Измерение функции рассеяния точки для методов компьютерного микроскопного сверхразрешениякопного сверхразрешения

Размещено на http://allbest.ru

¹ФГБУН Конструкторско-технологический институт научного приборостроения СОРАН

²Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования «Новосибирский национальный исследовательский государственный университет»

Измерение функции рассеяния точки для методов компьютерного микроскопного сверхразрешения

И.Г. Пальчикова^1,2, Е.С. Смирнов¹

г. Новосибирск

Хорошую основу для количественных измерений микроскопных изображений и развития методов компьютерной цитофотометрии [1] составляет современная элементная база фотоники. Развитие цифровой фотографии и цифровых технологий обработки изображений создает новые возможности для исследований в области микроскопии. Современные цифровые фотокамеры [2] предлагают широкий диапазон различных настроек, обеспечивают хорошую пространственную детализацию изображений, характерный размер пикселя составляет ~ 4 - 6 мкм. Динамический диапазон аналого-цифрового преобразования изображения расширился до 16 битов. компьютерной цитофотометрия микрообъектив

Шумовые сигналы контролируются и могут быть обработаны аппаратными средствами фотокамеры или внешними программными средствами. Все вышеперечисленное привело к тому, что погрешности измерений ДНК в клеточном ядре, окрашенном по Р. Фельгену, значимые в классических методах [3] цитофотометрии, в современных компьютеризованных установках [4] становятся малыми. Вместе с тем существенный вклад в ошибку распределения начинает давать дифракция света [5] в процессе регистрации микроизображения, которая приводит к тому, что искажается распределение оптической плотности в цифровом изображении клеточного ядра.

В результате дифракции света в микроскопе точка предмета изображается в виде кружка рассеяния, а в хорошо коррегированных оптических системах - в виде кружка Эйри. Этот эффект наиболее сильно проявляется в изображении границы ядра, затрудняя процесс сегментации изображения.

Современные методы обработки цифровых изображений позволяют исключить эффект размытия границы путем выполнения операции деконволюции цифрового изображения с функцией рассеяния точки (ФРТ) изображающей оптической системы, если определена ее ФРТ.

В настоящей работе приводятся результаты экспериментального определения ФРТ микроскопа цитофотометрической установки, представленной в [1]. В экспериментах для получения микроизображений использовался исследовательский микроскоп DIALUX 20 EB (Leitz) с набором микрообъективов.

Для получения монохроматичного освещения использовались интерференционные светофильтры (500, 600 и 650 нм) с полушириной полосы пропускания 5 нм, устанавливаемые после галогенного осветителя микроскопа и конденсора. Изображение регистрировалось с помощью цифровой камеры CANON EOS 500D. Все расчеты производились с помощью ПК и программных пакетов EXCEL и MATHCAD.

ФРТ, по определению, - это распределение интенсивности света в изображении точечного самосветящегося предмета (монохроматического, в когерентном случае). Из этого определения вытекают несколько задач, которые мы решили в наших экспериментах. Во-первых, предмет должен быть точечным, т.е. он должен иметь размеры, меньшие, чем предельно разрешимые с помощью исследуемого микрообъектива. Мы решили эту задачу путем разработки и изготовления специальных тестовых микрообъектов в пленках хрома. Во-вторых, передаточная характеристика цифровой камеры должна быть линейной во всем требуемом динамическом диапазоне. В третьих, размер элементов фотоматрицы должен быть таким, чтобы ФРТ восстанавливалась из экспериментальных значений в пикселях с высокой степенью достоверности и т.д. Мы выбрали и откалибровали [1, 2] цифровую камеру CANON EOS 1100 D с управлением через USB, которая удовлетворяет всем требованиям.

Эксперименты по изучению ФРТ проводились с микрообъективами ЛОМО небольшого увеличения (2ч10 крат). Микрообъекты (рис. 1) выполнены методами фотолитографии в тонких пленках хрома на стандартных стеклянных (К8) положках в виде дифракционных микроструктур «светящаяся точка» (в виде кругов и квадратов) с характерными размерами, приведёнными в таблице 1.

Таблица 1 - Размеры микрообъектов, мкм

Рисунок 1 - Фотография микрообъектов в виде круглых и квадратных, пропускающих и поглощающих свет площадок в тонких пленках хрома с оптической плотностью 1,05. Характерные размеры кружков и квадратов: 22, 11, 9, 7, 5, 3 мкм .

Экспериментальное изучение ФРТ

Для получения изображений были использованы объективы 4/0,1 и 2/0,07, расчетное линейное разрешение которых составляло 3,97 и 5,66 мкм соответственно, и интерференционный светофильтр с длиной волны 650 нм. В качестве тестового был использован дифракционный тест-объект (№4-2), обладающий 8,96% пропускания света. Измерение ФРТ проводилось с объективом 4/0,1 путем фотографирования дифракционного объекта в проходящем свете. Для исключения влияния на изображение остаточной хроматической аберрации и виньетирования, отдельно фотографировался фоновый кадр - поле изображения микроскопа в отсутствие предметов, для последующей нормировки получаемых снимков. При фотографировании фона применяется тот же светофильтр, что и для кадра с дифракционным объектом.

При измерении ФРТ важно правильно навестись на фокус. Для исключения ошибки расфокусировки изображения производилась серия снимков одного тестового объекта, начиная с положения столика микроскопа, которому соответствует размытое изображение, затем изображение фокусировалось и снова размывалось дефокусировкой по мере движения столика микроскопа по вертикальной направляющей снизу вверх. В среднем, за одно перемещение столик поднимался на 3,76 мкм.

То есть, фотографирование производилось при различных положениях столика микроскопа по высоте вблизи фокальной плоскости микрообъектива. Получено более 100 фотографий. Для отбора наиболее сфокусированного изображения использовалась шкала из штрихов тестового объекта. Вдоль всей шкалы (поперек делений) делалась выборка однопиксельной линии, для цифровых значений которой определялась величина дисперсии значений яркости. Кадры с максимальным значением дисперсии отбирались, как наиболее сфокусированные. Дальнейшие картинки и графики приводятся для ряда отобранных изображений.

Настройки цифровой камеры, время выдержки выбирались таким образом, чтобы матрица камеры работала в линейном режиме [2]. Теоретические возможности чувствительности CANON EOS1100 D позволяют зафиксировать до десяти светлых колец диска Эйри. Однако реальные технические возможности матрицы значительно уступают за счёт присутствия темнового шума (в среднем до 3 дБ), который позволяет различить до 2_х колец Эйри, как показано на рис. 2. Экспериментально различить третье кольцо диска Эйри при комнатной температуре не представляется возможным.

Рисунок 2 - К возможностям современных цифровых 14-битных камер

Зависимость падения уровня интенсивности от номера кольца определяется полиномом: , с достоверностью 1,00.

Экспериментальные результаты приведены на рисунках 3 - 8.

Рисунок 3 - Экспериментально найденный трехмерный график ФРТ объектива 4/0,1, полученной с помощью квадратного отверстия размером 3,37 мкм, изображение которого приведено справа в градациях серого (1 (макс.) - белый, 0 (мин.) - черный).

Рисунок 4 - Сечение через «вершину» объемного графика ФРТ в горизонтальном (а) и вертикальном направлении.

Были получены ФРТ (650 нм) микрообъектива 2/0,07 и построены графики (рисунки 5 - 8).

Рисунок 5 - Экспериментально полученная ФРТ круглого (а) и квадратного (б) отверстия размером 5 мкм. Цвета условные: 1 (макс.) - белый, 0 (мин.) - черный.

а) б)

Рисунок 6 - Экспериментально полученный трехмерный график ФРТ круглого(а) и квадратного (б) отверстия размером 5 мкм с помощью объектива 2/0,07.

а) б)

Рисунок 7 - Сечение через «вершину» объемного графика ФРТ в горизонтальном (а) и вертикальном (б) направлении графика.

а) б)

Рисунок 8 - Сечение через «вершину» объемного графика ФРТ в горизонтальном (а) и вертикальном (б) направлении графика.

Вывод

Разработаны специализированные дифракционные микрообъекты и метод экспериментального определения ФРТ устройства компьютерной цитофотометрии.

Литература

1. Пальчикова И. Г. Компьютерная цитофотометрия / Омельянчук Л. В., Пальчиков Е. И., Смирнов Е.С., Каманина Н.В. / Оптико-информационные измерительные и лазерные технологии и системы: юбилейный сборник избранных трудов КТИ НП СО РАН. ? Новосибирск : Академическое изд-во «Гео», 2012. ? С. 375 - 398.

2. Особенности применения цифровых камер для цитофотометрического определения количества ДНК в ядрах клеток / И.Г. Пальчикова, Л.В. Омельянчук, Е.И. Пальчиков, Е.С. Смирнов, В.Ф. Семешин // Датчики и системы. - 2012. - №3. - С. 2-12.

3. Агроскин Л.С., Папаян Г.В. Цитофотометрия. Аппаратура и методы анализа клеток по светопоглощению. Л.: Наука, 1977, 295 с.

4. Puech M. Giroud F. Standardisation of DNA quantitation by image analysis: quality control of instrumentation // Cytometry. 1999. Vol. 36. P. 11-17.

5. Пальчикова И.Г. О влиянии дифракции на результаты количественной цитофотометрии / И.Г. Пальчикова, Л.В. Омельянчук, Е.С. Смирнов // Автометрия. - 2012. - Т.48 - №6. - С.92-101.

Аннотация

Измерение функции рассеяния точки для методов компьютерного микроскопного сверхразрешения. И.Г. Пальчикова^1,2, Е.С. Смирнов¹

¹ФГБУН Конструкторско-технологический институт научного приборостроения СОРАН, г. Новосибирск,

²Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования «Новосибирский национальный исследовательский государственный университет», г. Новосибирск

Разработан метод экспериментального определения функции рассеяния точки (ФРТ) устройства компьютерной цитофотометрии с применением разработанных в рамках проекта специализированных дифракционных микрообъектов.

Ключевые слова: дифракция Френеля, ФРТ микроскопа, ДНК, цитофотометрия

Размещено на Allbest.ru