Шапероны Hsp60, Hsp70, Hsp100, Триггер Фактор и

Размещено на http://www.allbest.ru/

На правах рукописи

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Шапероны Hsp60, Hsp70, Hsp100, Триггер Фактор и протеаза Lon как эффективные модуляторы активности люцифераз и белков LuxR мезофильных и психрофильных морских бактерий

03.02.07 - Генетика

Горянин Игнатий Игоревич

Москва - 2014

Работа выполнена в лаборатории генетики бактерий Федерального государственного унитарного предприятия «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов» (ФГУП «ГосНИИ генетика»).

Научный руководитель:

доктор биологических наук Манухов Илья Владимирович

ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов»

ведущий научный сотрудник

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Хмель Инесcа Александровна

Институт молекулярной генетики РАН

заведующий лабораторией

доктор биологических наук, профессор Добров Евгений Николаевич

МГУ им. М. В. Ломоносова, Научно-исследовательский институт физико-химической биологии им. А.Н.Белозерского

ведущий научный сотрудник

Ведущая организация:

Учреждение Российской академии наук Центр «Биоинженерия» РАН

Защита состоится « » 2014 г. в 14 часов на заседании Диссертационного совета Д 217.013.01 при ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов» по адресу: 117545, г. Москва, 1-й Дорожный проезд, д. 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов», http://www.genetika.ru/

Автореферат разослан « » 2014 г.

Ученый секретарь

Диссертационного совета

кандидат химических наук Воюшина Татьяна Львовна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования

За последние годы достигнут значительный прогресс в понимании механизмов работы шаперонов и протеаз, необходимых для преодоления стрессовых воздействий на бактериальную клетку и правильной сборки белков.

В бактериальных клетках в процессе роста образуются неправильно собранные и денатурированные белки, количество которых значительно нарастает при стрессовых ситуациях, а также при суперпродукции гетерологичных белков. Важную роль в преодолении негативных последствий для клетки, возникающих в результате агрегации белков, играют шапероны семейств Hsp60, Hsp70, Hsp100, sHsp и АТФ-зависимые протеазы (Gragerov A.I. et al., 1991; Hartl F.U., 1996; Tomoyasu T. et al., 2001). Сравнительно недавно была обнаружена шаперонная активность Триггер Фактора (ТФ), кодирующегося геном tig в геноме бактерий Escherichia coli (Liu C.P. et al., 2005). В настоящее время продолжают оставаться актуальными исследования механизмов проведения шаперонами рефолдинга денатурированных белков, а также роли шаперонов и протеаз в регуляции экспрессии бактериальных генов, в частности, в регуляторных системах скоординированного ответа (Quorum Sensing, QS). В диссертационной работе для исследования механизмов работы шаперонов в качестве систем, восстанавливающих нативную структуру термоинактивированных белков, и определения роли шаперонов и протеаз в модуляции активности QS систем впервые в качестве модели используются белки, кодируемые генами lux-оперонов психрофильных бактерий. Проводится сравнение активности и специфичности шаперонов и протеаз при использовании в качестве субстратов термостабильных и термолабильных люцифераз и белков-регуляторов.

Необходимо отметить важную роль шаперонов в организме человека, так как нейродегенеративные болезни: болезни Альцгеймера, Паркинсона, Хантингтона, прионовые болезни - вызываются агрегацией различных групп белков с их конверсией в амилоидоподобные надмолекулярные структуры (Saibil H., 2013).

Цели и задачи

Целью данной работы было определение роли шаперонов и протеаз в регуляции транскрипции QS систем и в фолдинге и рефолдинге термолабильных люцифераз, гены которых входят в состав lux-оперонов психрофильных бактерий Aliivibrio logei и мезофильных Aliivibrio fischeri.

Для достижения данной цели были проведены исследования влияния АТФ-зависимых шаперонина GroEL/GroES (семейство Hsp60) и протеазы Lon на регуляцию экспрессии генов lux-оперонов морских люминесцирующих мезофильных и психрофильных бактерий, исследования участия шаперонов DnaKJE (семейство Hsp70) и ClpB (семейство Hsp100) в фолдинге и рефолдинге термолабильной люциферазы психрофильных бактерий A. logei, а так же исследования рефолдинга, проводимого шапероном ТФ, бактериальных люцифераз, характеризующихся разным уровнем термостабильности. В ходе исследований были поставлены и решены следующие задачи.

1. Определение участия шаперонинов GroEL/GroES на фолдинг белков LuxR1 и LuxR2 психрофильных бактерий A. logei.

2. Определение роли Lon протеазы в процессе деградации белков LuxR1 и LuxR2 психрофильных бактерий A. logei.

3. Проведение сравнительного анализа влияния шаперонина GroEL/GroES и Lon протеазы на поддержание активных форм белков LuxR1 и LuxR2, регулирующих транскирипцию lux-оперонов психрофильных бактерий A. logei, и LuxR мезофильных бактерий A. fischeri.

4. Провести сравнительный анализ термостабильности и способности к рефолдингу люциферазы психрофильных бактерий A. logei в сравнении с люциферазой мезофильных бактерий A. fischeri, исследовать участие шаперонов в фолдинге и рефолдинге термолабильной люциферазы психрофильных бактерий A. logei.

5. Определение основных параметров ТФ-зависимого рефолдинга термоинактивированных люцифераз. Установление зависимости уровня рефолдинга различных по термостабильности люцифераз от концентрации ТФ и времени действия. Определение влияния шаперонов семейства Hsp100 на ТФ - зависимый рефолдинг.

6. Изучение процесса рефолдинга, проводимого ТФ при использовании в качестве субстратов мономерных и димерных форм люцифераз.

7. Проведение сравнительного анализа основных характеристик шаперонной активности ТФ из мезофильных бактерий E. coli и психрофильных бактерий Psychrobacter frigidicola. Сравнение зависимости уровня рефолдинга термоинактивированных люцифераз от концентрации и от времени действия ТФ.

8. Изучение влияния ТФ мезофильных бактерий E. coli и психрофильных бактерий P. frigidicola на жизнеспособность клеток E. coli. Определение характера кривых ренатурации различных по термостабильности термоинактивированных люцифераз, проводимой ТФ из психрофильных бактерий P. frigidicola. Изучение рефолдинга мономерных и димерных форм люциферазы, проводимого ТФ из психрофильных бактерий.

9. Определение влияния шаперонов семейства Hsp100 на рефолдинг, проводимый ТФ из психрофильных бактерий P. frigidicola.

Научная новизна

Впервые показано, что шаперонин GroEL/ES и АТФ-зависимая протеаза Lon участвуют в процессе формирования нативной формы и деградации активаторов транскрипции систем QS LuxR2 психрофильных бактерий A. logei и LuxR мезофильных бактерий A. fischeri. На активность LuxR1 A. logei шаперонин GroEL/ES и протеаза Lon не влияют.

Проведено исследование термостабильности и способности к рефолдингу бактериальной люциферазы A. logei, проведено сравнение с люциферазами из мезофильных бактерий.

Были определены основные параметры процесса рефолдинга термоинактивированных люцифераз проводимого шапероном Триггер Фактором из мезофильных бактерий E. coli и психрофильных P. frigidicola in vivo в клетках E. coli. Изучено влияние шаперона ClpB на ТФ - зависимый рефолдинг. Показано, что термостабильные люциферазы характеризуются сравнительно низким уровнем ТФ - зависимого (как и DnaKJE-зависимого) рефолдинга в отличие от термочувствительных люцифераз, которые восстанавливают активность после термоинактивации значительно полнее. Впервые получены данные о том, что рефолдинг мономерных форм люциферазы не проводится ТФ как из психрофильных, так и из мезофильных бактерий.

Теоретическая и практическая значимость работы

шаперон рефолдинг бактерия люцифераза

Гены lux-оперонов, обеспечивающих биолюминесценцию морских и наземных светящихся бактерий, в настоящее время находят широкое применение в качестве генов-репортеров в работах по молекулярной генетике, при биохимических анализах, в генно-инженерных работах (селекция) и ряде других. Цельноклеточные биосенсоры, использующие в качестве генов-репортеров гены luxAB, кодирующие бактериальные люциферазы, используют в работах по экологическому мониторингу, тестированию токсичных агентов в пищевых продуктах, а также в разработках и тестировании новых медицинских препаратов. Проведенное в диссертационной работе исследование о влиянии шаперонов и протеаз на активность активаторов транскрипции систем QS (белки LuxR, LuxR1 и LuxR2) может быть использовано для увеличения чувствительности lux-биосенсоров.

Практической значимостью данных по изучению способности к восстановлению активности после термоинактивации белков, различающихся по термостабильности, представленных в диссертационной работе, является создание разнообразных моделей, что дает возможность выбора наиболее подходящей из них для конкретной задачи изучения механизмов рефолдинга денатурированных белков.

В настоящее время шапероны находят широкое применение в области биотехнологии при конструировании штаммов для суперпродукции гетерологичных белков. Введение в клетку совместно двух плазмид, кодирующих белок-субстрат, и белки-шапероны, позволяет значительно повысить выход растворимых нативных форм белка-субстрата (Schultz et al., 2006; De Marco et al., 2007; De Marco, 2007; Nicoll et al., 2006; Kolaj et al., 2009; Doglia et al., 2014). Исследование активности АТФ - независимого шаперона ТФ имеет значение для повышения выхода нативных форм гетерологичных белков при создании продуцентов.

АТФ - зависимые протеазы могут использоваться в качестве ингибиторов систем QS, например, для снижения активности вирулентных генов у патогенных бактерий.

Предполагается провести поиск наиболее активных вариантов ТФ, которые будут использованы для исследования способности ТФ к дезагрегации амилоидоподобных надмолекулярных структур и последующем проведении доклинических испытаний препарата, содержащего шапероны, для терапии нейродегенеративных заболеваний.

Методология и методы исследования

Исследования влияния АТФ - зависимых шаперонина GroEL/GroES и протеазы Lon на регуляцию экспрессии генов lux-оперонов морских люминесцирующих мезофильных и психрофильных бактерий A. fischeri и A. logei проводились методом сравнительного анализа зависимости интенсивности биолюминесценции клеток, содержащих биосенсорную плазмиду с исследуемым активатором транскрипции в штаммах дикого типа и штаммах E. coli, мутантных по шаперонину GroELS или протеазе Lon, от концентрации добавленного индуктора и от времени инкубации.

Для сравнительного анализа термостабильности люцифераз из психрофильных бактерий A. logei и мезофильных бактерий A. fischeri проводилось измерение зависимости уровня биолюминесценции от времени термоинактивации в клетках E. coli, содержащих делецию ДdnaKJ. Сравнение способности к рефолдингу люцифераз проводилось in vivo в клетках дикого типа в результате измерения уровня рефолдинга в зависимости от времени инкубации.

Исследования рефолдинга термоинактивированных люцифераз, проводимого ТФ как из мезофильных бактерий E. coli так и из психрофильных бактерий P. frigidicola, проводились in vivo в штамме E. coli, содержащем делецию ДdnaKJ при экспрессии генов ТФ с введенной в клетки плазмиды. В клетки вводилась также вторая плазмида, обеспечивающая экспрессию генов одной из бактериальных люцифераз. Концентрацию ТФ в клетки регулировали добавлением индуктора, специфического для данного промотора, под контролем которого находятся гены мезофильного или психрофильного ТФ.

В исследованиях DnaKJE - зависимого рефолдинга использовались либо штаммы E. coli дикого типа с проведением предварительного «теплового шока» (для увеличения количества белков системы шаперонов DnaKJE-ClpB), либо штамм, содержащий делеции по генам dnaK и dnaJ, с введением плазмиды, обеспечивающей продукцию белков DnaKJE.

Данные о влиянии шаперона семейства Hsp100 на ТФ - зависимый рефолдинг получены в результате сравнения зависимости максимального уровня рефолдинга от времени в клетках E. coli дикого типа и мутантных по гену clpB. Необходимо подчеркнуть, что в этих экспериментах «тепловой шок» для увеличения количества белков системы шаперонов DnaKJE-ClpB не проводился.

В опытах по изучению роли ТФ в рефолдинге термоинактивированных белков in vitro использовалась двухкомпонентная система (R+L), содержащая очищенную люциферазу Photobacterium leiognathi.

Изучение влияние ТФ из мезофильных бактерий E. coli и психрофильных бактерий P. frigidicola на жизнеспособность клеток E. coli проводилось согласно размножению клеток E. coli штамма, содержащего делецию ДdnaKJ, при экспрессии гена tig, расположенного под контролем арабинозного промотора (araBAD), различными концентрациями L-арабинозы.

Положения, выносимые на защиту

1. Шаперонин GroELS и протеаза Lon участвуют в процессах контроля нативных форм (формирования и деградации) белка LuxR2 из психрофильных бактерий A. logei и белка LuxR из мезофильных бактерий A. fischeri, и не участвует в модуляции активности белка LuxR1 A. logei.

2. Люцифераза из психрофильной бактерии A. logei характеризуется равной термостабильностью, но сниженным уровнем DnaKJE-зависимого рефолдинга по сравнению с люциферазой мезофильных бактерий A. fischeri.

3. Рефолдинг термоинактивированных люцифераз, проводимый шаперонами ТФ мезофильных бактерий E. coli (ТФEc) и психрофильных бактерий P. frigidicola (ТФPf) примерно совпадает по скорости, уровню, эффекту повышения уровня в отсутствии шаперона ClpB, эффекту снижения эффективности при увеличении термостабильности используемой в качестве субстрата люциферазы и неспособности использования в качестве субстрата мономерных форм люцифераз, что значительно отличает его от DnaKJE - рефолдинга.

4. Повышение концентрации ТФEc в мутантном штамме E.coli ДdnaKJ приводит к снижению жизнеспособности и спаду уровня рефолдинга термоинактивированных люцифераз, однако с повышением концентрации ТФPf максимальный уровень рефолдинга увеличивается и достигает плато.

Степень достоверности и апробация результатов

Материалы исследования по теме диссертации опубликованы в трех статьях и представлены на V и VI съездах Вавиловского общества генетиков и селекционеров в 2009 и 2014 г., соответственно. Диссертационная работа была апробирована на семинаре секции «Генетика микроорганизмов» Ученого Совета ФГУП «ГосНИИгенетика» 16 марта 2014 г.

Структура работы

Диссертация изложена на 110 листах машинописного текста, включая 40 рисунков и 2 таблицы. Работа состоит из Введения, Обзора литературы, Экспериментальной части, включающей описание Материалов и Методов, изложения и обсуждения результатов, Заключения, Выводов и Списка цитируемой литературы (159 наименований).

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Участие АТФ - зависимых шаперонов и протеаз в экспрессии генов lux-оперонов психрофильных бактерий A. logei и мезофильных A. fischeri

Роль АТФ - зависимых шаперонов и протеаз в регуляции QS систем

У морских люминесцирующих бактерий A. fischeri и A. logei экспрессия lux-генов регулируется системой "LuxI-LuxR", которая определяет интенсивность биолюминесценции растущих клеток в зависимости от плотности популяции (Quorum Sensing): отсутствие свечения при малых концентрациях клеток и резкое усиление свечения при достижении популяцией критической плотности (Fuqua et al., 1994; Fuqua et al., 1996; Dunlap and Urbanczyk, 2013; Rosenberg et al., 2013). Принципиальным отличием психрофильных бактерий A. logei от мезофильных A. fischeri является наличие в lux-опероне двух копий регуляторного гена luxR (luxR1 и luxR2)(Manukhov et al., 2011; Хрульнова и др., 2011) (рис 1).

Рис 1. lux-опероны A. fischeri и A. logei KCh1

Чувствительность к аутоиндуктору (АИ) регуляторной области luxR1-Pr1 A. logei значительно ниже таковой регуляторных областей luxR2-Pr2 A. logei и luxR-Pr A. fischeri, которые характеризуются примерно равной чувствительностью.

Было обнаружено, что при введении плазмиды, содержащей полный lux-оперон A. fischeri, в E. coli, мутантные по гену groEL, интенсивность биолюминесценции клеток значительно снижается (Adar et al., 1992; Dolan and Greenberg, 1992). Авторы предположили, что шаперонин GroEL/ES участвует в сборке (фолдинге) белка - активатора транскрипции LuxR.

В представленной диссертационной работе исследуется роль шаперонина GroEL/ES в фолдинге белков-регуляторов LuxR1 и LuxR2 психрофильных бактерий A. logei и мезофильных A. fischeri. Показано, что отсутствие шаперонина GroEL не сказывается ни на времени начала нарастания, ни на максимальном значении биолюминесценции клеток, содержащих плазмиду с геном, кодирующим LuxR1. Следовательно, GroELS не участвует в процессе сборки (фолдинге) белка LuxR1.

На рис. 2 “A” приведены данные зависимости интенсивности биолюминесценции клеток SKB178 gro+ и OFB1111 groEL673 от концентрации добавленного АИ. Штаммы содержали плазмиду pVFR1, в составе которой гены luxCDABE Photorhabdus luminescens находятся под контролем промотора, активируемого белком LuxR A. fischeri.

А. Б.

Рис 2. Влияние шаперонина GroELS на фолдинг (“A”) белка LuxR мезофильных бактерий A. fischeri (?) - SKB178 gro+(pVFR1); (?) - OFB1111groEL673 (pVFR1) и (“Б”) белка LuxR2 психрофильных бактерий A. logei. (^) - SKB178 gro+ (pSV16); (?) - OFB1111 groEL673 (pSV16).

Как видно из рис 2 “А”, минимальная (пороговая) концентрация АИ, при которой происходит резкой увеличение биолюминесценции, в случае штамма SKB178 gro+ равняется 10-9 М, в то время как для мутантного штамма OFB1111 groEL673 пороговая концентрация АИ равна 10-7 M. Снижение чувствительности к АИ в 100 раз в штамме с мутацией groEL673 объясняется уменьшением количества белка LuxR в нативной форме и, соответственно, способного готового связывать АИ, димеризоваться и взаимодействовать с промоторной областью. Как видим, уровень интенсивности биолюминесценции становится равным в gro+ и groEL673 штамме при больших концентрациях добавляемого АИ. Следовательно, дефект groEL673 в определенной степени может быть компенсирован при добавлении в среду высоких концентраций АИ.

Исследование влияние шаперонина GroELS на активность белка LuxR2 A. logei в качестве активатора транскрипции также проводилось в штамме E. coli мутантном по гену groEL в сравнении со штаммом gro+. На рис. 2 “Б” приведена зависимость интенсивности биолюминесценции клеток SKB178 gro+ и OFB1111 groEL673 от концентрации добавленного АИ. Штаммы содержали плазмиду pSV16, в составе которой гены luxCDABE P. luminescens находятся под контролем промотора, активируемого белком LuxR2 промотора. Как и в случае с белком LuxR A. fischeri, наблюдается примерно 100-кратное увеличение пороговой концентрации АИ, требующегося для активации транскрипции белком LuxR2 A. logei, в штамме с мутацией groEL673. Добавление АИ высокой концентрации к клеткам E.coli OFB1111 groEL673 (pSV16) снижает, но, все же, полностью не нивелирует разницу в интенсивности биолюминесценции между штаммом с мутацией groEL673 и штаммом gro+. По-видимому, белок LuxR2 из психрофильных бактерий A. logei менее стабилен, чем LuxR из мезофильных бактерий A. fischeri и, не успевая связаться с АИ, денатурирует быстрее или инактивируется уже после образования комплекса с АИ.

В работах (Завильгельский и Манухов, 1994; Завильгельский и Манухов, 1997) было показано, что протеаза Lon проводит деградацию белка-активатора LuxR и тем самым участвует в негативной регуляции системы QS Vibrio fischeri (в настоящее время, Aliivibrio fischeri). Позднее влияние протеазы Lon было определено для систем QS в бактериях Pseudomonas putida. и Agrobacterium tumefaciens. (Bertani et al., 2007; Zhu and Winans, 2001).

В диссертационной работе приведены данные о том, что отсутствие протеазы Lon не приводит ни к повышению уровня, ни к уменьшению времени начала нарастания биолюминесценции в клетках с lux-опероном, регулируемым исключительно LuxR1. В отличие от LuxR2 белок LuxR1 не является мишенью для протеазы Lon.

Для сравнения действия протеазы Lon на активность белков LuxR из A. fischeri и LuxR2 из A. logei, использовали штаммы бактерий E. coli AB1157 lon+ и AB1899 lon-. В клетки этих штаммов были введены плазмиды, в которых гены luxCDABE P. luminescens находятся под контролем промотора, регулируемого белком LuxR A. fischeri (плазмида pVFR1) и под контролем промотера, регулируемого белком LuxR2 A. logei (плазмида pSV16).

А. Б.

Рис 3. Влияние протеазы Lon на активноcть (“A”) белка-активатора LuxR из A. fischeri. (Ѓў) - AB1157 lon+; (Ѓћ) - AB1899 lon-, штаммы содержали плазмиду pVFR1; и активность (“Б”)белка-активатора LuxR2 из A. logei; (^) - AB1157 lon+; (?) - AB1899 lon- штаммы содержали плазмиду pSV16.

В клетках E. coli AB1899 lon-1 (pVFR1), наблюдается уменьшение, примерно в 10 раз, пороговой концентрации АИ приводящей к значительному активации транскрипции (Рис 3 “A”). Уменьшение пороговой концентрации и повышенная интенсивность биолюминисценции при малых концентрациях АИ в штамме lon-1 свидетельствует о том, что LuxR подвергается Lon-зависимому протеолизу. Кроме того, отметим, что добавление к клеткам высоких концентраций АИ оказывает защитное действие от деградации Lon протеазой.

Для исследования влияния протеазы Lon на эффективность работы активатора транскрипции LuxR2 из психрофильных бактерий A. logei, интенсивность биолюминесценции, которая обеспечивается наличием плазмиды pSV16, также измеряли в клетах E. coli AB1157 lon+ и AB1899 lon-. Зависимость интенсивности биолюминесценции клеток культур AB1157 (pSV16) и AB1899 (pSV16) от концентрации добавленного АИ представлена на рис. 3 “Б”. Отсутствие протеазы Lon повышает чувствительность к АИ белка LuxR2 примерно на порядок. Помимо этого интенсивность биолюминесценции, при одинаковых концентрациях добавленного АИ, увеличивается примерно на порядок в клетках с дефективным геном lon. Отметим, что в случае c белком LuxR2, защитное от деградации протеазой Lon действие добавленого АИ менее эффективно.

Приведённые данные свидетельствуют о том, что шаперонин GroEL является положительным модулятором активности экспрессии генов lux-оперона A. logei, в то время как протеаза Lon осуществляет негативную модуляцию активности. Белок LuxR2 - регулятор lux-оперона A. logei является мишенью как для шаперонина GroEL, так и для протеазы Lon. Наличие в клетках большого количества АИ помогает восстановить активность LuxR A. fischeri и активировать транскрипцию генов luxCDABE до того уровня, который фиксируется в присутствии шаперонина GroEL/GroES или в отсутствии протеазы Lon. Также имеет место защитное действие АИ с белком LuxR2 A. logei, однако полного восстановления эффективности транскрипции не происходит.

Влияние АТФ - зависимых шаперонов на активность белков-люцифераз, кодируемых структурными генами luxAB lux-оперонов.

В 1999 г. бактериальные люциферазы были впервые использованы в качестве субстратов для изучения активности шаперонных систем (Manukhov et al., 1999). Было показано, что термоинактивированная люцифераза A. fischeri эффективно ренатурирует in vivo (в клетках E. coli) при непосредственном участии шаперонов системы DnaK-DnaJ-GrpE (DnaKJE). При исследовании эффективности действия шаперонов DnaKJE на субстратах - люциферазах, характеризующихся различной термостабильностью, было показано, что чем выше термостабильность люциферазы, тем менее эффективен процесс DnaKJE-зависимой ренатурации (Завильгельский и др., 2004).

В настоящей работе для анализа активности шаперонов были использованы люциферазы психрофильных бактерий A. logei. Аминокислотные последовательности белков A. fischeri и A. logei высоко гомологичны и при этом значительно отличаются от соответствующей аминокислотной последовательности люциферазы Photobacterium phosphoreum. Скорость термоинактивации примерно равна для люцифераз бактерий A. fischeri и A. logei. (рис 4).

Однако люциферазы психрофильных бактерий A. logei и мезофильных бактерий A. fischeri характеризуются значительным отличием процессов DnaK - зависимого рефолдинга после термоинактивации (рис 5).

Было предположено, что пониженная способность люциферазы A. logei ренатурировать с помощью шаперонов семейства DnaKJE-ClpB, возможно, определяется аминокислотными заменами в области С-терминальных альфа-спиралей (альфа-спирали 3 и 4), которые участвуют в формировании гетеродимера (альфа-бета). Эти аминокислотные замены могли приводить к ослаблению контакта в гетеродимере между мономерами, и распаду гетеродимера на мономеры при термоинактивации, что значительно снизило бы эффективность рефолдинга люциферазы, проводимого системой шаперонов DnaKJE-ClpB. Сравнивание аминокислот в позициях межсубъединичного контакта люцифераз показало, что все, кроме одной, вступающие в контакт аминокислоты люцифераз бактерий A. fischeri и A. logei либо идентичны, либо схожи по заряду и длине боковой цепи. Для проверки важности единственной аминокислотной замены в субъединице LuxB люциферазы A. logei, а, следовательно, и всего межсубъединичного контакта, в процессе рефолдинга люциферазы A. logei был сконструирован мутантный luxB ген, кодирующий в-субъединицу люциферазы A. logei с заменой L48K. В полученном белке LuxB L48K все аминокислоты, участвующие в межъсубъединичном контакте совпадают с таковыми у люциферазы из A. fischeri.

На рис. 4 представлены кинетические кривые термоинктивации нативной люциферазы LuxAB A. logei и мутантной люциферазы A. logei LuxAB L48K, полученные при инкубации клеток при 33°С. Для сравнения приведены также кинетические кривые термоинактивации люциферазы мезофильных бактерий A. fischeri и люциферазы психрофильных бактерий P. phosphoreum. Термоинактивацию люцифераз проводили in vivo в клетках E. coli K12 штамма PK202 ДdnaKJ, содержащих гибридную плазмиду с генами luxAB (pF2, pSVAB1, pPho1, pL48K).

Как видим, зависимость от времени термоинактивации люцифераз A. logei, ее мутантного варианта и люциферазы A. fischeri практически идентична. Заметно даже некоторое увеличение термостабильности для мутантного варианта LuxAB L48K. Это показывает, что мутация L48K как минимум не делает люциферазу A. logei более термочувствительной. Люцифераза P. phosphoreum инактивируется при 33°C значительно быстрее.

Рис. 4 .Инактивация мезофильной люциферазы A. fischeri и психрофильной люциферазы A. logei, ее мутантного варианта и люциферазы P. phosphoreum при 33° С. ^ - A. logei LuxAB L48K; ¦ - A. fischeri LuxAB; - A. logei LuxAB; ? - P. phosphoreum LuxAB.

Кинетику и уровень рефолдинга термоинактивированных люцифераз измеряли in vivo в клетках E. coli K12 MG1655, содержащих гибридную плазмиду с генами luxAB (pF2, pSVAB1, pPho1, pL48K) (рис. 5). Рефолдинг проводили при температуре 23°C.

Рис.5 .Рефолдинг мезофильной люциферазы A. fischeri и психрофильной люциферазы A. logei.в клетках E. coli штамма MG1655. ^ - A. logei LuxAB L48K; ¦ - A. fischeri LuxAB; - A. logei LuxAB; ? - P. phosphoreum LuxAB.

Все четыре люциферазы восстанавливают активность при действии шаперона DnaKJE. Однако люциферазы A. fischeri и P. phosphoreum ренатурируют значительно полнее (до 80-90% от исходного уровня), чем люцифераза A. logei и ее мутантный вариант, для которых, как правило, уровень рефолдинга едва достигает 10-15%.

Сниженная способность люциферазы A. logei к рефолдингу по сравнению с люциферазой A. fischeri, которая имеет высокую схожесть аминокислотных остатков в активном центре фермента, не определяется также и межсубъединичным взаимодействием.

Как правило, ферменты психрофильных бактерий характеризуются повышенной активностью по сравнению с ферментами мезофильных бактерий. Однако согласно данным настоящей работы, люцифераза психрофильных бактерий вида A. logei по своим параметрам близка люциферазе мезофильных бактерий A. fischeri, но не люциферазе психрофильных бактерий P. phosphoreum, а замена L48K приводит к повышению термостабильности люциферазы A. logei по сравнению с люциферазой A. fischeri.

2. Триггер Фактор - зависимый рефолдинг бактериальных люцифераз

Основные характеристики ТФ мезофильных бактерий E. coli как шаперона осуществляющего рефолдинг термоинактивированных люцифераз.

Триггер Фактор (ТФ) - первый шаперон, взаимодействующий с вновь синтезируемой полипептидной цепью в момент ее выхода из рибосомы в цитоплазму. ТФ участвует в судьбе синтезируемых белков не только на рибосоме, но и в цитоплазме. В добавление к его роли в фолдинге белков de novo (вместе с DnaKJE и GroELS шаперонными системами), ТФ может связываться с нативными формами белков и стабилизировать их, осуществляя помощь в их кооперативной сборке (олигомеры, рибосомные субъединицы). Предполагается, что некоторые белки могут формировать нативную конформацию, находясь связанными с ТФ (Hoffmann et al., 2010).

ТФ - зависимый рефолдинг термоинактивированной люциферазы проводили in vivo в клетках E. coli PK202 dnaKJ14 dksA::kan, содержащих гибридные плазмиды с генами luxAB (pF2) и с геном tig (pTf16) (рис. 6). В плазмиде pTf16 под контролем арабинозного промотора расположен ген tig, кодирующий ТФ из мезофильных бактерий E. coli (ТФEc).



Рис. 6. Кинетика рефолдинга термоинактивированной люциферазы A. fischeri в клетках Escherichia coli PK202 dnaKJ14 dksA::kan: () - PK202 (pF2); () - PK202 (pF2, pTf16); () - PK202 (pF2, pKJE7).

В клетках PK202 dnaKJ14 dksA::kan в отсутствие плазмиды pTf16 рефолдинг люциферазы практически отсутствует (не более 1%). Однако при наличии в клетках плазмиды pTf16, наблюдается эффективный рефолдинг (до 40% от исходного уровня). Для сравнения на рис. 6 представлена кинетическая кривая для DnaKJE - зависимого рефолдинга той же люциферазы (клетки E. coli PK202 содержат вместо pTf16 плазмиду pKJE7). Как видим, кинетические кривые ТФEc - и DnaKJE - рефолдинга значительно различаются как по скорости восстановления нативной структуры белка (DnaKJE - рефолдинг осуществляется со значительно более высокой скоростью), так и по максимальному уровню рефолдинга (40% и 80-90% для ТФEc - и DnaKJE - рефолдинга, соответственно).

Как было показано ранее, с увеличением концентрации шаперонов DnaKJE уровень рефолдинга быстро нарастает с последующим выходом кривой на плато (Tomoyasu et al., 1998) На рис. 7 представлена зависимость максимального уровня ТФEc - рефолдинга термоинактивированной люциферазы A. fischeri от концентрации ангидротетрациклина - индуктора тетрациклинового промотора, под которым в плазмиде pG-Tf2 расположен ген tig, кодирующий ТФEc.



Рис. 7. Зависимость максимального уровня ТФEc - рефолдинга термоинактивированной люциферазы A. fischeri от концентрации ангидротетрациклина. По оси ординат отложена активность люциферазы (в процентах от исходного уровня), по оси абсцисс - концентрация ангидротетрациклина (нг/мл).

Как видим, с увеличением в среде концентрации индуктора (и соответственно, концентрации ТФ в клетке) уровень рефолдинга быстро снижается практически до нуля.

Как было показано ранее, эффективность DnaKJE - рефолдинга снижается при увеличении термостабильности белка-люциферазы (Manukhov et al., 1999; Завильгельский и др., 2004). На рис. 8 приведены кривые ТФEc - рефолдинга различающихся по термостабильности люцифераз. Опыты проводили в штамме PK202, содержащем плазмиду pTf16 совместно с одной из ниже перечисленных плазмид с генами luxAB, кодирующими люциферазы с различной термочувствительностью, pF2 (A. fischeri), pLeo1 (P. leiognathi), pKLux (Vibrio harveyi), pXen4 (P. luminescens). Согласно измерению констант скорости термоинактивации при 43,5°C люцифераза A. fischeri и P. leiognathi термолабильнее люцифераз V. harveyi и P. luminescens в 3,5 раза и в 15 раз, соответственно (Zavilgelsky et al., 2004).



Рис. 8. Кинетика ТФEc - рефолдинга термоинактивированных люцифераз в клетках E. coli PK202 dnaKJ14 dksA::kan (pTf16). () - A. fischeri; () - P. leiognathi; () - V. harveyi; (Ч) - P. luminescens.

Наблюдается аналогичная закономерность, что и в случае DnaKJE-рефолдинга, т.е. с повышением термостабильности люциферазы уровень ТФEc - рефолдинга снижается, причем в варианте с наиболее термостабильной люциферазы P. luminescens уровень рефолдинга снижается практически до нуля.

Как известно, система DnaKJE действует в клетке в комплексе с шапероном ClpB (бишаперонная система DnaKJE-ClpB) (Goloubinoff et al., 1999). Проведена оценка влияния шаперона ClpB на DnaKJE - и ТФEc - рефолдинг. Для этого кинетику и уровень рефолдинга термоинактивированной люциферазы определяли в клетках SG22100, мутантных по гену clpB (рис.9, б). Как видим, в отличие от системы DnaKJE, которой шаперон ClpB помогает проводить рефолдинг (90% при наличии белка ClpB, 6% - в отсутствии белка ClpB) (рис. 9, в), в случае ТФEc - рефолдинга наличие в клетках шаперона ClpB снижает уровень рефолдинга (рис. 9, а). В клетках, мутантных по гену clpB, максимальный уровень ТФEc - рефолдинга составляет 55% (рис. 9, б), что примерно в 4 раза превышает уровень ТФЕс - рефолдинга в клетках clpB+ (15%).

Рис. 9. Кинетика рефолдинга термоинактивированной люциферазы A. fischeri в клетках E. coli (pF2): (а) SG20250 dnaKJE+ clpB+, светлые символы - клетки без плазмиды pTf16, темные символы - клетки содержат плазмиду pTf16; (б) SG22100 dnaKJ+ clpB-, светлые символы - клетки без плазмиды pTf16, темные символы - клетки содержат плазмиду pTf16; (в) светлые символы - рефолдинг в клетках штамма SG22100 dnaKJ+ clpB-, темные символы - рефолдинг в клетках штамма SG20250 dnaKJ+ clpB+ (в данном варианте были использованы клетки, предварительно выдержанные при 42C 30 мин без хлорамфеникола - предварительный «тепловой шок» для увеличения количества DnaKJE-ClpB в клетке).

Ранее в опытах in vitro было показано, что ТФEc не проводит рефолдинг мономерной светлячковой люциферазы Photinus pyralis, предварительно обработанной 5 М мочевиной. Отметим, что шаперон DnaKJE, в отличие от ТФEc, проводит эффективный рефолдинг in vitro как термоинактивированной, так и обработанной 5 М мочевиной светлячковой люциферазы (Svetlov et al., 2006; Goloubinoff et al., 1999). Было показано, что ТФEc, повышает эффективность in vitro ренатурации денатурированной в 5 М мочевине глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы, которая в растворе формирует гомотетрамер (Liu et at., 2005; Robin et al., 2009).

В опытах in vitro по определению участия ТФEc в рефолдинге термоинактивированных белков в настоящей работе (результаты получены в соавторстве с Мелькиной О.Е., Светловым М.С.) использовали двухкомпонентную систему (R+L), содержащую очищенную люциферазу P. leiognathi (Рис 10).

Рис. 10. ТФEc - зависимый рефолдинг in vitro бактериальной люциферазы P. leiognathi и светлячковой люциферазы Photinus pyralis как функция времени инкубации (а) и как функция концентрации ТФ (б). Ферментативная активность люциферазы отложена по оси ординат и выражена в процентах от исходного уровня. 1 - Бактериальная люцифераза P. leiognathi + ТФEc (6 мкМ), 2 - светлячковая люцифераза Photinus pyralis + ТФEc (6 мкМ), 3 - бактериальная люцифераза P. leiognathi + БСА. Люциферазу инактивировали, инкубированием 5 мин. при 43°C.

В присутствии ТФEc наблюдается непрерывный процесс увеличения активности фермента, вплоть до 12-14% от исходного уровня через 60 мин инкубации при 23°C. Следовательно, ТФEc активно участвует в процессе восстановления активности (рефолдинге) термоинактивированной гетеродимерной (??) бактериальной люциферазы. Уровень рефолдинга люциферазы с увеличением концентрации ТФEc увеличивается, достигая максимума при 8-кратном молярном избытке ТФEc над люциферазой (рис. 10, б). Однако ТФEc не способствует процессу рефолдинга in vitro термоинактивированной светлячковой люциферазы (рис. 10, а).

Кинетику DnaKJE - зависимого рефолдинга термоинактивированных люцифераз измеряли in vivo в клетках штамма E. coli MG1655 tig::Kanr, содержащих гибридные плазмиды pF2, pLeo1 или pLR. Плазмиды pF2 и pLeo1 содержат гены luxAB, кодирующие ? и ? субъединицы бактериальных люцифераз A. fischeri и P. leiognathi под lac промотором, соответственно. Плазмида pLR содержит ген luc, кодирующий мономерную светлячковую люциферазу L. mingrelica. Измерение кинетики ТФEc - зависимого рефолдинга термоинактивированных бактериальной и светлячковой люцифераз проводили in vivo в клетках штамма E. coli PK202 dnaK14 dnaJ14 dks::Kanr, содержащих плазмиду pTf16 c геном tig, расположенным под araBAD промотором, а также одну из плазмид с генами luxAB (pF2, pLeo1) или с геном luc (pLR).

Рис. 11. DnaKJE - и ТФEc - зависимые процессы рефолдинга термоинактивированных бактериальной и светлячковой люцифераз in vivo. а - DnaKJE - зависимый рефолдинг (E. coli MG1655 tig::kan); б - ТФEc - зависимый рефолдинг (E. coli PK202 dnaKJ14 dks::kan). 1 - A. fischeri, 2 - P. leiognathi, 3 - L. mingrelica.

Как можно видеть из данных, представленных на рис.11, а, шаперон DnaKJE осуществляет примерно с равной и высокой (до 80-90% от исходного уровня) эффективностью рефолдинг как гетеродимерной бактериальной люциферазы, так и мономерной светлячковой люциферазы.

В отсутствие плазмиды pTf16 рефолдинг люцифераз практически не происходит (не более 1% от исходного уровня) (рис. 11, б). В присутствии же плазмиды pTf16 наблюдается значительный рефолдинг бактериальных гетеродимерных люцифераз A. fischeri и P. leiognathi, достигающий 40% и 30% от исходного уровня, соответственно. Однако ТФEc не способен проводить рефолдинг мономерной светлячковой люциферазы.

Так как светлячковая люцифераза имеет эукариотическое происхождение и значительно отличается по аминокислотной последовательности, пространственной структуре и ферментативной реакции от бактериальных люцифераз, то в следующей серии опытов нами были использованы гетеродимерная бактериальная люцифераза Vibrio harveyi (плазмида pKlux с генами luxAB) и специально сконструированная эта же люцифераза, но имеющая форму мономера (плазмида pT7-mut3). Данные по термоинактивации данных люцифераз в клетках E. coli PK202 ДdnaKJ14 dksA::kan показывают, что по термочувствительности две формы люциферазы V. harveyi практически идентичны, также ранее было показано, что они имеют примерно равные уровни биолюминесценциии (Boylan et al., 1989).

Проведение DnaKJE - зависимого рефолдинга термоинактивированных люцифераз in vivo в клетках штамма E. coli MG1655 tig:Kanr, содержащих плазмиды pKlux или pT7-mut3, показало практически идентичные кинетику и уровень рефолдинга этих двух изоформ люциферазы V. harveyi (примерно 40% от исходного уровня) (рис. 12, а). На рис. 12, б представлены кинетические кривые ТФEc - зависимого рефолдинга термоинактивированных изоформ люциферазы V. harveyi.



Рис. 12. DnaKJE - и ТФEc - зависимые процессы рефолдинга термоинактивированных бактериальной гетеродимерной (бв) и мономерной форм люциферазы V. harveyi in vivo. а - DnaKJE - зависимый рефолдинг (E. coli MG1655 tig::kan); б - ТФEc - зависимый рефолдинг (E. coli PK202 dnaKJ14 dks::kan). 1 - pKlux, 2 - pT7-mut3.

Как видим, ТФEc способствует рефолдингу гетеродимерной люциферазы (до 20-25% от исходного уровня), и практически не эффективен в восстановлении активности мономерной формы этого же белка.

Сравнение активности ТФ из мезофильных бактерий E. coli и психрофильных бактерий P. frigidicola.

Кинетику и уровень ТФ - зависимого рефолдинга термоинактивированных люцифераз измеряли в клетках E. coli PK202 dnaKJ14 dksA::kan, содержащих гибридные плазмиды с генами luxAB и с геном tig из мезофильных бактерий E. coli (плазмида pTf16) или из психрофильных бактерий P. frigidicola (плазмида p15aratighisPF). На рис. 13, а представлена зависимость уровня ТФ - рефолдинга термоинактивированной люциферазы A. fischeri от концентрации арабинозы, индуктора промотора araBAD. Плазмиды pTf16 и p15aratighisPF сконструированы на основе вектора pACYC184 и содержат гены tig мезофильных бактерий E. coli и психрофильных бактерий P. frigidicola под контролем промотора araBAD, соответственно.

А. Б.

Рис. 13 Зависимость максимального уровня ТФ - рефолдинга термоинактивированной люциферазы P. leiognathi от концентрации арабинозы, использованной для индукции (“A”): ^ - TФPf; ¦ - TФEc. Рефолдинг термоинактивированной люциферазы P. leiognathi в клетках E. coli PK202 dnaKJ14 dksA::kan (“Б”), экспрессирующих ¦ - TФEc (pLeo1, pTf16); ^ - TФPf (pLeo1, p15aratighisPF); ? - без TФ (контроль (pLeo1).

При наличии в клетках PK202 dnaKJ14 dksA::kan (pF2) плазмиды pTf16 или p15aratighisPF имеет место восстановление активности термоинактивированной люциферазы, достигающее 20-30% от исходного уровня. Однако, наблюдаются значительные различия при сравнении уровней ТФEc - и ТФPf - рефолдинга в зависимости от их внутриклеточной концентрации. В варианте с плазмидой p15aratighisPF с увеличением концентрации арабинозы и, соответственно, внутриклеточной концентрации шаперона ТФPf уровень рефолдинга нарастает с последующим выходом кривой на плато. В варианте же с плазмидой pTf16 с увеличением в среде концентрации индуктора (и, соответственно, концентрации ТФEc в клетке) уровень рефолдинга люциферазы быстро снижается практически до нуля (рис. 13 “A”).

На рис.13 “Б” приведена зависимость степени ренатурации люциферазы A. fischeri от времени инкубации клеток PK202, в которых экспрессируется ТФEc или ТФPf при 23°C.

При наличии в клетках плазмиды pTf16 с геном tig E. coli, кодирующим ТФEc (клетки E. coli PK202 (pTf16, pF2), росли при 28°C до середины экспоненциальной фазы без арабинозы), наблюдается эффективный рефолдинг, достигающий в течение 120 мин. инкубации 25% от исходного уровня. Кинетическая кривая рефолдинга той же люциферазы, проводимого ТФPf, получены при условии роста клеток E. coli PK202 (p15aratighisPF, pF2) при 28°C до середины экспоненциальной фазы в присутствии 50 mM арабинозы). Как видим, кинетические кривые ТФEc - и ТФPf - зависимого рефолдинга практически не различаются как по скорости, так и по максимальному уровню рефолдинга.

Ранее было показано, что при суперпродукции ТФEc оказывает летальное действие на бактериальную клетку (Guthrie and Wickner, 1990; Genevaux et al., 2004). На рис. 14 представлены кривые роста бактерий E. coli PK202, содержащих плазмиды p15aratighisPF или pTf16, в зависимости от содержания арабинозы в среде.

Рис. 14. Кривая роста клеток штамма E. coli PK202 dnaKJ14, содержащих плазмиды, кодирующие TФEc или TФPf в присутствии или отсутствии L-арабинозы в среде LB при 30°C.

E. coli PK202 без плазмиды: _ - без L-арабинозы; ? - 50 мМ L-арабиноза.

E. coli PK202 pTF16: ? - TФEc, без L-арабиозы; ¦ - TФEc, 50 мМ L-арабиноза.

E. coli PK202 p15aratighisPF: Ѓў - TФPf, без L-арабиозы; ^ - TФPf, 50 мМ L-арабиноза.

Как видим, в присутствии 50 mM арабинозы наблюдается практически полное ингибирование роста бактерий с плазмидой pTf16, кодирующей ТФEc, в то время как рост бактерий с плазмидой p15aratighisPF, кодирующей ТФPf, от концентрации арабинозы не зависит. ТФEc в растворе формирует гомодимер, а ТФPf остается мономерным при любой концентрации (Robin et al., 2009). Следовательно, можно придти к выводу, что именно димерная форма ТФ определяет как снижение шаперонной активности, так и токсическое действие на клетку, проявляющиеся у ТФEc при высоких концентрациях.

На рис. 15 приведены кинетические кривые ТФEc - зависимой ренатурации люцифераз, различающихся по термостабильности. Опыты проводили в штамме PK202, содержащем плазмиду p15aratighisPF совместно с одной из ниже перечисленных плазмид с генами luxAB, кодирующими люциферазы с различной термочувствительностью, pPho1 (P. phosphoreum), pF2 (A. fischeri), pLeo1 (P. leiognathi), pKLux (V. harveyi), pXen4 (P. luminescens).



Рис. 15. TFPf - зависимый рефолдинг термоинактивированных люцифераз в клетках E. coli PK202 (p15aratighisPF), содержащих одну из серии плазмид, кодирующих люциферазы различной термочувствительности: ? - P. phosphoreum (pPho1); ¦ - P. leiognathi (pLeo1); Ѓџ - V. harveyi (pKlux); ^ - P. luminescens (pXen4).

Как видно, для шаперонной активности ТФPf характерна аналогичная закономерность, что и в случае ТФEc, т.е. с повышением термостабильности люциферазы уровень рефолдинга снижается, причем в варианте с наиболее термолабильной люциферазой P. phosphoreum уровень ТФPf - рефолдинга достигает 40-50%, а с наиболее термостабильной люциферазой P. luminescens снижается примерно до 1%.

Для определения влияния четвертичной структуры белка-субстрата на способность ТФPf проводить рефолдинг нами были использованы гетеродимерная бактериальная люцифераза V. harveyi (плазмида pKlux с генами luxAB) и специально сконструированная эта же люцифераза, но имеющая форму мономера (плазмида pT7-mut3).

На рис. 16 представлены кинетические кривые ТФPf - зависимого рефолдинга термоинактивированных изоформ люциферазы V. harveyi. Как видим, как ТФEc (формирующий в растворе димер) (рис 12, б), так и ТФPf (в растворе находится исключительно в форме мономера) способствуют рефолдингу лишь гетеродимерной формы люциферазы (до 15-20% от исходного уровня), и практически не эффективны в восстановлении активности мономерной формы этого же белка. L-арабиноза была добавлена к клеткам E. coli PK202 dnaKJ14 dksA::kan (pKlux/pТ7-mut3, p15aratighisPF) в конечной концентрации 50 мМ.

Рис. 16. TFPf - зависимый рефолдинг термоинактивированной бактериальной гетеродимерной (??) и мономерной форм люциферазы V. harveyi, проводимый в клетках E. coli PK202. ¦ - TFPf - зависимый рефолдинг гетеродимерной формы люциферазы V. harveyi; ?- TFPf - зависимый рефолдинг мономерной формы люциферазы V. harveyi.

Шаперонная активность ТФEc увеличивается при отсутствии в клетках E. coli белка ClpB. (рис. 9). Как видно из данных, представленных на рис. 17, подобная особенность характерна и для ТФPf.



Рис. 17. Влияние шаперона ClpB на TFPf - зависимый рефолдинг термоинактивированной люциферазы P. leiognathi. Ромбы - клетки E. coli SG20250 dnaKJ+clpB+ (pLeo1); треугольники - клетки E. coli SG22100 dnaKJ+clpB::kan (pLeo1). Светлые символы - клетки без плазмиды p15aratighisPF, темные символы - клетки содержат плазмиду p15aratighisPF

Измерение кинетики и уровня рефолдинга термоинактивированной люциферазы P. leiognathi в клетках E coli SG22100, мутантных по гену clpB, показывает, что максимальный уровень ТФPf - зависимого рефолдинга составляет 40%, в то время как в штамме E. coli SG20250 clpB+ максимальный уровень рефолдинга не превышает 15%.

В штамме PK202 dnaKJ14 dksA::kan, в хромосоме которого содержится активный ген tig, уровень ТФ - зависимого рефолдинга термоинактивированной люциферазы A. fischeri составляет примерно 0,5-1,0% , что указывает на неспособность внутриклеточного ТФ вести эффективный рефолдинг. По-видимому, количества молекул ТФ, образующихся в норме в процессе синтеза, недостаточно, чтобы способствовать эффективному рефолдингу, так как большая часть ТФ формирует комплексы с рибосомами. При введении в клетку плазмиды с геном tig количество ТФ увеличивается, одновременно увеличивается и эффективность рефолдинга. Однако, что является характерным именно для ТФЕс, при последующим увеличении внутриклеточной концентрации ТФEc имеет место значительное снижение уровня рефолдинга, что принципиально отличает шаперон ТФEc от шаперонов системы DnaKJE (при увеличении концентрации DnaKJE уровень рефолдинга достигает плато, и при дальнейшем увеличении концентрации не снижается (Tomoyasu et al., 1998). Необходимо отметить, что увеличение концентрации ТФEc в клетках E. coli примерно в четыре раза приводит к снижению их жизнеспособности и даже к гибели (Genevaux et al., 2004). Согласно представленным данным увеличение концентрации ТФEc в клетках штамма PK202 dnaKJ14 dksA::kan сопровождается потерей жизнеспособности клеток одновременно с ослаблением рефолдинга. Можно предположить, что эти эффекты определяются особенностями четвертичной структуры ТФEc. При небольших концентрациях ТФEc в цитоплазме находится в форме мономера и проявляет активность в качестве шаперона, т.е. формирует комплекс с денатурированным белком, а затем высвобождает этот белок в нативной форме. При повышении концентрации ТФEc образует димерную форму. В результате белки, связанные с ТФEc, не способны высвободиться из комплекса, что приводит к снижению эффективности рефолдинга. Если же в этих условиях с ТФEc формируют комплексы белки, участвующие в процессе деления клетки, то имеет место ингибирование роста клеток. Было показано, что при высокой концентрации ТФEc формирует комплекс с ключевым белком клеточного деления FtsZ (Genevaux et al., 2004). Проведенный в настоящей работе анализ шаперонной активности ТФPf, который в растворе содержится исключительно в форме мономера, показал отсутствие снижения эффективности рефолдинга с увеличением его внутриклеточной концентрации. Кроме того, с увеличением внутриклеточной концентрации ТФPf отсутствует и летальный эффект, характерный для ТФEc. Следовательно, можно придти к выводу, что именно димерная форма ТФ определяет его токсическое действие на клетку, имеющее место при высокой концентрации. Необходимо отметить, что по другим параметрам: 1) неспособность проводить рефолдинг мономерной формы люциферазы, 2) снижение эффективности рефолдинга при увеличении термостабильности белка-субстрата, 3) повышение эффективности рефолдинга в мутантном штамме E. coli clpB- ТФEc из мезофильных бактерий E. coli и ТФPf из психрофильных бактерий P. frigidicola практически не различаются.

Рис.18. Схематическое представление участия ТФ в сборке белков в цитоплазме бактерии E. coli.

Как видно из схемы (рис 18), ТФ находится или в свободном состояния, или в комплексе с 50S субъединицей рибосомы. Синтезируемый белок формирует нативную форму или спонтанно (и затем с помощью шаперона DnaKJE и щаперонина GroELS), или с помощью ТФ. Свободный ТФ формирует комплексы с нативными белками в цитоплазме, предпочитая олигомерные формы белков и тем самым участвуя в сборке новых рибосом в клетке.

В бактериях E. coli процессы дезагрегации и рефолдинга белков связаны с активностью АТФ-зависимой бишаперонной системы DnaKJE-ClpB. Шаперон ClpB не участвует непосредственно в рефолдинге субстрата, он лишь способствует дезагрегации белков, особенно эта помощь эффективна при дезагрегации крупных агрегатов, которые система DnaKJE самостоятельно не способна разрушить (Завильгельскийи др., 2004). Как следует из представленных данных, действие шаперона ClpB на систему DnaKJE и на шаперон ТФ противоположно. Если присутствие ClpB в клетке значительно увеличивает эффективность рефолдинга DnaKJE системы, то ТФ-рефолдинг снижается. Можно предположить, что шаперон ClpB конкурирует с ТФ за связь с субстратом, в отличие от шаперона DnaKJE, который действует в клетке в комплексе с шапероном ClpB (бишаперонная система DnaKJE-ClpB) (Goloubinoff et al., 1999).

...