Глубина резко изображаемого пространства в цифровом микроскопе

В. Н. Боровицкий

Размещено на http://www.allbest.ru/

48

40

Глубина резко изображаемого пространства в цифровом микроскопе

В.Н. Боровицкий

ООО «Информационные программные системы»

ул. Боженко, 15, 03680 Киев, Украина

Предложены формулы расчета геометрической и дифракционной составляющих глубины резко изображаемого пространства для цифрового микроскопа. Проведен сравнительный анализ результатов расчета по известным и предложенным формулам. Показаны отличия в расчете составляющих глубины резко изображаемого пространства для цифровой и визуальной микроскопии.

Ключевые слова: глубина резко изображаемого пространства, цифровой микроскоп, оптическая система, приемник изображения, пространственное разрешение, критерий Релея.

Решение задачи оценки глубины резко изображаемого пространства в оптическом микроскопе является известным и хорошо изученным разделом оптики микроскопов [1-6]. Известные формулы расчета глубины резко изображаемого пространства (ГРИП) многократно проверялись экспериментально, и полученные результаты измерений подтверждали правильность этих формул [1, 7, 8]. Таким образом, пересмотр решения задачи оценки ГРИП считался нецелесообразным.

С появлением цифровых микроскопов, которые используют цифровые камеры для регистрации изображения, компьютер для цифровой обработки изображений, системы автофокусировки а также моторизованные приводы перемещения образца и тонкой фокусировки, научный интерес к задаче оценки ГРИП снова возрастает. Это подтверждается увеличением количества публикаций по данной теме, в некоторых из которых делаются попытки ревизии известных формул для оценки ГРИП [8, 9].

Перед тем, как приступить к исследованию составляющих ГРИП, необходимо подчеркнуть два важных отличия цифрового микроскопа (ЦМ) от классической схемы оптического микроскопа [1, 3, 10, 11, 14].

1. Классическая схема оптического микроскопа обеспечивает формирование увеличенного изображения предмета в бесконечности, что необходимо для нормальной работы зрительного аппарата человека-наблюдателя, который осуществляет визуальное наблюдение объектов [1-6]. В случае ЦМ оптическая система должна быть проекционной, т.е. увеличенное изображение формируется на конечном расстоянии -- плоскость изображения лежит в плоскости фоточувствительных элементов цифровой камеры (рис. 1) [10, 11, 14]. Таким образом, тип оптической системы оптического микроскопа для визуального наблюдения и ЦМ для получения цифровых изображений микрообъектов существенно различается.

В. Н. Боровицкий

Размещено на http://www.allbest.ru/

48

40

Pис. 1. Функциональная схема цифрового микроскопа

изображение цифровой микроскоп

2. Зрительная система человека имеет ряд существенных особенностей, которые отсутствуют у современных цифровых камер для микроскопии. К таким особенностям следует отнести способность оптической системы глаза изменять свою оптическую силу (аккомодацию), диаметр входного зрачка (адаптацию), переменную по полю зрения плотность фоточувствительных клеток, постоянное сканирование пространства глазами и др. [6]. Современные цифровые камеры, которые используются в ЦМ, содержат матрицу из более миллиона фоточувствительных элементов конечного размера, имеющих пространственный период 3,5-10 мкм [12, 13]. Такие цифровые камеры не обладают способностью аккомодации. Поэтому для фокусировки в ЦМ используются сложные электронные системы автофокусировки, осуществляющие анализ цифровых изображений и выработку сигналов управления для привода тонкой фокусировки ЦМ [10, 11]. Очевидно, что проектирование и эксплуатация таких систем автофокусировки ЦМ невозможны без наличия достоверной информации о ГРИП в ЦМ. Использование известных формул расчета ГРИП оптического микроскопа для визуального наблюдения микрообъектов [1, 3, 4-7] при проектировании систем автофокусировки ЦМ не представляется возможным.

Согласно положениям оптики микроскопов ГРИП содержит три составляющие [1, 4-6].

Аккомодационная составляющая ГРИП, которая обусловлена способностью человеческого глаза изменять свою оптическую силу в определенном диапазоне [2, 3, 6]. Из-за этого небольшая расфокусировка может быть скомпенсирована изменением оптической силы глаза наблюдателя. Как было отмечено выше, цифровая камера для микроскопа такой способностью не обладает и, следовательно, эта составляющая ГРИП будет отсутствовать в ЦМ.

Геометрическая составляющая ГРИП появляется из-за ограниченного пространственного разрешения приемника изображения. Если пространственные искажения изображения, обусловленные расфокусировкой, не превысят предела пространственного разрешения, то такая расфокусировка и будет определять величину геометрической составляющей ГРИП [1-3, 6]. В случае оптического микроскопа для визуального наблюдения геометрическая составляющая ГРИП будет определяться пределом пространственного разрешения человеческого глаза. Для ЦМ этот вопрос остается открытым: с одной стороны пространственное разрешение ограничивается оптической системой из-за дифракции и геометрических аберраций, с другой -- цифровой камерой, фоточувствительные элементы которой имеют конечные размеры и пространственный период [1, 3-6, 12, 13]. Таким образом, геометрическая составляющая ГРИП будет присутствовать в ЦМ, однако формулы ее расчета должны учесть, какой из факторов ограничивает пространственное разрешение ЦМ.

Дифракционная составляющая ГРИП может быть объяснена тем, что малая расфокусировка, которая вызывает искажения волнового фронта в пространстве изображений в несколько раз меньше длины волны, вносит пренебрежимо малые искажения изображения [1, 7]. Поэтому такая расфокусировка может присутствовать, в том числе и в ЦМ, внося допустимые пренебрежимо малые искажения изображения. Согласно критерию Релея, если в оптической системе максимальное отклонение волнового фронта не будее превышать четверти длины волны, такую систему можно считать дифракционно-ограниченной, то есть близкой к теоретическому пределу пространственного разрешения [7]. Диапазон перемещений микрообъекта вдоль оптической оси, при которых отклонение волнового фронта в пространстве предметов будет лежать в пределах одной четвертой длины волны, определяет дифракционную составляющую ГРИП [7]. Следовательно, дифракционная составляющая ГРИП не зависит от типа приемника изображения и определяется только параметрами оптической системы. Эта составляющая ГРИП также будет присутствовать в ЦМ.

Рассмотрим более подробно дифракционную составляющую ГРИП. В литературе приводятся четыре основные формулы для оценки дифракционной составляющей ГРИП:

(1)

; (2)

; (3)

(4)

,

где ZD1, ZD2, ZD3, ZD4 -- величины дифракционной составляющей ГРИП согласно [1], [5], [8] и [9] соответственно; NA -- числовая апертура; -- апертурный угол в пространстве предметов (рис. 2, 3); n -- показатель преломления среды между предметом и первой поверхностью оптической системы ЦМ (рис. 1); -- длина волны.

В. Н. Боровицкий

Размещено на http://www.allbest.ru/

48

40

Pис. 2. Дифракционная составляющая глубины резко изображаемого пространства

В. Н. Боровицкий

Размещено на http://www.allbest.ru/

48

40

Pис. 3. Геометрическая составляющая глубины резко изображаемого пространства

Формула (1) является наиболее распространенной [1-3, 6]. Она получена по данным о трехмерном распределении энергии в изображении точечного источника, создаваемом дифракционно-ограниченной оптической системой [1, 7]. При выводе формулы имел место эмпирический подбор, а точнее подгонка коэффициентов Вебером [1]. Формула (2) является вариантом формулы (1), домноженной на показатель преломления n [5, 9]. Формула (3) является одной из самых новых [8]. Она основана на критерии Релея. Отметим, что результаты расчетов величины дифракционной составляющей, полученные по формулам (3) и (4) близки друг к другу и подтверждаются экспериментально [8]. Формула (4) приводится в [9] со ссылкой на более ранние работы. Выполнив ряд преобразований эту формулу можно привести к более простому виду (4). Разнообразие в формулах (1)-(4) отражает отсутствие однозначности в решении данной, сравнительно несложной задачи.

Определим величину дифракционной составляющей ГРИП. Эта составляющая зависит только от параметров оптической системы микроскопа, следовательно, формула для ее определения будет справедлива для цифровой и визуальной микроскопии. Для вывода формулы дифракционной составляющей ГРИП примем допущения, которые часто используются в волновой оптике [7]:

-- диаметр входного зрачка оптической системы и расстояние от плоскости входного зрачка до плоскости предмета существенно больше величины дифракционной составляющей ГРИП (рис. 2);

-- показатель преломления среды в пространстве предметов может отличаться от единицы (рис. 2);

-- дифракционная составляющая ГРИП рассчитывается для точки на оптической оси на основе положений волновой оптики (точечный источник формирует сферический волновой фронт);

-- допустимое отклонение волнового фронта от точечных излучателей на расстоянии равном дифракционной составляющей ГРИП составляет согласно критерию Релея четверть длины волны.

Задача нахождения дифракционной составляющей ГРИП может быть сформулирована с точки зрения геометрических соотношений следующим образом: необходимо найти такую длину отрезка в окрестности осевой точки плоскости предмета l, чтобы разность оптических путей лучей, выходящих с концов этого отрезка и проходящих через край входного зрачка, была равна четверти длины волны (рис. 2). Используя критерий Релея, решение задачи может быть записано в следующем виде [7]:

,

. (5)

Полученная формула (5) для расчета величины дифракционной составляющей ГРИП существенно отличается от известных формул (1)-(4). Результаты расчетов по предложенной формуле для вычисления дифракционной составляющей ГРИП (5) в 2-12 раз меньше результатов расчета по известным формулам (1)-(4). При уменьшении числовой апертуры NA до нуля различие в результатах быстро увеличивается: результат расчета по формулам (1)-(4) стремится к бесконечности, а результат расчета по предложенной формуле стремится к величине пропорциональной четверти длины волны. Заметим, что из геометрических соотношений уменьшение апертурного угла до нуля приводит к тому, что величина cos() 1 и дифракционная составляющая ГРИП становится равной n/4 (рис. 2). Это значит, что появляется противоречие: предложенная формула, несмотря на простой и аргументированный вывод, или является неправильной, или результаты экспериментального измерения ГРИП неправильно интерпретированы.

Для того чтобы разрешить полученное противоречие рассмотрим геометрическую составляющую ГРИП. Наиболее подробный вывод формулы для расчета величины геометрической составляющей ГРИП приводится в [1, 2]. Формула для расчета геометрической составляющей ГРИП имеет следующий вид:

, (6)

где ZG -- величина геометрической составляющей ГРИП согласно [1, 2]; r, h -- радиус входного зрачка и расстояние от плоскости входного зрачка до плоскости предметов соответственно (рис. 3); d -- диаметр пятна рассеяния, спроецированного в плоскость предмета (рис. 3), который прямо пропорциональный диаметру пятна рассеяния в плоскости изображения d:

,

где -- линейное увеличение оптической системы ЦМ.

Используя выражение (6) выведем формулу для расчета геометрической составляющей ГРИП. Выводимая формула будет справедлива только для ЦМ так как она не учитывает особенности зрительной системы человека. Примем следующие допущения для получения выражения в аналитическом виде:

-- диаметр входного зрачка оптической системы и расстояние от плоскости входного зрака до плоскости предмета существенно больше диаметра пятна рассеяния и величины геометрической составляющей ГРИП -- d/h 0 (рис. 3);

-- показатель преломления среды в пространстве предметов может отличаться от единицы (рис. 2);

-- геометрическая составляющая ГРИП рассчитывается для точки на оптической оси на основе положений геометрической оптики [1, 2, 6].

Выполним ряд преобразований (6) и получим следующее выражение для расчета геометрической составляющей ГРИП (рис. 3):

(7)

.

Выполним анализ полученной формулы (7). Во-первых, при принятых допущениях полученная формула могла быть выведена из простых геометрических соотношений (рис. 3):

,

. (8)

Во-вторых, полученная формула существенно отличается от формулы для расчета величины геометрической составляющей ГРИП из учебника по микрофотографии [14]

. (9)

Данные формулы (8), (9) будут давать близкие значения только в случае малых числовых апертур, когда sin() tg(). Но для достижения максимального пространственного разрешения в микроскопии используются оптические системы с максимально возможными числовыми апертурами, и использование формулы (9) может привести к ошибкам в расчетах.

В-третьих, самый интересный вариант формулы (7) может быть получен, если в нее подставить предел разрешающей способности в плоскости изображения оптической системы ЦМ, определяемый согласно критерию Релея [1] как

(10)

,

где ZGR -- величина геометрической составляющей ГРИП, полученная при подстановке предела пространственного разрешения оптической системы d в формулу (7)

, (11)

где k -- коэффициент учета формы зрачка на предел пространственного разрешения микроскопа: для круглого входного зрачка k = 0,61; для квадратного --
k = 0,5.

Обратим внимание, что полученная формула для расчета геометрической составляющей ГРИП (10) имеет явное сходство с известными формулами (1), (2), (4) для расчета величины дифракционной составляющей ГРИП. Различие между предложенной формулой (10) и известными формулами (1), (2), как и в случае формул (7) и (9), состоит в наличии множителя (1 - (NA/n)2)0,5 .

Анализ формулы (10) позволяет сделать важное заключение о геометрической составляющей ГРИП ЦМ: появление геометрической составляющей ГРИП может рассматриваться как эффект, появляющийся вследствие ограниченного пространственного разрешения оптической системы ЦМ, обусловленного, в частности, явлением дифракции (11). Конечно, возможен случай, когда предел пространственного разрешения будет ограничиваться цифровой камерой, а не оптической системой (рис. 1). Но на практике, всегда стремятся к тому, чтобы цифровая камера не снижала пространственного разрешения ЦМ. Поэтому в современных цифровых камерах для микроскопии пространственный период фоточувствительных элементов выбирается меньшим, чем размеры пятна рассеяния оптических систем ЦМ.

Подведем итоги оценивания суммарной величины ГРИП в ЦМ. Обратим внимание, что влияния дифракционной и геометрической составляющих ГРИП проявляются одновременно и параллельно. При этом геометрическая составляющая (10) существенно превышает дифракционную составляющую (5), особенно при малых числовых апертурах NA (рис. 4). Поэтому суммарную величину ГРИП следует рассматривать в два этапа:

1) если необходимо, чтобы система автофокусировки обеспечивала прост-ранственное разрешение ЦМ, близкое к пространственному разрешению дифракционно-ограниченной системы, то величина ГРИП будет определяться формулой (5), т.е. ее дифракционной составляющей;

Рис. 4. Графики зависимостей глубины резко изображаемого пространства и предела пространственного разрешения цифрового микроскопа от величины числовой апертуры при = 0,55 мкм, k = 0,61, n = 1,0: 1, 2, 3 -- результаты расчетов по формулам (1), (3), (4) соответственно; 4, 5 -- результаты расчета дифракционной и геометрической составляющих по предложенным формулам (5) и (10) соответственно; 6 -- результат расчета предела пространственного разрешения по формуле (11).

2) если допускается снижение пространственного разрешения ЦМ на величину d (11), характеризующую пространственное разрешение дифракционно-огра-ниченной оптической системы (в этом случае суммарное пространственное разрешение ухудшится по сравнению с разрешением дифракционно-ограниченной оптической системы), то ГРИП может рассчитываться по формуле (10). В этом случае ГРИП увеличивается в зависимости от цифровой апертуры в 2-10 раз по сравнению с дифракционной составляющей, что позволяет снизить требования по точности к системе автофокусировки, сделать ее более простой и дешевой (рис. 4).

Следует подчеркнуть, что формула (10) выведена без использования эмпирических или эвристических коэффициентов. Результаты расчета по формулам (1), (3)-(5), (10) представлены на рис. 4. Результаты расчета по формуле (10) хорошо согласовываются с результатами расчетов по (1), (3), (4), которые подтверждаются экспериментальными измерениями, представленными далее в таблице. Особо следует подчеркнуть следующий факт: суммарное отличие друг от друга результатов расчетов по известным формулам (1), (3), (4) больше, чем их отличие от результатов расчета по предложенной формуле (10) (см. таблицу). А это подтверждает то, что результаты расчета по предложенной формуле (10) наиболее близки к данным, получаемым экспериментально.

Среднее значение относительного отклонения результатов расчета ГРИП ЦМ по известным формулам (1), (3), (4) и предложенной формуле (10)

Проведенные исследования позволяют сделать заключение о том, что, с одной стороны, предложенная формула (10) для оценки величины ГРИП ЦМ является достоверной и подтверждается экспериментальными измерениями. С другой стороны, предложенная формула позволяет более точно и теоретически обосновано идентифицировать две составляющие ГРИП ЦМ: меньшую дифракционную составляющую, определяемую допустимыми искажениями волнового фронта при расфокусировке и большую геометрическую составляющую, проявляющуюся вследствие ограниченного предела пространственного разрешения, в частности, из-за дифракции.

Выводы

Проведенные теоретические исследования позволяют сделать два вывода.

Выведена и проанализирована новая формула для расчета глубины резко изображаемого пространства цифрового микроскопа. Показано, что предложенная формула (10) может рассматриваться как общий случай известных формул (1), (2), (4), которые подтверждены экспериментальными исследованиями.

Выполнен анализ соотношения между дифракционной и геометрическими составляющими глубины резко изображаемого пространства (5), (10). Показано, что собственно дифракционная составляющая в ГРИП существенно меньше геометрической составляющей, обусловленной конечным пространственным раз-решением оптической системы ЦМ (рис. 4). В зависимости от величины тре-буемого пространственного разрешения ЦМ -- максимальной или сниженной на величину d (11) -- следует использовать формулы (5) и (10) соответственно.

Литература

Михель К. Основы теории микроскопа: Пер. с нем. М.В. Лейкина / Под ред. Г.Г. Слюсарева. -- М.: Машиностроение, 1955. -- 276 с.

Кругер М.Я., Панов В.А., Кулагин В.В. и др. Справочник конструктора оптико-механических приборов. -- Ленинград: Машиностроение, 1968. -- 760 с.

Скворцов Г. Е., Панов В. А., Поляков Н. И., Федин Л. А. Микроскопы / Под ред. Н. И. Полякова. -- Ленинград: Машиностроение, 1967. -- 512 с.

Панов В. А., Андреев Л. Н. Оптика микроскопов. Расчет и проектирование. -- Ленинград: Машиностроение. Ленинградское отделение, 1976. -- 432 с.

Прикладная оптика / Под ред. Н. П. Заказнова. -- М.: Машиностроение, 1988. -- 312 с.

Бегунов Б. Н., Заказнов Н. П. Теория оптических систем. -- М.: Машиностроение, 1973. -- 488 с.

Борн М., Вольф Э. Основы оптики: Пер. с англ. С. Н. Бреуса / Под ред. Г. П. Мотулевича. -- М.: Наука, 1973. -- 720 с.

Yong I.T., Zagers R. и др. Depth-of-Focus in Microscopy. // Proc. оf the 8 Scandinavian Conference on Image Analysis. -- Tromso (Norway). -- 1993. -- С. 493 - 498.

Goldsmith N.T. Deep focus: a digital image processing techniques to produce improved focal depth in light microscopy // Image Analysis and Stereology. -- 2000. -- № 19. -- С. 163 -167.

Hand W.G. A practical Guide to Digital Microscopy // Photonics Spectra. -- 2001. -- № 11. -- Р. 100-104.

Borelli A. Digital Imaging Facilitates Photomicrography // EuroPhotonic. -- 2001. -- № 4. -- Р. 46-47.

Benamati B.L. In Search of the Ultimate Image Sensor // Photonics Spectra. -- 2001. -- № 9. -- Р. 132-136.

Hand W.G. A practical Guide to Digital Microscopy // Laser Focus World. -- 2002. -- № 6. -- Р. 107-111.

14. Бергер И. и др. Практическая микрофотография: Пер. с нем. К.Ф. Плитта, М.Р. Шпольского / Под ред. А.М. Розенфельда. -- М.: Мир, 1977. -- 320 с.

Размещено на Allbest.ru