Фотоинактивация микроорганизмов при релаксации высоких электронно-возбужденных состояний молекул фотосенсибилизаторов

Размещено на http://www.allbest.ru/

Оренбургский государственный университет

ФОТОИНАКТИВАЦИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ ПРИ РЕЛАКСАЦИИ ВЫСОКИХ ЭЛЕКТРОННО-ВОЗБУЖДЕННЫХ СОСТОЯНИЙ МОЛЕКУЛ ФОТОСЕНСИБИЛИЗАТОРОВ

Летута С.Н., д.ф.-м.н., проф., С.Н. Пашкевич, к.ф.-м.н., доц.,

У.Г. Летута, к.ф.-м.н., доц., А.Т. Ишемгулов, Д.В. Дорофеев,

Д.Е. Цюрко, А.В. Дорошкевич

Рассматривается механизм фототермической инактивации бактерий, основанный на формировании ударных волн в локально разогретых областях среды. Локальный разогрев возникает в результате тепловыделения при релаксации высоких электронных возбужденных состояний фотосенсибилизаторов (ФС), или группы рядом расположенных ФС. Выделившегося тепла достаточно для испарения воды и образования пузырьков, возникновение и схлопывание которых порождает ударные волны. Распространяясь в среде, ударные волны механически повреждают мембраны клеток. волна фототермический инактивация бактерия

Количество штаммов, устойчивых к действию традиционных антимикробных препаратов, непрерывно увеличивается (см. обзор [1] и приведенные там ссылки). Поэтому требуются новые безопасные противомикробные стратегии, действующие быстро и эффективно, и к которым микробные агенты не смогут легко вырабатывать резистентность.

Разрабатываются различные способы воздействия на бактерии и грибы. Известны применения пробиотиков, различных ферментов и бактериофагов для борьбы с патогенными микроорганизмами. Для предотвращения формирования биопленок (БП) на твердых поверхностях снижают адгезию бактерий к поверхности путем ее химической модификации или наносят частицы, обладающие бактерицидными свойствами. Предпринимаются попытки блокирования синтеза или разрушения полимерного матрикса, а также нарушения обмена информацией между клетками, называемого «чувством кворума». Приведенные отдельные примеры - лишь малая доля находящихся в разработке методов борьбы с бактериями. Однако необходимо признать, что единого способа, которым специфически и полностью уничтожаются бактерии, пока не разработано. По-видимому, такого способа не существует вообще. Поэтому все альтернативные разработки инактивации патогенных микроорганизмов актуальны и востребованы.

Один из эффективных способов воздействия на живые микроорганизмы - фотодинамическая обработка. В настоящее время установлены механизмы фотодинамического действия и определена роль в них активных форм кислорода (АФК). Однако исследования далеко не завершены, особенно для сред с ограниченным содержанием кислорода. К таким средам относятся, например, БП, в которых аэрирован только поверхностный слой и внутри пленки практически не формируются АФК.

Для повышения эффективности фотодеструкции бактерий в настоящей работе предложено наряду с окислением субстрата АФК дополнительно «включить» реакции с участием высоких электронно-возбужденных состояний (ВЭВС) фотосенсибилизаторов. Для этого, вместо традиционного возбуждения ФС непрерывным светом низкой интенсивности, воздействие на ФС производилось короткими импульсами высокой интенсивности. При этом значительная доля поглощаемой энергии неизбежно трансформируется через их ВЭВС. Энергообмен с окружением в ходе дезактивации ВЭВС молекул, в свою очередь, инициирует первичные физико-химические процессы, которые влияют на жизнеспособность бактерий.

Некоторые результаты фотоинактивации микроорганизмов с участием ВЭВС молекул ФС представлены в настоящей статье.

Исследованы культуры клеток Escherichia coli в физрастворе при нормальных условиях. Выживание бактерий после облучения видимым светом в присутствие ФС определялось посредством подсчёта колониеобразующих единиц (КОЕ). В качестве ФС использовались органические красители-анионы эритрозин и эозин, а также краситель-катион родамин 6Ж.

Фотосенсибилизаторы облучались излучением второй гармоники твердотельного лазера на YAG:Nd, работающего в импульсно-периодическом режиме. Параметры возбуждения: длина волны л = 532 нм, длительность импульса 15 нс, плотность мощности излучения (1 - 50) МВт/см².

Информацию о релаксации возбужденных состояний ФС получали по кинетике их замедленной флуоресценции и фосфоресценции, которые регистрировались с помощью ФЭУ-84 через монохроматор МДР-41.

Дополнительные сведения о процессах в растворах, содержащих бактерии и ФС, при воздействии на них интенсивным (свыше 10 МВт/см²) возбуждающим светом, получали по рассеянию зондирующего излучения гелий-неонового (He-Ne) лазера. С помощью цилиндрической линзы в кювете с исследуемым раствором формировалась узкая протяженная (0.3 х 10 мм²) зона возбуждения. Вдоль нее пропускался зондирующий луч He-Ne лазера диаметром 1 мм. Нерассеянная часть этого луча блокировалась 3 мм экраном в непосредственной близости от линзы, которая собирала рассеянное излучение на входной щели монохроматора. Кинетика изменения интенсивности рассеянного света измерялась с помощью ФЭУ.

Синхронизация запуска лазера и регистрирующей системы, а также сбор, накопление и обработка сигналов производились в автоматизированном режиме.

Cуществование эффективной интеркомбинационной конверсии (ИКК) из высоких синглетных S_n состояний многоатомных молекул экспериментально доказано и теоретически обосновано [2]. Показано, что квантовый выход ИКК из S_n состояний, примерно на 25 - 30 % превышает выход в триплетное состояние с нижних S₁ возбужденных уровней.

На рисунке 1 представлена зависимость интенсивности ЗФ эозина (с = 0.1 мМ) в физрастворе от плотности мощности возбуждающего излучения длины волны л = 532 нм. При увеличении мощности возбуждающего света интенсивность ЗФ красителей очень быстро нарастает (участок в диапазоне 15 МВт/см²), достигая насыщения, что связано с выходом на насыщение заселенности Т₁ состояний молекул, образовавшихся в результате S₁>T₁ ИКК. При дальнейшем повышении плотности мощности возбуждающего излучения интенсивность ЗФ эозина начинает вновь заметно увеличиваться. Это указывает на двухквантовый характер образования триплетных состояний молекул в результате последовательности переходов S₁>S_n>T_m>T₁.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рисунок 1 Зависимость интенсивности ЗФ эозина (с = 0.1 мМ) в физрастворе от плотности мощности возбуждающего излучения длины волны л = 532 нм

На рисунке 2 представлены гистограммы КОЕ клеток Escherichia coli после облучения светом длины волны л = 532 нм и плотности мощности 20 МВт/см².

Рисунок 2 Гистограммы КОЕ клеток Escherichia coli до и после облучения растворов светом длины волны л = 532 нм и плотности мощности 20 МВт/см² без красителей (0) и в присутствие красителей концентрации 0.1 мМ: 1 -эритрозин, 2 - эозин, 3 - родамин 6Ж

Видно, что и ксантеновые красители, и родамин 6Ж проявляют высокую фотодинамическую активность. Между тем, эти красители существенно различаются и по-разному взаимодействуют с бактериями. Известно, что в фотодинамических процессах основная функция ФС - генерация АФК, индуцирующих окислительные деструктивные процессы в среде. Ксантеновые сенсибилизаторы обладают большим квантовым выходом в триплетное состояние и с высокой эффективностью генерируют синглетный кислород [3-5]. Однако обращает на себя внимание то, что эозин, имея выход в триплетное состояние почти на 30% меньше, чем эритрозин, в условиях наших экспериментов оказывает ФДД не меньше, а даже больше, чем эритрозин. Родамин 6Ж в физрастворе имеет выход в триплетное состояние только 0,01 и практически не производит АФК, но его ФДД больше, чем у ксантеновых красителей. Таким образом, фотоинактивация бактерий в условиях наших экспериментов преимущественно осуществлялась не через АФК, а по другим механизмам.

Мы полагаем, что процессы фотоинактивации идут с участием ВЭВС молекул ФС. Релаксация высоковозбужденных синглетных состояний молекул возможна по одному из следующих каналов [2]:

- излучение (флуоресценция S_n>S_i или T_m>T_j);

- интеркомбинационная синглет-триплетная S_n>T_m или обратная триплет-синглетная T_m>S_k конверсия;

- безызлучательная внутренняя конверсия;

- фотохимическая реакция;

- перенос энергии на молекулы окружения.

Как видно, энергообмен ФС с биообъектами может осуществляться при фотохимических реакциях, в результате прямой безызлучательной передачи энергии фотовозбуждения или посредством тепловыделения.

Безызлучательная релаксация состояний ФС в среде сопровождается выделением тепла. Учитывая крайне малое время жизни (<< 1 нс) состояний молекул, ФС можно рассматривать как мгновенные точечные источники. Ввиду большой удельной теплоемкости среды маловероятно ожидать, что при релаксации состояния одной молекулы ФС заметно изменится локальная температура среды. Однако с учетом неравномерного распределения ФС в пространстве между бактериями или на поверхности клеточных стенок могут быть сосредоточены группы молекул. При близком расположении групп ФС можно ожидать существенного локального разогрева микрообластей растворов.

При локальном разогреве среды возможны два основных канала деструкции бактерий:

- гибель клеток в результате локальной гипертермии;

- разрушение мембран клеток или внутриклеточных объектов ударными волнами, возникающими при образовании и схлопывании пузырьков при испарении воды в локально разогретых микрообластях.

В результате безызлучательной релаксации ВВЭС каждый ФС при однократном поглощении кванта света длиной волны 532 нм будет выделять количество теплоты, равное энергии hн этого кванта. Если принять, что это тепло мгновенно усваивается сферой среды радиуса r, то можно оценить изменение температуры этой сферы: .

Мы использовали растворы концентрацией с = 0.01 мМ. Поскольку количество квантов возбуждающего излучения примерно в 10⁶ раз больше, чем количество молекул ФС в облучаемом объеме, то можно считать, что возбуждаются все облучаемые ФС. При плотности мощности выше 20 МВт/см² с высокой эффективностью заселяются S_n состояния молекул ФС (см. комментарий к рис. 1). Кроме того, каждая молекула ФС за время ф, равное длительности возбуждающего импульса (ф = 15 нс) может неоднократно поглотить квант hн, совершая переходы S₁-S_n (а также S₁>S_n>T_m>S₁, или T₁-T_m, или T₁>T_m>S₁>T₁).

Оценка времени остывания локально разогретых областей и величины ДT для сфер различного радиуса произведена в [2, 6]. Реальный физический размер зоны разогрева зависит от конкретных каналов релаксации энергии, присущих данной среде. Используя типичные значения термодинамических параметров C ~ 4•10³ Дж/(кг·К) и ~ 10³ кг/м³), можно провести оценку уровня локального нагрева среды. Если принять радиус разогреваемой сферы равным 10 нм, то одиночные ФС остывают за время около 10^-8 с. Если увеличить r до 100 нм, время остывания существенно увеличивается, но не превышает 10^-6 с. Для сферы радиуса 10 нм величина ДT не выше 10 К. Однако уже для радиуса втрое меньше ДT достигает почти 100 К. Выделившегося тепла вполне достаточно для испарения воды и возникновения пузырьков, образование и схлопывание которых порождает ударные волны. Распространяясь в среде, ударные волны механически повреждают белки, нуклеиновые кислоты или мембраны клеток.

Кинетика возникновения и исчезновения пузырьков в растворах исследована по рассеянию света He-Ne лазера. На рисунке 3 представлены типичные кинетические кривые изменения интенсивности света He-Ne лазера, прошедшего через кювету с эритрозином концентрацией 0.1 мМ в физрастворе при различной интенсивности возбуждения красителя. При малой плотности мощности (менее 10 МВт/см²) возбуждения интенсивность рассеянного света после возбуждения ФС убывает. Это обусловлено тем, что при одноквантовом возбуждении в результате S₁>T₁ ИКК образуются T₁ состояния и появляется триплет-триплетное T₁>T_m поглощение. Этот сигнал убывает за несколько микросекунд, что соответствует времени жизни T₁ состояний ФС.

При высокой плотности мощности (15 МВт/см² и выше) возбуждения характер рассеяния кардинально меняется. Интенсивность рассеянного света увеличивается, а время релаксации возрастает до десятков миллисекунд, что существенно превышает время тепловой релаксации. Увеличение интенсивности рассеяния, по нашему мнению, обусловлено возникновением пузырьков в локально разогретых областях среды при релаксации ВЭВС молекул красителей.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рисунок 3 Кинетические кривые изменения интенсивности рассеянного света от луча He-Ne лазера, проходящего через кювету с эритрозином концентрацией 0.1 мМ в физрастворе при различной интенсивности возбуждения красителя: а) 1- 4.7 МВт/см²; 2 - 42.2 МВт/см²; б) 1 - 9.3 МВт/см²; 2 - 15.1 МВт/см²

Наряду с разрушением бактерий ударными волнами для родамина 6Ж возможны еще два механизма фотодеструкции микроорганизмов. Первый основан на прямой гипертермии бактерий в результате тепловыделения при релаксации ВЭВС красителя. В основе другого механизма фотодеструкции микроорганизмов лежит безызлучательный перенос энергии электронного возбуждения с ВЭВС красителя на молекулы мембраны. При заселении ВЭВС молекул путем ступенчатого возбуждения двумя квантами света через нижнее синглетное состояние по схеме .достигается энергия ФС около 5 эВ. Такой энергии достаточно для разрыва любой химической связи.

Для определения вклада каждого из перечисленных альтернативных механизмов фотоинактивации микроорганизмов требуются дополнительные исследования.

Наконец, еще один возможный канал фотодеструкции бактерий - фотохимические реакции с участием ВЭВС молекул ФС. Фотохимические реакции сопровождаются изменениями кинетики затухания длительной люминесценции ФС, а также появлением новых полос в спектрах люминесценции и поглощения Нам не удалось обнаружить новых полос в спектрах люминесценции и поглощения, а также изменений кинетики затухания длительной люминесценции ФС.

Список литературы

1. Kashef, N. Advances in antimicrobial photodynamic inactivation at the nanoscale. Review article. / N. Kashef, Y. Huang, M.R. Hamblin // Nanophotonics. 2017. V. 6 (5). P. 1-27.

2. Летута, С.Н. Фотопроцессы с участием высоких электронно-возбужденных состояний многоатомных молекул. Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора физико-математических наук / С.Н. Летута. / Москва: МГУ им. М.В. Ломоносова, 2003.

3. Letuta, S.N. Delayed luminescence of erythrosine in biological tissue and photodynamic therapy dosimetry / S.N. Letuta, S.N. Pashkevich, A.T. Ishemgulov, Yu.D. Lantukh, E.K. Alidzhanov, S.S. Sokabaeva, V.V. Bryukhanov // Journal of Photochemistry & Photobiology B. 2016. V. 163. P. 232-236.

4. Летута, С.Н. Кинетика длительной люминесценции молекулярных зондов в клетках биологических тканей / С.Н. Летута, В.С. Маряхина, С.Н. Пашкевич, Р.Р. Рахматуллин // Вестник Оренбургского государственного университета. 2011. № 1 (120). С. 183-187.

5. Ишемгулов, А.Т. Длительная люминесценция сенсибилизаторов в условиях дефицита кислорода в тканях при фотодинамическом эффекте / А.Т. Ишемгулов, С.Н. Летута, С.Н. Пашкевич, Э.К. Алиджанов, Ю.Д. Лантух // Оптика и спектроскопия. 2017. Т. 123. № 5. С. 818-824.

6. Кучеренко, М.Г. Кинетика нелинейных фотопроцессов в конденсированных молекулярных системах. / М.Г. Кучеренко. Оренбург: Изд-во ОГУ, 1997.

Размещено на Allbest.ru