Исследование реакции бактериальной люминесценции под воздействием электромагнитного излучения миллиметрового и инфракрасного диапазонов

Размещено на http://www.allbest.ru

Размещено на http://www.allbest.ru

В последнее время возрос интерес к исследованиям и практическому использованию различных видов электромагнитных излучений в химии и химической технологии, в частности, при проведении реакций гетерогенного катализа (см. обзор [1]) и модификации полимерных материалов [2].

Известно, что СВЧ-излучение оказывает влияние на ионные группировки и перераспределение воды между гидратными и ион-ионными формами [3].

Исследования воздействия СВЧ-излучения на живые организмы показали, что оно может применяться как средство дебактеризации пищевых продуктов [4, 5].

Работы, посвященные исследованиям нетеплового воздействия СВЧ- и ИК-излучениям на микроорганизмы [6-8], показали, что в основе молекулярного механизма влияния на клетки лежит активация многослойной адсорбции молекул воды на гидрофильной поверхности за счет смещения деформации электронной плотности молекул и изменения дипольного момента молекул.

При запуске процесса многослойной адсорбции происходит вытеснение ионов Н+ за пределы адсорбированных слоев в область с повышенной концентрацией Н+, таким образом, возникает градиент концентрации протонов (Дмн+), являющийся одним из трех конвертируемых форм энергии [9].

Экспериментальная часть.

Материалы и методы.

Подготовка проб. Подготовка к проведению измерений включала регидратацию и приготовление рабочего разведения лиофилизированного индикаторного штамма люминесцентных бактерий (проба) E. coli lum+ с помощью воды очищенной имеющей рН 7.0±0.2 и охлажденной до температуры (6±2) °С. Затем разведенную индикаторную культуру выдерживали не менее 30 мин при температуре (22±2) °С.

Экспериментальные установки. В качестве объектов исследования выступали пробы, облучаемые инфракрасным излучением с длиной волны л = 850-890 нм и СВЧ-излучением миллиметрового диапазона с л = 8.14; 4.9 и 5.6 мм.

Схема экспериментальной установки для СВЧ-облучения проб с длиной волны л = 8.14 мм показана на рис. 1.

Рис. 1. Схема установки для облучения проб на л = 8.14 мм.

Источником излучения служил генератор Г4-156 на диоде Ганна 1, обеспечивающий генерацию плоскополяризованного излучения мощностью порядка 20 мВт в режиме непрерывной генерации. СВЧ-сигнал с выхода генератора через развязывающий ферритовый вентиль 2, аттенюатор 3, согласующий Е-Н трансформатор 4 поступал на рупорную СВЧ-антенну 5 с раскрывом прямоугольной формы 72Ч34 мм.

Линза 6 формировала пучок СВЧ-излучения (волна Н10) и направляла его на полимерную (полиэтиленовую) пробирку круглого сечения с пробой, установленную на пенопластовой подставке 7, проз-рачной для данного излучения. Вектор напряженности электрического поля был ориентирован вертикально. Сечение СВЧ-пучка на уровне половинной мощности и пробирка с пробой представлены в левой части рис. 1.

Суммарные потери энергии: потери в антенно-волноводном тракте, рассеяние за пределами сечения на уровне половинной мощности и отражение от поверхности полимерной пробирки составляли порядка 30% генерируемой мощности, таким образом поток мощности СВЧ-излучения, воздействовавший на исследуемую пробу, составлял порядка 0.4 мВт/см2. Расстояние от раскрыва антенны до центра пробирки составляло 38 см, что с учетом применения СВЧ-линзы обеспечивало работу в дальней волновой зоне антенны.

На рис. 2а изображена схема установки для облучения проб СВЧ-излучением с л = 5.6 мм и 4.9 мм. В качестве генератора 1 был использован аппарат МИЛТА-КВЧ НПО «Космического приборострое-ния» (Россия) с выходной мощностью 10 мВт. СВЧ-излучение (волна Н11) распространялось по волноводу круг-лого сечения 2 и в виде расходящейся волны облучало пробирку с пробой 3.

Рис. 2. Схема установки для облучения проб: а - СВЧ-излучением с л = 5.6 мм и 4,9 мм; б - ИК-излучением с л = 850-890 нм

Расстояние между раскрывом волновода и пробиркой было выбрано порядка 1 см, что с одной стороны обеспечивало работу в дальней зоне , где d - диаметр раскрыва волновода, для л = 5.6 мм d = 4.5 мм и R = 7.2 мм; для л = 4.9 мм d = 4.0 мм и R = 6.5 мм, с другой стороны пробирка находилась внутри сечения СВЧ-пучка на уровне половинной мощности, которое по нашим расчетам составляло порядка 1 см.

Вектор напряженности электрического поля был ориентирован горизонтально. Внутри сечения СВЧ-пучка на уровне половинной мощности волна Н11 по структуре близка к волне Н10.

В качестве источника излучения ИК-диапазона использовался аппарат МИЛТА-Ф-8-01 НПО «Космического приборостроения» (Россия), включающий в себя ИК-лазер и ИК-светодиоды, работающие в диапазоне л = 850-890 нм.

Импульсная мощность излучения лазера составляла 21 Вт, а непрерывная мощность излучения светодиодов (4 шт) - 100 мВт. На рис. 2б представлена схема установка для облучения проб ИК-излучением, состоявшая из камеры 1 с размещенными в ней ИК-лазером 2 и светодиодами 3.

Пробирка с пробой размешалась внутри камеры 1 так, что дно прилегало к излучающей поверх-ности лазера и крепилась сверху на отражающей алюминиевой опоре 5.

Измерение биолюминисценции. Определение биолюминесценции под воздействием излучения в отношении энтеробактерий проводили с помощью экспресс-теста ингибирования биолюминесцен-ции индикаторного штамма Escherichia coli lum+ [10]. Уровень гашения (стимуляции) свечения индикаторной культуры определяли с помощью люминометра Биотокс-10 ООО «НЕРА-С» (Россия) через фиксированные промежутки времени после облучения: 10 мин, 1, 2, 3, 4, 5 и 24 ч. Эффект воздействия излучения выражали в виде цифрового показателя ИАА=, где х1 и х2 - интенсивности свечения индикаторного штамма без и после облучения соответственно [10]. Обработку данных проводили с помощью программного обеспечения MS Excel.

Результаты и их обсуждение

1. Эксперименты по воздействию СВЧ и лазерного ИК-излучения на биолюминисценцию тест-штамма.

При проведении биолюминесцентного теста было выявлено несколько вариантов развития реакции ингибирования и/или стимулирования свечения индикаторного штамма E. coli lum+ после воздействия на него электро-магнитного излучения (ЭМИ) (рис. 3-5).

Установлено, что СВЧ-излучение сразу повышает люминесценцию сенсора, особенно на л = 4.9 мм более 80% (рис. 3). При использовании лазерного ИК-излучения после кратко-срочного периода начального ингибирования (85% при 10 мин экспозиции (рис. 7), 17% на частоте лазера 0.6 и 5 кГц, 7% в режиме без модуляции при 5 мин экспозиции (рис. 6) и 9.5% при 2 мин, 0.6 кГц (рис. 5)) наступала фаза стимуляции свечения сенсора.

Рис. 3. Влияние СВЧ-излучения на биолюминесценцию E. coli lum+. Время экспозиции 60 мин.

При двухминутном облучении пробы немодулированным лазерным излучением наблюдались незначительные изменения в свечении относительно контрольного образца (рис. 5), аналогичная картина была и при облучении пробы в течение часа СВЧ-излучением на л = 8.14 мм (рис. 4).

При уменьшении времени экспозиции до 20 мин при облучении на л = 8.14 мм уровень биолюминисценции значительно увеличился через 5 часов.

При облучении образца в течение 10 мин модулированным лазерным излучением наблюдаются два максимума свечения, с величиной ИАА = -41 и -33.5 (рис. 7).

При экспозиции в течение 5 мин также наблюдаются два максимума ИАА = -40.5 и -27.3 (штрихпунктирная линия на рис. 6) без модуляции и ИАА = -7.6 и -41.2 на частоте модуляции лазера 0.6 кГц (сплошная линия на рис. 6) и ИАА = -15.6 и -33.5 на 5 кГц (пунктирная линия на рис. 6).

Рис. 4. Влияние СВЧ-излучения на биолюминесценцию E. coli lum+. Время экспозиции 60 мин, длина волны 8.14 мм.

Рис. 5. Влияние ИК-излучения на биолюминесценцию E. coli lum+. Время экспозиции 2 мин.

Рис. 6. Влияние ИК-излучения на биолюминесценцию E. coli lum+. Время экспозиции 5 мин.

Рис. 7. Влияние ИК-излучения на биолюминесценцию E. coli lum+. Время экспозиции 10 мин.

При 2-х минутной экспозиции с частотой модуляции лазерного излучения 5 кГц наблюдается один максимум ИАА = -64.(пунктирная линия на рис. 5).

В опыте с СВЧ-излучением на л = 4.9 мм уровень свечения в течение первых 3-х часов монотонно снижался до ИАА = -33, а затем оставался постоянным.

На л = 5.6 мм в течение первых 2-х частов наблюдалось незначительное снижение ИАА, которое затем монотонно повышалось до ИАА = -55, спустя 24 ч после экспозиции (рис. 3).

Влияние ИК- и СВЧ-излучения на штамм E. coli lum+ на протяжении первых часов экспозиции было различным - после воздействия ИК-излучением наблюдалось вначале ингибирование или соответствие ИАА контрольного образца, а при воздействии СВЧ-излучением имела место стимуляция свечения.

Было показано, что после 24 ч пробы, обработанные ИК-излучением сохраняли стимуляцию свечения, аналогичное явление наблюдалось и после воздействия СВЧ-излучения с л = 4.9 и 5.6 мм (рис. 3).

СВЧ-излучение с л = 8.14 мм с временем экспозиции 60 мин, приводило к спаду интенсивности свечения до уровня контрольного образца (рис. 4).

2. Обсуждение воздействия модуляции лазерного ИК-излучения на биолюминисценцию тест-штамма.

Согласно полученным данным по влиянию лазерного ИК-излучения с различной частотой модуляции совместно с некогерентным ИК-излучением светодиодов на уровень биолюминесценции можно констатировать, что молекулы-акцепторы пробы имеют порог насыщения, после которого наступает точка бифуркации.

Различные порции энергии, сообщаемые молекулам-акцепторам, в зависимости от частоты модуляции, приводят к различным эффектам.

Причем, чем меньше время облучения, тем больше должна быть частота модуляции, чтобы добиться стимуляции люминесценции и наоборот, чем больше время экспозиции, тем частота модуляции должна быть меньше (рис. 5-7).

Взаимодействие системы с внешним излучением ИК-диапазона (взаимодействие эндо-генных и экзогенных флуктуаций), ее погружение в неравновесные условия может стать исходным пунктом в формировании новых динамических состояний - диссипативных структур.

Диссипативная структура отвечает форме супермолекулярной организации, возникающей в результате коллективных взаимодействий элементов системы (молекул).

При заданных граничных условиях в сильно нелинейной системе могут существовать не одно, а несколько стационарных состояний. Переход из одного состояния в другое играет важную роль в механизмах управления, встречающихся в биологических системах.

Нативные среды представляют собой молекулы воды в граничных условиях нелинейной сильно неравновесной системы и могут находиться в нескольких состояниях (стабильных и метастабильных), крайние из которых можно условно обозначить: НОНn (некогерентное) и НОН*n (когерентное).

При этом условие неравновесности состояний является источником организации материи [11].

В проведенных экспериментах с люминесцентным тест-штаммом диссипативными структурами выступали адсорбированные слои воды на гидрофильной поверхности как б-спи-рали люциферазы и других гидрофильных поверхностей.

3. Обсуждение воздействия ЭМИ с различной длиной волны в миллиметровом СВЧ-диапазоне на люминесценцию.

Анализ динамики биолюминесценции тест-штамма после различных влияний ЭМИ позволяет сделать вывод о его значительном адаптационном потенциале и о специфичности раз-вития реакции стимуляции, обусловленной временем, длиной волны и режимами излучения.

Сопоставляя полученные результаты, следует отметить наибольшую чувствительность тест-штамма к СВЧ-излучению на л = 4.9 и 5.6 мм с экспозицией 60 мин и ИК-излучению с 2-х минутной экспозицией при частоте модуляции лазерного излучения 5 кГц и 5-ти минутной в режиме непрерывной генерации.

Анализ полученных результатов позволяет сделать вывод о том, что воздействие СВЧ- и ИК-излучения на биолюминисценцию связано с избирательным поглощением электромагнитного излучения. Низкоэнергетические внешние воздействия существенно влияют на биохимические процессы, включая весь энергетический обмен микроорганизмов в целом.

При этом происходят молекулярные структурные перестройки, связанные с перераспределением электронной плотности молекул-акцепторов, сопровождающиеся каскадными реакциями с накоплением ионов Н+ в «кислотных резервуарах» путем вытеснения из адсорбированных слоев молекул воды на гидрофильных поверхностях. На рис. 8 показано как под воздействием квантов ЭМИ hн1 на б-спирали белковых молекул происходит усиленная адсорбция молекул воды (выноска в увеличенном масштабе). В результате образуются многослойные надмолекулярные комплексы, при этом происходит диссоциация части молекул воды, сопровождающаяся вытеснением протонов с образованием градиента их концентрации Дмн+. Энергия ЭМИ переходит в энергию диполь-дипольного взаимодействия и накапливается в адсорбированных слоях воды и в градиенте Дмн+. Вытесненные протоны восстанавливают FMN (структурная формула приведена в правом верхнем углу рис. 8) до FMNH2. Затем FMNH2 отдает протон и два электрона через переносчик люмиредоксин, восстанавливая цитохром Р-450 (на рисунке не показаны). При этом выделяющаяся избыточная энергия уносится квантами светового излучения hн2.

сверхвысокочастотный биолюминисценция лазерный

Рис. 8. Механизм воздействия ЭМИ на биолюминесценцию

Предложенный механизм объясняет длительное сохранение эффекта воздействия ЭМИ на реакцию люминесценции. Однако данное предположение требует дополнительной проверки.

Полученные в настоящем исследовании результаты согласуются с результатами других авторов и свидетельствуют о целесообразности исследований по использованию СВЧ- и ИК-излучений при проведении технологических процессов на биофармацевтическом производстве.

Выводы:

1. Миллиметровое (4.9; 5.6; 8.14 мм) и лазерное инфракрасное (л = 850-890 нм) нетепловые излучения оказывают выраженный стимулирующий эффект на люминесценцию сенсора - индикаторного штамма E. coli lum+ . Влияние данных электромагнитных излучений носит пролонгированный характер.

2. Время облучения (2, 5 и 10 мин) ИК-излучением и частота импульсного режима лазерного излучения (режим непрерывной генерации, и модуляции с частотой 0.6 кГц, 5 кГц) различно влияют на биолюминесценцию тест-штамма - E. coli lum+.

3. В первый час после облучения тест-штамма - E. coli lum+ лазерным ИК-излучением (л = 850-890 нм) на 5 и 10 мин экспозиции наблюдается ингибирование люминесценции, которое постепенно переходит в стимуляцию.

4. Для увеличения стимуляции люминесценции тест-штамма - E. coli lum+ лазерным ИК-излучением (л = 850-890 нм) при меньшем (чем 5 мин) времени экспозиции требуется большая частота лазерной модуляции, и наоборот, чем больше времени экспозиции, тем меньше нужна частота его модуляции.

Литература

1. Абакачева Е.М., Сулейманов Д.Ф., Шулаев Н.С. Исследование физико-механических свойств полимерных материалов, модифицированных в электромагнитном поле СВЧ-диапазона. Бутлеровские сообщения. 2011. Т.24. №1. С.95-98.

2. Бикбулатов И.Х., Даминев Р.Р., Шулаев Н.С., Шулаева Е.А. Применение электромагнитного излучения СВЧ диапазона в химической технологии. Бутлеровские сообщения. 2009. Т.18. №8. С.1-28.

3. Кузнецов Д.Б. Молекулярные механизмы воздействия инфракрасного излучения на микроорганизмы. Фундаментальные исследования. 2013. №4. Ч.2. C.414-418.

4. Кузнецов Д.Б. Перспективы применения электромагнитных излучений крайне высокой частоты малой мощности в фармации. Фундаментальные исследования. 2012. №10. Ч.2. С.400-404.

5. Кузнецов Д.Б. Физико-химические механизмы воздействия крайне-высокочастотного излучения на микроорганизмы. Современные проблемы науки и образования. 2013. №1; URL: http://www.science-education.ru/107-8226 (дата обращения: 28.01.2013).

6. Несчисляев В.А., Пшеничнов Р.А., Арчакова Е.Г., Чистохина Л.П., Фадеева И.В. Способ определения антагонистической активности пробиотиков. Патент на изобретение № 2187801 от 20.08.2002 г. Заявка № 2000118391. Приоритет № 2000118391/14 от 10.07.00 г. Бюл. № 23.

7. Пригожин И. Стенгерс И. «Порядок из хаоса» Новый диалог человека с природой. Перевод с английского Данилова Ю.А. под редакцией Аршинова В.И. М.: Прогресс. 1986. 432с.

8. Путько В.Ф., Головина К.В., Пурыгин В.А., Васильева Т.И., Советкин Д.А., Пурыгин П.П. Исследование воздействия СВЧ электромагнитного поля на микрофлору и насекомых какао-порошка. Бутлеровские сообщения. 2012. Т.31. №8. С.79-82.

9. Путько В.Ф., Головина К.В., Пурыгин В.А., Васильева Т.И., Советкин Д.А., Пурыгин П.П. Физические способы дебактеризации какао-бобов и какао-порошка. Бутлеровские сообщения. 2012. Т.31. №8. С.83-85.

10. Романовский ЮМ, Тихонов А.Н. Молекулярные преобразователи энергии живой клетки. Протонная АТФ-синтаза - вращающийся молекулярный мотор УФН 180. 2010. С.931-956.

11. Филимонова З.А., Лященко А.К. Сравнение диэлектрических характеристик водных и водно-формамидных растворов нитратов калия и натрия в диапазоне СВЧ. Бутлеровские сообщения. 2011. Т.27. №14. С.74-80.

Размещено на Allbest.ru