Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ УКРАИНЫ

ХАРЬКОВСКИЙ НАЦИОНАЛЬНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ РАДИОЭЛЕКТРОНИКИ

Кафедра биомедицинских электронных устройств и систем

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ К ЛАБОРАТОРНЫМ РАБОТАМ ПО КУРСУ

«Лабораторно-аналитическая техника»

для студентов всех форм обучения специальностей

«Физическая и биомедицинская электроника»

Составитель А.В. Кукоба

Харьков 2002

СОДЕРЖАНИЕ

1. ИМИТАЦИОННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ГЕМОЦИТОМЕТРІВ

2. ИЗУЧЕНИЕ ФОТОМЕТРИЧЕСКИХ ПРИБОРОВ ДЛЯ ЛАБОРАТОРНЫХ АНАЛИЗОВ

3. ИЗМЕРЕНИЕ АБСОЛЮТНЫХ ЗНАЧЕНИЙ СВЕТОВЫХ ПОТОКОВ ОПТИЧЕСКИХ ИЗЛУЧАТЕЛЕЙ

4. СОРТОВОЙ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЙ АНАЛИЗ

5. ИССЛЕДОВАНИЕ СПЕКТРОВ ФЛУОРЕСЦЕНЦИИ РАСТВОРОВ

1. ИМИТАЦИОННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ГЕМОЦИТОМЕТРІВ

Цель работы

Изучение построения и принципа работы кондуктометрического гемоцитометра. Проведение проверочных и имитационных измерений.

Суть работы и указания по самостоятельной работе

Гемоцитометр - прибор для определения форменного состава крови: концентрации эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов. Один из распространенных методов подсчета форменных элементов - кондуктометрический. Его сущность поясняет рис. 1.1.

Рисунок 1.1 -Кондуктометрический преобразователь

Проба крови, разведенная в физиологическом растворе (ФР), находится в стакане 1, в которую помещен датчик 2, что представляет собой пробирку (канюлю). В нижнюю часть канюли вставлен часовой камень 3 с мікроотвором. Внутри датчика находится электрод Е2, а снаружи - Е1. Электрод Е1 заземляется, а к Е2 подводится ток I0 от генератора стабильного тока. С помощью гидросистемы в канюли создается разрежение, и суспензия из стакана впитывается через мікроотвір в датчик. При замыкания цепи тока на электродах возникает падение напряжения. Форменные элементы крови, проходя через мікроотвір, частично перекрывают его, вызывая увеличение сопротивления цепи на несколько Ом и скачок напряжения на электродах. Эти импульсы усиливаются и поступают на устройства преобразования аналогового или цифрового типа. В аналоговых устройствах происходит преобразование частоты импульсов, пропорциональна концентрации частиц, в напряжение, а в цифровых - их прямой подсчет.

Структурная схема аналогового гемоцитометра приведена на рис. 1.2. Аппарат приводится в действие запуском пневмосистемы. В простейшем случае это рычаг, с помощью которого перемещается плунжер шприца. При этом создается разрежение в канюли и начинается всасывание пробы. Импульсы, возникающие на электродах датчика, усиливается усилителем П i поступают к дискримінатору (компаратору) Д, который формирует импульсы стандартной амплитуды. Частота этих импульсов пропорциональна концентрации частиц, преобразователем частота-напряжение преобразуется в пропорциональное напряжение, которое поступает в устройство выборки - хранения УВХ, а из него - к индикатору (стрелочный прибор). Время включения задается таймером (около 9 секунд), после чего измерения прекращается и проба выдувается из канюли.

Рисунок 1.2 - Структурная схема аналогового гемоцитометра

Датчик цифрового гемоцитометра отличается конструкцией (рис. 1.3). Он имеет три электрода. Третий (дополнительный) электрод ЭЗ служит для контроля верхнего уровня жидкости в канюле. Когда она доходит до этого датчика, подается сигнал в схему управления и происходит выключение пневмосистемы. Импульсы, возникающие при прохождении частиц, подсчитываются счетчиком дважды - при всасывании i выдувании пробы. Цифровые гемоцитометри являются более точными и надежными приборами, чем аналоговые.

В лабораторной работе исследуются градуировочные характеристики гемоцитометру ГЦМК-3, которые представляют собой зависимость показаний стрелочного индикатора от частоты импульсов. Для этого используется имитатор импульсов, создаваемых частицами. Его схема приведена на рис. 1.4.

Генератор импульсов с частотой, регулируется, управляет транзистором, который коммутирует резистор R2. Это приводит к изменению сопротивления нижнего плеча цепочки резисторов R3, R4. Его сопротивление выбрано равным сопротивлению датчика, который составляет около 20 кОм. Исходя из того, что R2>>R4, изменение сопротивления цепи будет незначительным. При этом на электроде Е1 возникают импульсы напряжения ДU = I₀ДR.

Рисунок 1.3 - Конструкция датчика цифрового гемоцитометра

Рисунок 1.4 - Схема имитатору импульсов

Величины R2 и R3 подобраны так, чтобы амплитуда этих импульсов была примерно такой же, как и при прохождении эритроцитов. Она определяется формулой:

. (1.1)

где I0 - ток генератора тока; с - удельное сопротивление физраствора (?=150Ом/см);V объем эритроцита; ЅД - площадь сечения мікроотвору датчика.

Задаваясь величиной И0=0,3 мА, диаметром мікроотвору 140мкм, диаметром и толщиной эритроциту соответственно 10 и 3 мкм, рассчитайте амплитуду импульса по формуле (1.1). По номиналам резисторов R2 - R4 в схеме рис. 1.4 рассчитайте амплитуду импульсов имитатору. Сравните между собой рассчитанные величины.

Описание лабораторной установки

Лабораторная установка состоит из приборов ГЦМК-3, «Пікоскел» (Picoscale) и мультиметру Ф4372, а также принадлежности для пробопідготування.

Порядок выполнения работы

Построение градуировочных характеристик ГЦМК-3. Включите прибор ГЦМК-3 в сеть. С помощью мультиметру померяйте ток І0. Для этого нажмите кнопку «Д» (датчик) и подключите мультиметр к красному гнезду на передней панели и к корпусу (коснуться).

Включите кнопку «Г» (генератор). Установите ручку частоты в положение «2,5 кГц», а ручку дискриминатора «Д» (порог дискриминатора) - в положение 8 - 10. Нажмите пусковой рычаг вниз до упора. При этом он фиксируется электромагнитом, а стрелка индикатора перемещается вправо. Путем небольшой регулировки частоты, повторяя пуск, добейтесь установки стрелки в диапазоне 70 - 90. Следования импульсов можно наблюдать на электронно-лучевом индикаторе.

Не меняя частоты, установите последовательно Д = 4 и Д = 2, повторяя пуск. Показания прибора, частоту и величину порога занесите в таблицу 1.1.

Таблица 1.1

f, кГц	0,4	0,6	1,1	2,5
Д=...
Д=..
Д=..

Имитационные измерения. Установите в аппарат ГЦМК-3 канюлю. Подведите под нее стакан с физраствором так, чтобы внешний электрод оказался в стакане. Нажмите кнопку «Д». Устанавливая последовательно ручкой дискриминатора величины «Д», взятые из предыдущего опыта, и, нажимая пусковой рычаг, запишите показания индикатора. Заметьте, на какую высоту поднимается жидкость в канюле.

Работа с прибором «Пкоскел» (Picoscale). Включите кнопку «RBC» (измерение концентрации эритроцитов); кнопку «x1/x10» нажать (1:1). Переставить канюлю с прибора ГЦМК-3 на «Пкоскел». Взболтать стакан с «пробой»,а затем ее установить.

Нажать на пусковой рычаг до упора. Наблюдать за ходом подсчета частиц. Записать конечный результат.

Следует иметь в виду, что коэффициент разбавления по эритроцитах для данного прибора равна 63000. При измерении эритроцитов их концентрация определяется непосредственно по показаниям индикатора. Например, если на индикаторе будет число 395, то концентрация эритроцитов равна

.

Поскольку «проба», что исследуется, не е кровью, то истина концентрация частиц в ней определяется делением на коэффициент разведения 63000. Если, например, в результате исследования «пробы» на индикаторе появилось число 072, то концентрация частиц будет равной:

.

Содержание отчета

В отчете должны быть приведены расчетные значения амплитуды импульсов напряжения для датчика (формула 1.1) i для имитатора, а также градуировочные характеристики, построенные по данным таблицы. Пользуясь этими графиками, надо определить частоту прохождения частиц, что соответствует одному из отсчетов (крупнейшем), полученном при имитационном исследованы пробы на ГЦМК-3. Подсчитайте число частиц, вовлеченных в канюлю за интервал измерения и их концентрацию. Для этого рассчитайте ориентировочный объем «пробы» в канюли, приняв ее внутренний диаметр равен 8 мм:

,

где h - высота подъема жидкости в канюле. Сравните этот результат с величиной, полученной при измерении на приборе «Пікоскел».

Контрольные вопросы и задачи

1. Назовите нормальные значения концентрации эритроцитов и лейкоцитов и их ориентировочные размеры.

2. Опишите принцип действия кондуктометрического датчика. Какими факторами обусловливается величина его сигналов?

3. Назовите основные узлы аналогового и цифрового гемоцитометрів.

4. Укажите главные причины погрешностей измерения аналоговым гемоцитометром .

5. Назовите преимущества цифрового гемоцитометра.

2. ВИВЧЕННЯ ФОТОМЕТРИЧНИХ ПРИЛАДІВ ДЛЯ ЛАБОРАТОРНИХ АНАЛІЗІВ

Цель работы

Изучение построения и принципа действия гемоглобінометра ГФЦ-04 и биохимического автомата КАМЦ-01 i исследования их градуировочных характеристик.

Суть работы и указания по самостоятельной работе

Принцип действия фотометрических приборов основан на физическом законе Ламберта-Бера - концентрация вещества в растворе пропорциональна оптической плотности

(2.1)

где е - молярная екстінкція (удельная характеристика раствора); a - толщина слоя раствора; - оптическая плотность; I0, It - интенсивности падающего излучения i того, что проходит сквозь раствор.

Приборы ГФЦ-04 i КАМЦ-01 не имеют микропроцессорных систем, и все преобразования первичных сигналов в них выполняют аппаратными средствами. Одним из важных узлов, от которого зависит точность измерения, является логарифмический преобразователь, который в обоих приборах выполнен по единому принципу логарифмического АЦП с експоненцийной опорным напряжением (рис. 2.1).



Рисунок 2.1- Схема логарифмичного преобразователя

Генератор экспоненциальной напряжения ГЕН, который запускается импульсом Uкep, вырабатывает напряжение , которое подается на входы компараторов K1 и K2. К другим их входам поступают напряжения U1 и U2, которые могут быть напряжениями фотопреобразователей и отвечать, например, інтенсивностям І0 и It. Компараторы вырабатывают сигналы разных уровней и с помощью схемы «i» формируют временное окно, в течение которого на двоично-десятичный счетчик СТ2/10 приходят тактовые импульсы TI от генератора ГТИ. Продолжительность окна Твим определяется формулой:

, (2.2)

где величина пропорциональна оптической плотности, то есть концентрации. Результат, записанный в счетчик, непосредственно выводится на индикатор.

Аппарат ГФЦ-04 является одноканальным фотометрическим прибором. Структурная схема его фотометрической части представлена на рис. 2.2.

Свет от источника излучения (светодиода) падает на кювету с раствором. Излучение, что прошло, принимается фотодиодом и преобразуется с помощью операционного усилителя (ОУ) в пропорциональное напряжение, которое поступает к логарифмического преобразователя. Как источник света используется «зеленый» светодиод. В этом спектральном диапазоне оптическая плотность раствора, анализируемого на содержание гемоглобина, имеет максимум. Светодиод питается импульсным током большой амплитуды (Іімп>>Іном) и с большим щілинністю (период повторения 1с при длительности импульса 10мс). Это необходимо для создания света большой интенсивности, что обеспечивает приемлемое отношение сигнал-шум.

Рисунок 2.2 - Структурна схема фотометричной части ГФЦ-04

При подготовке к работе прибор ГФЦ-04 обнульовують и калибруют. Для обнуления в кювету заливают трансформирующий раствор (без крови) и затем регулируют опорную напряжение. В этом случае U1 на рис. 2.1 представляет собой опорную напряжение, a U2 - рабочую, которую получают от фотопреобразователя. При U1 ? U2, добиваются Твим ? 0, а следовательно, и показаний прибора, близких к нулю. Калибровку прибора осуществляют по специальному раствора или по пробе с известной концентрацией гемоглобина.

Аппарат КАМЦ-01 представляет собой двухканальный биохимический автомат с механической и гидравлической подачами проб к кюветного отделения. Структурная схема аппарата приведена на рис. 2.3. Наиболее ответственным является фотометрический блок. В нем находятся источник света (галогенная лампа), фотоприемник (ФЭУ) i кюветное отделение. Специальная оптико-механическая система осуществляет раздел каналов. Для выбора нужной длины волны используются фильтры из цветного стекла. В кюветному отделении находятся кювета сравнения КП и рабочая кювета КР. Электромеханический блок служит для подачи проб из пробирок, расположенных на дисковой кассете, и вывода отработанных проб из измерительных кювет, а также для вращательного перемещения кассеты с пробами. Из фотометрического блока к блоку электроники поступает сигнал от фотопреобразователя (ФЭП) и специальные управляющие сигналы. Отработанные пробы с помощью компрессора отсасываются из измерительных кювет и направляются в ресивер.

Рисунок 2.3 - Структурная схема апарата КАМЦ-01

На рис. 2.4 приведена структурная схема фотометрического блока аппарата КАМЦ-01. Свет от источника ДС через оптическую систему УС1 i диафрагму Д попадает на модулятор М, который представляет собой диск с отверстиями, который вращается. Отверстия расположены так, что световые лучи через них поочередно проходят через кюветы КП и КР и с помощью оптической системы ОС2 поочередно направляются на фотокатод ФЭУ. Для выбора длины волны служат фильтры Ф.

Рисунок 2.4 - схема фотометричного блока апарата КАМЦ-01

В результате на выходе ф_отоперетворювача возникают поочередно импульсы напряжения, соответствующие КП и КР (рис. 2.5). С помощью специальных фотодатчиков эти импульсы распределяются по двум электрическим каналам и через аналоговые запоминающие ячейки (ПВЗ) поступают логарифмического преобразователя. Роль U1 на рис. 2.5 при этом играют импульсы КП, a U2 - импульсы КР.

Рисунок 2.5 - Диаграмма роботи фотопреобразователя КАМЦ-01

Описание лабораторной установки

Лабораторная установка состоит из аппарата ГФЦ-04 i комплекса КАМЦ-01. Измерения и исследования проводятся с помощью мультиметру Ф4372. Для имитации проб используются специальные реактивы и фильтры.

Порядок выполнения работы

Снятие градуировочной характеристики гемоглобінометра ГФЦ-04. Включите аппарат в сеть. Откройте крышку кюветного отделения. Убедитесь, что светодиод функционирует. Залейте в кювету буферный раствор (воду) на 2/3 высоты. Установите кювету на место и проведите обнуление ГФЦ-04. Для этого, нажимая и отпуская кнопку «Пуск», вращайте ручку «Ноль» и следите за изменением показаний - они должны уменьшаться. Цикл действия сигнала «Пуск» длится около 5с. Затем кнопку «Пуск», нужно снова нажать и отпустить. Обнуление заканчивается, когда на индикаторе будет показания 001 - 003 i замелькает красный светодиод. Как уже отмечалось, нулевому уровню соответствует достаточно большое напряжение U2 (рис. 2.1), a U1 - опорное напряжение, изменяется ручкой «Ноль». Это напряжение может оказаться меньше U2, тогда прибор «зашкаливает» - на индикаторе будет большое число. Ручку «Ноль» при этом следует поворачивать вправо.

Далее выполняют калибровку прибора. Для этого в мензурку наливают 10 мл воды и добавляют краситель (2 пипетки) так, чтобы получить достаточную интенсивность окраски (субъективно). Содержимым пробирки заполняют кювету (на 2/3 высоты). Нажимая кнопку «Пуск» и вращая ручку «Калибровка», устанавливают на индикаторе число «150». Это соответствует содержанию гемоглобина 150г/л. Начальную концентрацию красителя в растворе принимают за 100%. Далее раствор, находящийся в кювете, выливают обратно в мензурку, отливают из нее 2 мл в другую пробирку (для отходов) и приливают в первую пробирку 2мл чистой воды (до начального уровня в 10мл). Таким образом, получают концентрацию 80% от исходной. Новый раствор заливают в кювету, выполняют замеры и заносят показания в табл. 2.1.

Таблица 2.1 - Градуюрувальна характеристика ГФЦ-04

Концентрація, %	100	80	64	51,2	41	32,8	26,2	21
Показання

Продолжая таким образом уменьшать концентрацию и записывая показания в таблицу, получают еще 2-3 точки. По ним строят градуировочную характеристику. В идеальном случае это должна быть прямая, проходящая через начало координат.

11.4.2 Работа с комплексом КАМЦ-01. Включите КАМЦ-01 и мультиметр. Из кюветного отделения удалите заслонку с фильтром (если она там есть). Нажмите кнопку «:10» i кнопку «?/_» (внутренний пуск ЛП). Все кнопки в блоке « t » и кнопка «>_<» нажаты. Вращая ручку светофильтров фотометрического блока, подберите такой фильтр, чтобы на экране осциллографу импульсные сигналы левого и правого каналов были достаточно большими и примерно равными. Осциллограф подключен к выходу ФЭП через тройник. Вращая ручку «>_<» (слева), добиться показаний цифрового индикатора, близких к нулю (10-15). Померяйте напряжение аналоговых выходов «левого» и «правого» каналов. Измерения осуществляют в гнездах колодки (рис. 2.6). Убедитесь, что эти напряжения практически равны.

Установите в кюветное отделение заслонку с фильтром «0,6». Фильтр надо разместить в правом канале. Вращая ручку « ЎЎ », установите на индикаторе число 800 - 1200. Померяйте величины аналоговых сигналов обоих каналов.

Рисунок 2.6 - Расположение измерительных гнезд КАМЦ-01

Установите в кюветное отделение фильтр «0,1», а потом «0,9». Цифровые отсчеты аналоговых сигналов занесите в табл. 2.2. Отожмите кнопку «?/_». Мигание индикатора прекратится. Нажмите кнопку « _ ». При этом начнется шаговое вращение диска с пробами (автоматический режим). Изменение показаний происходит в конце каждого шага.

Таблица 2.2 - Тестирование КАМЦ-01

Фільтр	Цифровий відлік	Uлів.	Uправ.
0,1
0,6
0,9

Содержание отчета

В отчете приводятся структурные схемы фотометрических блоков ГФЦ-04 i КАМЦ-01, график градуировочной характеристики ГФЦ-04 i выводы по ней. По результатам исследования КАМЦ-01 провести проверку правильности работы его логарифмического преобразователя. Для этого надо вычислить логарифмы отношения Uлів./Uправ. (большего напряжения к меньшему) и построить зависимость «логарифм отношения - цифровые отсчеты». В идеальном случае она должна быть прямой, проходящей через начало координат.

Контрольные вопросы и задачи

1. На каком физическом законе основана работа фотометрических приборов?

2. На основании каких данных и как выбирается длина волны излучения для фотометрических измерений концентрации растворов?

3. Опишите принцип работы логарифмического преобразователя в приборах ГФЦ-04 i КАМЦ-01.

4. В чем заключается разница между одноканальными и двухканальными фотометра? Назовите преимущества двухканальных приборов.

5. В чем недостаток применения фильтров в виде цветных стеклышек? Назовите другие способы получения монохроматического излучения.

6. Опишите, как организуется подача проб в аппарате КАМЦ-01.

3. ИЗМЕРЕНИЕ АБСОЛЮТНЫХ ЗНАЧЕНИЙ СВЕТОВЫХ ПОТОКОВ ОПТИЧЕСКИХ ИЗЛУЧАТЕЛЕЙ

Цель работы

Изучение методики и аппаратуры измерения абсолютных значений мощности оптических излучателей методом сравнения с эталонным излучателем; отработка методики пересчета абсолютных значений светового потока из квантовых единиц измерения в энергетические и светотехнические.

Сущность работы и рекомендации по самостоятельной работе

В качестве эталонного излучателя в работе использован образец светодиода АЛ310А, имеющий при прямом токе в 10,0 мА и температуре 25^оС световой поток в спектральном диапазоне 650 - 675нм (для упрощения вычислений считать все излучение сосредоточенным на длине волны л_max=660нм).

Для измерения каждая бригада получает образец светодиода с красным (), зеленым () или синим () излучением. Измерение абсолютного значения светового потока производится методом сравнения с эталонным источником (эталонный светодиод АЛ310А). Для устранения влияния диаграммы направленности излучателей измерения интенсивности излучения эталонного и измеряемого образца производятся с использованием «интегрирующей сферы». Структурная схема измерительной установки приведена на рис. 3.1.

Рис. 3.1 - Структурная схема измерительной установки

Порядок выполнения работы

Внимание! Включение высоковольтного напряжения питания ФЭУ допускается только при полностью закрытой измерительной камере. Попадание внешнего света на включенный ФЭУ недопустимо! Перед включением тумблера «Высокое напряжение» обязательно убедитесь, что измерительная камера полностью закрыта, а перед ее открыванием - обязательно выключите тумблер «Высокое напряжение»!

Включить сетевой тумблер высоковольтного источника питания (при этом тумблер включения высокого напряжения обязательно должен быть в выключенном положении). Включить питание ПТН и цифрового вольтметра, Цифровой вольтметр переключить в режим измерения постоянного напряжения с максимальным значением в 10 В. Установить диапазон ПТН с максимальным током 100 мкА.

Установить эталонный светодиод в измерительную камеру интегрирующей сферы и подключить его к разъемам питания (гнездо гибкого вывода светодиода подключается к штырю на корпусе камеры, а штырь - к гнезду на центральном выводе коаксиального разъема).

Не включая блок питания светодиода и убедившись, что измерительная камера полностью закрыта - включить тумблер «Высокое напряжение». Выждав 2 - 3 мин измерить значение напряжения, соответствующее темновому режиму работы ФЭУ. В последующих измерениях интенсивности излучения это значение необходимо вычитать из показаний вольтметра.

Включить блок питания светодиода и установить ток в 10,0 мА. Зафиксировать показания вольтметра с учетом темнового значения.

Выключить тумблер «Высокое напряжение». Вместо эталонного установить выданный бригаде рабочий образец светодиода. Установить ток в 10,0 мА. Убедившись, что измерительная камера полностью закрыта включить тумблер «Высокое напряжение». Зафиксировать показания вольтметра с учетом темнового значения. Аналогичные измерения произвести для значений токов светодиода в 8, 4 , 2, 1 и 0,5 мА.

Выключить блок питания светодиода и тумблер «Высокое напряжение». Вынуть образец светодиода из рабочей камеры. Закрыть рабочую камеру.

Передать измерительную установку следующей бригаде.

Сравнивая зафиксированные при токе в 10,0 мА показания вольтметра для эталонного и рабочего светодиодов, и пользуясь приведенным выше значением абсолютного светового потока определить абсолютный световой поток рабочего светодиода. Перевести абсолютное значение светового потока в энергетические и светотехнические единицы, считая все излучение светодиода сосредоточенным на . Значение констант: , при , при , при .

Учитывая, что заряд электрона равен , определить при токе в 10 мА квантовую эффективность рабочего светодиода, т.е. количество фотонов, приходящихся на один электрон.

Определить абсолютное значение светового потока рабочего светодиода в фотонах/с при остальных значениях тока.

Построить зависимость абсолютного значения светового потока рабочего светодиода от тока через светодиод.

Контрольные вопросы

1. Что такое диаграмма направленности излучателя и как её экспериментально измерить.

2. Для чего необходима интегрирующая сфера

3. Какие требования предъявляются к внутреннему покрытию интегрирующей сферы.

4. Как должны соотносится размеры интегрирующей сферы и излучателя.

5. Какие требования предъявляются к размещению излучателя и фотоприемника в интегрирующей сфере.

6. Какие требования предъявляются к спектральной характеристике фотоприемника при его работе в составе интегрирующей сферы.

7. Какие существуют системы измерения световых потоков

8. Какую из существующих систем измерения целесообразно использовать в конкретных обстоятельствах.

9. Как перевести оптические характеристики излучателей или фотоприемников из одной системы измерения в другую.

10. Какой из идеальных источников электрической энергии необходимо использовать для питания светоизлучающего диода и почему.

11. Приведите типовую схему подключения светодиода к источнику напряжения и определите значения элементов схемы.

4. СОРТОВОЙ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЙ АНАЛИЗ

Цель работы

Изучение аппаратуры и освоение методики сортового флуоресцентного анализа.

Сущность работы и рекомендации по самостоятельной работе

Сортовой (качественный) флуоресцентный анализ является наиболее простым в аппаратурном и методическом плане вариантом высокочувствительного лабораторного анализа. Типовой предел обнаружения наличия естественных и искусственных люминесцирующих молекул в растворах этим методом составляет около 10^-8 М. Для обнаружения люминесцирующих молекул требуется очень малое количество аналита, измеряемое долями микрограмма. Благодаря простоте реализации и высокой чувствительности сортовой флуоресцентный анализ нашел широкое применение в различных областях науки и техники, в том числе в биологии и медицине, где он применяется для обнаружения как люминесценции природных объектов (например при диагностике грибковых заболеваний кожи), так и искусственно созданных люминесцентных маркеров (люминесцентная микроскопия биообъектов, реакция иммунофлуоресценции в серологических исследованиях и т.п.).

В основу сортового флуоресцентного анализа положено следующее физическое явление. При поглощении квантов возбуждающего излучения сложными молекулами последние переходят в так называемое электрон-возбужденное состояние, в котором находятся около 10⁸с. Обратный переход в основное состояние у молекул с высоким квантовым выходом люминесценции сопровождается испусканием кванта с энергией несколько меньшей энергии кванта возбуждения. Подобное явление называется фотолюминесценцией или флуоресценцией, а участвующие в таком процессе сложные молекулы называются люминофорами. Последние могут быть естественного происхождения - люминесцируют некоторые аминокислоты, слабой флуоресценцией обладает кожный покров человека и его ногти. Большинство известных люминофоров синтезированы учеными. Они часто используются как высокоэффективные флуоресцентные маркеры, которыми помечают различные объекты. При осуществлении сортового флуоресцентного анализа дифференциация объектов анализа осуществляется по факту наличия или отсутствия флуоресценции без измерения её количественных характеристик. Иногда во внимание принимают и цвет флуоресценции, но спектральные характеристики при этом не регистрируют.

Структурная схема лабораторной установки для сортового флуоресцентного анализа приведена на рис. 4.1.

Рис.4.1 - Структурная схема лабораторной установки

Установка состоит из дуговой лампы, которая является источником возбуждающего излучения. Запуск и питание дуговой лампы осуществляет электронный пускорегулирующий аппарат (ЭПРА). Для увеличения рабочего ресурса дуговой лампы в работе используется самая совершенная схема ЭПРА с предварительным подогревом электродов дуговой лампы. Флюоресценция объекта регистрируется оператором визуально. Для исключения прямого попадания вредного ультрафиолетового излучения в глаза оператора дуговая лампа сверху закрыта экраном. В работе используются три разных типа ртутных дуговых ламп низкого давления - люминесцентная, бактерицидная и ультрафиолетовая. Люминесцентная дуговая лампа имеет стеклянный корпус, покрытый изнутри люминофором. Поэтому ее излучение сосредоточено только в видимом диапазоне длин волн. Корпус бактерицидной лампы выполнен из оптического кварца и не имеет люминесцирующего покрытия. Спектр излучения этой лампы содержит как ультрафиолетовые, так и видимые линии ртути. Корпус ультрафиолетовой дуговой лампы выполнен из материала, который пропускает только ультрафиолетовое излучение.

В качестве анализируемых объектов в работе используются круглые листы фильтровальной бумаги из очищенной целюлозы на некоторые из которых флуоресцентными маркерами нанесены различные надписи. Обычная бумага не может быть использована, так как в ее состав введены так называемые «оптические отбеливатели» - органические люминофоры с сине-голубой люминесценцией. В работе использованы три варианта флуоресцентных маркеров, состоящих из следующих органических люминофоров: дифенилантрацена (синий), дифенилстирилпиразолина (зеленый), рубрена (оранжевый).

Порядок выполнения работы

1. Каждой бригаде получить у преподавателя набор анализируемых объектов, который состоит из нескольких круглых листов фильтровальной бумаги, некоторые из которых с одной из сторон содержат нанесенные люминесцентными маркерами надписи.

2. Включить ЭПРА с люминесцентной лампой и попытаться с её помощью найти объекты с флуоресцирующими надписями.

3. Включить ЭПРА с бактерицидной лампой и попытаться с её помощью найти объекты с флуоресцирующими надписями.

4. Включить ЭПРА с ультрафиолетовой лампой и с её помощью найти все объекты, помеченные флуоресцентными маркерами.

5. Записать какие флуоресцентные надписи нанесены на объёкты.

6. Визуально, пользуясь качественными критериями, оценить люминесцентные характеристики обнаруженых маркеров.

7. Определить каким из использованых в работе люминофоров нанесена каждая из надписей.

8. Произвести сортовой люминесцентный анализ различных объектов - жетонов метрополитена, защитных люминесцентных маркеров денежных купюр и т.д.

9. Провести наблюдение естественной флуоресценции кожных покровов кистей рук и ногтей.

10. В выводах произвести аргументированную сравнительную оценку хода сортового флуоресцентного анализа при использовании люминесцентной, дуговой и ультрафиолетовой ламп.

Контрольные вопросы

1. Что такое сортовой флуоресцентный анализ.

2. Какие объекты позволяет выявить сортовой флуоресцентный анализ.

3. В чем заключаются основные достоинства флуоресцентного анализа.

4. По каким признакам идентифицируются объекты при сортовом флуоресцентном анализе.

5. Почему сортовой флуоресцентный анализ позволяет выявить больше объектов при использовании УФ-лампы.

6. Каковы требования к источнику возбуждения, используемому в установке сортового флуоресцентного анализа.

7. В чем недостаток бактерицидной лампы как источника возбуждения в сортовом флуоресцентном анализе.

8. В чем особенность проведения сортового флуоресцентного анализа при использовании объективного фотоприемника.

9. Какие ограничения накладывает использование для возбуждения источника видимого излучения при сортовом флуоресцентном анализе.

10. Приведите примеры использования флуоресцентного анализа в биологии, медицине, других областях техники.

5. ИССЛЕДОВАНИЕ СПЕКТРОВ ФЛУОРЕСЦЕНЦИИ РАСТВОРОВ

Цель работы:

Знакомство с конструкцией спектрофлуориметра, освоение методики регистрации спектров флуоресценции растворов.

Сущность работы и рекомендации по самостоятельной работе Люминесцентные методы давно и широко используются в биологии и медицине. К этим методам в первую очередь следует отнести собственно люминесцентный химический анализ, люминесцентные зонды, различные люминесцентные маркеры. Во всех этих методах чаще всего для возбуждения люминесценции используют ультрафиолетовое или видимое излучение. Такой вид люминесценции получил название фотолюминесценции или флуоресценции. Применение этой разновидности люминесценции обусловлено простотой процесса оптического возбуждения и хорошей его управляемостью. Наряду с флуоресценцией в последние годы все более широкое применение в рассматриваемых методах находит и хемилюминесценция. Вне зависимости от метода возбуждения люминесценции единственным способом идентификации ее эмиттера (частицы, испускающей кванты) являются спектральные исследования. Как известно, спектр люминесценции не зависит от способа возбуждения. Он всецело определяется только природой эмиттера и физико-химическими условиями, в которых он находится. Регистрация спектров люминесценции возможна двумя способами. Первый из них - это применение флуориметра со светофильтрами. Второй способ заключается в использовании флуориметра, снабженного монохроматором - спектрофлуориметра. Первый способ отличается простотой и низкой стоимостью. Большим его достоинством является весьма малые потери регистрируемого излучения в фильтрах и возможность регистрации люминесценции в широком телесном угле. Это позволяет регистрировать спектры систем с очень низкой интенсивностью люминесценции. Однако качество получаемых этим методом спектров очень низкое, что связано с разнородностью оптических характеристик используемых светофильтров и их относительно широкой полосой пропускания. Значительно повысить качество регистрируемых спектров люминесценции позволяет использование спектрофлуориметров. Спектрофлуориметры являются сложными и дорогостоящими приборами, которые, как правило, комплектуются компьютерами для обработки, индикации и хранения спектров. Несмотря на техническую сложность и высокую цену cпектрофлуориметры имеют значительно меньшую спектральную чувствительность, чем простые флуориметры с фильтрами.

Структурная схема лабораторного спектрофлуориметра приведена на рис. 5.1.



Рис. 5.1. Структурная схема лабораторного спектрофлуориметра

Канал возбуждения спектрофлуориметра состоит из осветителя ОИ-18 с дуговой ртутной лампой сверхвысокого давления ДРШ-250. Осветитель обеспечивает защиту персонала от ультрафиолетового излучения лампы, озона и окислов азота, осколков при возможном взрыве лампы. Пробой и питание дуговой лампы обеспечивает пускорегулирующий аппарат (ПРА). Для уменьшения влияния нестабильности сетевого напряжения на световой поток лампы питание ПРА осуществляется от электронного стабилизатора переменного сетевого напряжения Б2-3. Световой поток от дуговой лампы через коллиматор (короткофокусную кварцевую линзу, размещенную в корпусе осветителя ОИ-18) попадает на входную щель монохроматора ДМР-4 (двухпризменный зеркальный монохроматор ультрафиолетового и видимого диапазонов), который настраивается на одну из видимых или ультрафиолетовых линий ртути. С выходной щели монохроматора ДМР-4 возбуждающее излучение через фокусирующую кварцевую цилиндрическую линзу попадает на зеркало, которое направляет его на объект исследования. Интенсивность возбуждающего потока регулируется изменением ширины щелей ДМР-4. Возбуждающее излучение на объекте имеет форму выходной щели монохроматора (прямоугольник высотой около 20 мм и шириной 1,5мм). Точная юстировка размеров и положения возбуждающего потока в вертикальной плоскости достигается перемещением цилиндрической линзы и зеркала, закрепленных на магнитной подвеске. Возбуждающее излучение попадает на объект со стороны регистрации флуоресценции под углом около 45⁰. Регистрация флуоресценции осуществляется в направлении перпендикулярном плоскости объекта для исключения попадания отраженного поверхностью объекта возбуждающего излучения в канал регистрации флуоресценции. Такой способ возбуждения обеспечивает минимально возможное влияние эффекта реабсорбции на форму регистрируемого спектра флуоресценции. В лабораторной работе в качестве объекта исследования используется раствор органического люминофора, помещенный в стандартную кварцевую кювету с внутренними размерами 10х10х40мм.

Регистрирующая часть спектрофлуориметра выполнена на основе спектрометра ИСП-51 с фотоэлектрической приставкой ФЭП-1. Объект исследований закрепляется на оптической скамье, расположенной в измерительной камере, обеспечивающей защиту от посторонней засветки. Флуоресценция объекта через коллиматор направляется на входную щель трехпризменного стеклянного монохроматора ИСП-51. Перестройка монохроматора осуществляется синхронным реверсивным электродвигателем, который через редуктор и кардан вращает отсчётный барабан ИСП-51. С выходной щели монохроматора ИСП-51 излучение попадает на фотокатод фотоэлектронного умножителя типа ФЭУ-17, который преобразует его в фототок. Высоковольтное питание ФЭУ осуществляется от стабилизатора ПВ2-2. Фототок ФЭУ через преобразователь «ток - напряжение» (ПТН) поступает на канал Y двухкоординатного графопостроителя Н-306, который обеспечивает запись спектральной зависимости. Основные характеристики лабораторного спектрофлуориметра приведены в таблице 5.1.

Таблица 5.1

Длина волны возбуждающего излучения	Видимые и УФ линии ртути
Рабочий диапазон длин волн регистрирующей части	390 - 660 нм
Линейная дисперсия при =471,3 нм	3,2 нм/мм
Время развертки рабочего диапазона длин волн	1,5 мин

Полученные на спектрофлуориметре спектры флуоресценции будут отличаться от действительных спектров флуоресценции по ряду причин: неточность шкалы длин волн, спектральная зависимость пропускания коллиматора и монохроматора канала регистрации люминесценции, различная чувствительность ФЭУ к излучению разных длин волн. Введение соответствующих поправок называется обработкой и коррекцией спектра.

Уточнение шкалы длин волн с точностью до 1нм (или ее калибровка, если она дана не в единицах длин волн) является достаточно простой процедурой. Достаточно осветить входную щель монохроматора ртутной лампой, в излучении которой имеются четко различимые линии с известными длинами волн. Этой процедуре посвящена соответствующая лабораторная работа данного цикла, где подробно освещены ее детали. Соответствующая калибровочная зависимость приведена на рис. 5.2.



Рис. 5.2 - Калибровочная зависимость для ИСП-51.

Калибровочная кривая, приведенная на рис. 5.2, может быть достаточно точно аппроксимирована полиномиальным рядом

где л - это длина волны в нанометрах, а x - это деления отсчетного барабана. Пользуясь этой функцией можно по делениям отсчетного барабана ИСП-51 вычислить соответствующую им длину волны.

Менее тривиальна задача введения поправки на неравномерность спектрального пропускания оптических элементов и спектральную чувствительность ФЭУ. Для определения значений поправочного коэффициента S(л) необходимо зарегистрировать на спектрофлуориметре спектральную характеристику источника излучения, спектр которого тщательно измерен и приведен в литературе или может быть рассчитан. Процедуре определения S(л) посвящена соответствующая лабораторная работа данного цикла. Некоторые значения полученных в процессе калибровки лабораторного спектрофлуориметра поправочных коэффициентов приведены в таблице 5.2. Полный набор поправочных коэффициентов содержится в файле Spectrum.xls.

Таблица 5.2

Деления барабана	4	5	6	7	8	9	10
Длина волны л, нм	402,2	408,5	415	422,2	429,5	437,2	445,9
S(л)	3,12	2,64	2,21	1,77	1,62	1,39	1,16
Деления барабана	11	12	13	14	15	16	17
Длина волны л, нм	455,1	465,1	476,5	488,4	501,2	516	532
S(л)	1,07	1,01	1,00	1,01	1,16	1,52	2,29

гемоцитометр флуоресцентный оптический излучатель

Порядок выполнения работы

Внимание! Включение высоковольтного напряжения питания ФЭУ допускается только при полностью закрытой измерительной камере. Попадание внешнего света на включенный ФЭУ недопустимо! Перед включением тумблера «Высокое напряжение» обязательно убедитесь, что измерительная камера полностью закрыта, а перед ее открыванием - обязательно выключите тумблер «Высокое напряжение»!

1. Включите сетевой тумблер высоковольтного источника питания (при этом тумблер включения высокого напряжения обязательно должен быть в выключенном положении). Включите сетевое питание ПТН, графопостроителя Н-306, электродвигателя ФЭП-1. Установите диапазон ПТН с максимальным током 10 мкА.

2. Включите сетевые тумблеры стабилизатора Б2-3 и пускорегулирующего устройства лампы. Резким кратковременным нажатием на кнопку «Пуск» подожгите лампу. Для выхода на номинальный режим лампе необходимо около пяти минут.

3. С помощью преподавателя или учебного мастера залейте в измерительную кювету необходимое количество исследуемого раствора (около 2/3 объема кюветы). При повторном использовании произведите двукратную промывку кюветы чистым растворителем и просушите наружные поверхности фильтровальной бумагой

4. Осторожно снимите крышку измерительной камеры и установить кювету с раствором на оптическую скамью. Запишите сведения о составе исследуемого раствора.

5. Настройте барабан монохроматора ДМР-4 на указанную преподавателем линию ртути. Для настройки используйте калибровочную таблицу, полученную при выполнении лабораторной работы №2. Точность настройки проконтролируйте визуально по максимальной интенсивности флуоресценции исследуемого раствора. Запишите соответствующее значение делений барабана, длину волны возбуждающего излучения и цвет наблюдаемой флуоресценции раствора.

6. Осторожно закройте крышку измерительной камеры. Убедившись, что измерительная камера полностью закрыта, включите тумблер «Высокое напряжение».

7. Уложите на рабочий стол графопостроителя лист белой бумаги формата А4, располагая его симметрично относительно уголковых ориентиров. Включите кнопку электростатического закрепления бумаги. Установите на графопостроителе по указанию преподавателя требуемую скорость перемещения пера по оси X.

8. Убедитесь, что кнопки включения осей X и Y находятся в отключенном состоянии. Установите перо графопостроителя в начало координат (около 1 см отклонения по осям X и Y от нулевого значения). Включите кнопку “Перо” и, попеременно вращая потенциометры установки начального положения пера, прочертите вертикальную и горизонтальную оси, после чего отключите кнопку “Перо”.

9. Отсоедините механическое зацепление шестерни электродвигателя с отсчетным барабаном ИСП-51 и вручную установите отсчетный барабан на деление, приблизительно соответствующее визуально наблюдаемому цвету флуоресценции исследуемого раствора (при выполнении этой процедуры используйте данные таблицы 5.2).

10. Включите кнопку подключения сигнала к оси Y. Используя кнопки выбора чувствительности по оси Y, установите отклонение пера около половины шкалы. Вращая вручную отсчетный барабан в разные стороны, найдите положение, соответствующее максимуму спектра (максимальное отклонение пера), переключая при необходимости тумблер чувствительности на меньшее значение.

11. Медленно поворачивая отсчетный барабан ДМР-4 от установленного значения на небольшой угол, настройте возбуждающий поток на максимум, ориентируясь на достижение максимального отклонения пера (при необходимости переключите чувствительность по оси Y на меньшее значение).

12. С помощью потенциометра плавной регулировки высокого напряжения питания ФЭУ добейтесь отклонения пера на 2/3 максимального значения. Вытяните рукоятку переключателя зеркала ФЭП-1 на себя до упора (при этом световой поток флуоресценции будет отключен от ФЭУ и перо графопостроителя опустится к нулевой отметке). Установите перо точно в точку пересечения осей, пользуясь потенциометрами установки положения пера по координатным осям. Установите рукоятку переключателя зеркала в прежнее положение (нажать до упора). Вращая вручную отсчетный барабан ИСП-51 в направлении от максимума спектра, определите начальное и конечное значение делений барабана (желательно целочисленное), при которых перо приближается к нулевой отметке. Запишите найденные значения.

13. Установите на отсчетном барабане ИСП-51 начальное значение и, не включая электродвигателя, произведите механическое подсоединение его шестерни к отсчетному барабану. Включите кнопку «Перо» графопостроителя. Включите одновременно тумблер электродвигателя и кнопку «Пуск» оси X графопостроителя. Убедитесь, что отсчетный барабан вращается в нужную сторону, в противном случае, переключив тумблер реверса электродвигателя, заново повторите данный пункт.

14. Когда отсчетный барабан достигнет конечного целочисленного значения, отключите кнопку «Перо» и выключите электродвигатель. Выключите тумблер «Высокое напряжение». Когда закончится процесс горизонтальной развертки и перо вернётся в начало координат, отключите кнопку электростатического закрепления бумаги и снимите её с графопостроителя. Нанесите на полученную спектральную зависимость начальные и конечные значения отсчетного барабана, длину волны возбуждения, сведения о составе исследуемого раствора, дату.

Обработка результатов

Обработку результатов и построение спектра рекомендуется выполнять в программе Microsoft Excel с использованием файла Spectrum.xls. Модифицированный вами файл Spectrum.xls рекомендуется сохранить на Вашей дискете для облегчения оформления отчета по данной лабораторной работе.

Ручная обработка результатов

Используя данные о начальном и конечном значении делений отсчетного барабана, нанесите на горизонтальную ось промежуточные целочисленные значения делений барабана.

Используя данные табл. 5.2 и Spectrum.xls определите значения координаты в миллиметрах через каждые 0,5 деления барабана, затем деления барабана переведите в длину волны в нм.

Каждое полученное значение Y() умножьте на соответствующий ему поправочный коэффициент S() и в полученном ряду значений найдите максимальное.

Все полученные значения Y()*S() разделите на максимальное значение.

Постройте график относительной спектральной плотности флуоресценции исследуемого соединения. По вертикальной оси нанесите надпись «Относительная спектральная плотность флуоресценции в квантовой шкале». По горизонтальной оси нанесите надпись «Длина волны, нм». Под рисунком нанесите надпись «Скорректированный спектр флуоресценции название вещества в название растворителя». На графике укажите концентрацию исследуемого вещества и длину волны возбуждения.

Компьютерная обработка результатов

1. Загрузите в программу Microsoft Excel исходный файл Spectrum.xls. Вид электронной таблицы приведен на рис. 5.3. В исходном файле приведен пример обработки спектра. Не изменяйте его содержимого до полного ознакомления с методикой обработки!

Деление барабана	2,0	2,1	2,2	2,3	2,4	2,5
Длина волны, нм	390,6	391,2	391,8	392,4	393,0	393,5
Поправочный коэффициент S(л)	4,50	4,40	4,31	4,22	4,13	4,05
Yисходный, мм
Yисправленный=S(л)*Y	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
Yнормированный	0,000	0,000	0,000	0,000	0,000	0,000
X - графика	395	395	395	396	396	397
Y- Графика	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00

Рис. 5.3 - Вид части электронной таблицы Spectrum.xls

2. Сохраните Spectrum.xls под новым именем, например Spectrum23.xls.

3. Очистите (удалите данные) из строки «Y_{исходный}, мм».

4. Начиная с начального значения с дискретностью 0,1- 0,5 делений барабана занесите в соответствующие столбцы строки «Y_{исходный}, мм» значения Y - координаты экспериментального графика в мм (чем шире обрабатываемый спектр, тем реже можно брать точки). Ячейки строки «Y_{исходный}, мм» в которые не вносятся данные должны оставаться пустыми!

5. При правильном выполнении предыдущего пункта в окне диаграммы вы увидите исправленный спектр исследованного раствора.

6. Сохраните модифицированный вами файл Spectrum23.xls на вашей дискете для облегчения составления итогового отчета.

7. Распечатайте диаграмму из файла Spectrum23.xls и под рисунком нанесите надпись «Скорректированный спектр флуоресценции название вещества в название растворителя». На графике укажите концентрацию исследуемого вещества и длину волны возбуждения.

Контрольные вопросы

1. Что такое химический флуоресцентный анализ.

2. По какой характеристике определяют, что за вещество содержится в растворе.

3. Что такое спектр флуоресценции.

4. Что такое спектр возбуждения.

5. В чем заключается процедура исправления спектра и почему она необходима.

6. Что такое реабсорбция и как уменьшить ее влияние на форму спектра флуоресценции.

Размещено на Allbest.ru

...