for complementary filtering and validation of MS based identifications by «predictive» chromatography of biomacromolecules // 58th ASMS Conference on Mass Spectrometry and Allied Topics. 2010. Salt Lake City, Utah. ThP 413.

15. Придатченко М.Л., Тарасова И.А., Горшков М.В., Филатова Н.Н., Роздина И.Г., Горшков А.В., Евреинов В.В., О применимости модели критической хроматографии BioLCCC к анализу белков // IV Российский симпозиум «Белки и пептиды». 2009. Казань, РФ, C. 131.

16. Перлова Т.Ю., Тарасова И.А., Придатченко М.Л., Иванов А.Р., Горшков М.В., Модель критической хроматографии биомакромолекул в задачах фосфопротеомики // IV Российский симпозиум «Белки и пептиды». 2009. Казань, РФ, C. 297.

17. Тарасова И.А., Горшков А.В., Евреинов В.В., Придатченко М.Л., Голобородько А.А., Перлова Т.Ю., Горшков М.В., Критическая хроматография белков и пептидов в задачах протеомики: возможно ли чтение текста последовательности? // IV Российский симпозиум «Белки и пептиды». 2009. Казань, РФ, C. 139.

18. Перлова Т.Ю., Тарасова И.А., Придатченко М.Л., Голобородько А.А., Евреинов В.В., Горшков А.А., Иванов А.Р., Горшков М.В., Калибровка феноменологических параметров модели критической жидкостной хроматографии биомакромолекул // 52-я Научная конференция МФТИ. 2009. Москва, РФ. С. 108-111.

19. Тарасова И.А., Горшков А.В., Евреинов В.В., Масселон К.Д., Гурыча В., Придатченко М.Л., Горшков М.В., Изменение порядка выхода пептидов при изменении условий градиентного элюирования в ВЭЖХ на обращённой фазе: о возможном объяснении с точки зрения теории критической хроматографии биомакромолекул // III Всероссийская конференция «Масс-спектрометрия и ее прикладные проблемы». 2009. Москва, РФ, МБС-6, С. 80.

20. Pridatchenko M.L., Tarasova I.A., Kononikhin A.S., Guricya V., Tolmachev D.A., Agapov A. Yu., Adams C., Popov I.A., Gorshkov A.V., Masselon C.D., Zubarev R.A., Nikolaev E.N., Gorshkov M.V.; Standard Retention Time Scale for Collaborative Generation of Accurate Mass and Time Tag(AMT) Databases // 56^th ASMS Conference on Mass Spectrometry and Allied Topic. 2008. Denver, Colorado, MP-656.

21. Шитов С.С., Горшков А.В., Горшков М.В., Тарасова И.А., Придатченко М.Л., Учет нелокальных взаимодействий в модели критической жидкостной хроматографии биомакромолекул // Труды 51-й научной конференции МФТИ. 2008. Москва, РФ. C. 110-113.

22. Придатченко М.Л., Тарасова И.А., Масселон К.Д., Горшков А.В., Горшков М.В., Стандартизация хроматографических данных для макромолекул в условиях градиентной ВЭЖХ // 3-я Международная Конференция - школа. 2007. Звенигород, РФ. C. 78.

23. Тарасова И.А., Горшков А.В., Евреинов В.В., Голобородько А.А., Шитов С.С., Придатченко М.Л., Горшков М.В., Теоретический хроматограф: практическая реализация концепции жидкостной хроматографии в критических условиях // 3-я Международная Конференция - школа. 2007. Звенигород, РФ. С. 48.

24. Придатченко М.Л., Тарасова И.А., Масселон К., Горшков А.В., Горшков М.В., Единый подход к созданию универсальных баз данных точных масс и времен удерживания пептидных маркеров белков на основе модели критической хроматографии биомакромолекул // Труды 50 конференции МФТИ. 2007. Долгопрудный, РФ. С. 100-102.

25. Tarasova I.A., Masselon C.D., Pridatchenko M.L., Kieffer-Jaquinod S., Gyryca V., Garin J., Gorshkov A.V., Evreinov V.V., Gorshkov M.V., Retention time conversion for cross-platform transfer of HPLC-MS/MS proteomics data // 55^th ASMS Conference on Mass Spectrometry and Allied Topics. 2007. Indianapolis, Indiana, TP-144.

26. Придатченко М.Л., Тарасова И.А., Масселон К.Д., Горшков А.В., Горшков М.В., Универсальный подход к созданию баз данных времен удерживания и точных масс пептидов // Третий съезд ВМСО, II Всероссийская конференция с международным участием, «Масс-спектрометрия и ее прикладные проблемы». 2007. Москва, РФ. С. МБС-5.

Размещено на Allbest.ru