Шапероны Hsp60, Hsp70, Hsp100, Триггер Фактор и

Термическая инактивация как бактериальных, так и светлячковой люцифераз ведет к открытой экспозиции гидрофобных эпитопов, с которыми специфически контактируют шапероны типа DnaKJE, что и определяет эффективный рефолдинг этих белков (Rudiger et al., 1997; Manukhov et al., 1999; Hesterkamp and Bukau, 1998). Неспособность или очень низкая эффективность рефолдинга, характерная для ТФ при использовании в качестве субстрата мономерных форм люцифераз, указывает на дополнительную и, по-видимому, важную роль пространственной, а точнее, четвертичной структуры белка-субстрата для успешного контакта с ТФ. Это предположение находит подтверждение в данных, представленных в работе (Martinez-Hackert and Hendrickson, 2009), в которой показано, что в цитоплазме бактерий ТФ находится в комплексе с различными олигомерными белками и способствует стабилизации белков в димерной и олигомерной форме. Отметим также, что, как недавно было показано, ТФ не способствует фолдингу светлячковой люциферазы при ее синтезе (Hoffman et al., 2012).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Анализ биолюминесцентных характеристик lux-оперонов мезофильных и психрофильных бактерий в гетерологичной системе показал, что штаммы E. coli с мутацией в гене, кодирующем шаперонины GroEL\GroES, характеризовались сниженным уровнем люминесценции по сравнению со штаммами дикого типа, и, наоборот, мутация по гену, кодирующему протеазу Lon, приводила к повышенному уровню биолюминесценции. Однако, несмотря на сходство в модуляции активности QS систем психрофильных A. logei и мезофильных A. fischeri бактерий шаперонинами семейства Hsp60 и протеазой Lon, оказалось, что имеются существенные различия, связанные с наличием двух копий регуляторного гена luxR у психрофильных бактерий. В частности показано, что шаперонины GroEL\GroES и протеаза Lon не участвуют в модуляции активности белка LuxR1 из психрофильных бактерий A. logei, в то же время, участвуют в контроле количеста и качества активных форм белка LuxR2. Белок LuxR из мезофильных бактерий A. fischeri также подвержен влиянию шаперонинов GroEL\GroES и протеазы Lon. В обоих случаях наблюдается эффект преодоления мутации за счет добавления АИ в больших концентрациях - увеличивается стабильность активаторов транскрипции. Однако в случае белка LuxR2 этот эффект преодолевается не полностью. По-видимому, белок LuxR2 из психрофильных бактерий A. logei менее стабилен, чем LuxR из мезофильных бактерий A. fischeri и, не успевая связаться с АИ, деградирует быстрее или, уже связав АИ и образовав димерную форму, сильнее подвержен инактивации. Влияние шаперонинов GroEL\GroES и протеазы Lon на экспрессию lux-оперона A. logei связано с тем, что основную роль в активации экспрессии играет LuxR2, а LuxR1 менее чувствителен к небольшим концентрациям АИ. На основе полученных данных можно сделать предположение, что LuxR1 необходим для активации генов lux-оперона в сложных стрессовых условиях, при которых LuxR2 не активен. Следует, однако, отметить, что в этом случае активация экспрессии генов lux-оперона возможна лишь при высоких концентрациях АИ (10-5 - 10-6 М).

Исследование влияния шаперонов на активность структурных генов lux-оперона. Структурные гены lux-оперона, кодирующие люциферазу из психрофильных бактерий A. logei гомологичны генам luxAB мезофильных бактерий A. fischeri, а кодируемая этими генами люцифераза примерно равна по термостабильности люциферазе мезофильных бактерий A. fischeri. Однако люцифераза A. logei имеет значительно сниженный по сравнению с люциферазой A. fischeri уровень DnaKJE - зависимого рефолдинга. Поэтому при термоденатурации психрофильных люцифераз in vivo (в штаммах E. coli dnaKJE+) интенсивность биолюминесценции клеток спадает быстрее, чем при термоденатурации мезофильных люцифераз.

Рефолдинг термоинактивированных люцифераз проводимый ТФ мезофильных и психрофильных бактерий характеризуется примерно равными параметрами: скоростью реакции и максимальным уровнем рефолдинга. Однако по этим характеристикам ТФ - рефолдинг значительно уступает DnaKJE - рефолдингу. При увеличении концентрации психрофильного ТФPf уровень рефолдинга термоинактивированных люцифераз увеличивается с выходом на плато. Напротив, повышение концентрации мезофильного ТФEc приводит к резкому спаду максимального уровня рефолдинга, а появление в клетках мутантных по шаперонам Hsp70 (E. coli ДdnaKJ) большого количества ТФEc приводит к сильному снижению их жизнеспособности. Показано, что эффективность ТФEc - и ТФPf - зависимого рефолдинга снижается при увеличении термостабильности используемой в качестве субстрата люциферазы. Этот результат согласуется с полученными ранее данными об эффективности DnaKJ - зависимого рефолдинга, и объясняется тем, что, по-видимому, у более термостабильных белков более высокая способность образовывать необратимые агрегаты.

Отсутствие в клетках шаперона ClpB (Hsp100) повышает уровень рефолдинга проводимого как мезофильным так и психрофильным ТФ, в отличие от системы DnaKJE, которой шаперон ClpB помогает проводить рефолдинг (бишаперонная система DnaKJE-ClpB).

Показано, что ТФEc и ТФPf проводят рефолдинг только гетеродимерных люцифераз. ТФEc и ТФPf не способны рефолдировать термоинактивированные мономерные формы: светлячковую и специально сконструированную, слитую из двух субъединиц, бактериальную люциферазу V. harveyi. Шаперон DnaKJЕ проводит рефолдинг как мономерной, так и димерной форм люцифераз с равной эффективностью.

Полученные данные о работе системы клеточных шаперонов суммированы на рис. 40.

Рис. 40. Схема участия шаперонов бактериальной клетки АТФ - зависимых: DnaKJE, GroELS, ClpB, HptG - и АТФ - независимых: ТФ и IbpAB - в фолдинге, рефолдинге и дезагрегации белков. 1 - вновь синтезированные полипептидные цепи взаимодействуют с ТФ, освобождаясь из рибосомального туннеля, остаются несвернутыми; 2 - часть подобных полипептидных цепей не требует участия шаперонов для спонтанного сворачивания в нативную конформацию; 3 - часть белков формируют нативную форму при участии шаперона Hsp70 (DnaK), с кофактором Hsp40 (DnaJ) и фактором нуклеотидного обмена Hsp10 (GrpE); 4 - спонтанное образование частично свернутой конформации; 5 - связывание с DnaKJE и переход в нативную форму; 6 - связь с ТФ для повторения цикла фолдинга, до тех пор пока нативное состояние не будет достигнуто; 7 - взаимодействие с GroEL\ES для проведения полного фолдинга белка до нативной конформации; 8 - под воздействием теплового стресса происходит частичное разворачивание термолабильных белков, вызывающее экспозицию подверженных агрегации гидрофобных эпитопов; 9 - частично свернутый белок может агрегировать, при этом sHsp (IbpA, IbpB) действуют как «удерживатели» частично развернутых белков и перемещаются к шаперонам Hsp70 и Hsp60; 10 - дезагрегацию развернутых и агрегированных белков проводит Hsp100 (ClpB), действуя совместно с Hsp70.

Рекомендации и перспективы дальнейшего исследования. В дальнейшем предполагается, используя полученные биосенсорные штаммы с люциферазой в качестве репортёра, провести поиск наиболее активных вариантов ТФ. Планируется проведение исследований активности ТФ из A.logei и других психрофильных микроорганизмов. Полученные в диссертационной работе штаммы с высоким уровнем продукции ТФ планируется использовать для исследования способности ТФ к дезагрегации амилоидоподобных надмолекулярных структур.

Проведенное в диссертационной работе исследование о влиянии шаперонов и протеаз на активность активаторов транскрипции систем QS (белки LuxR, LuxR1 и LuxR2) предполагается использовать для конструирования высокочувствительных к АИ lux-биосенсоров.

Перспективным представляется изучение механизмов рефолдинга денатурированных белков с применением разнообразных моделей биосенсорных штаммов, разработанных в ходе выполнения диссертационной работы.

Выводы

1. Шаперонины GroEL\GroES и протеаза Lon не участвуют в модуляции активности белка LuxR1 из психрофильных бактерий A. logei.

2. Шаперонины GroELS и протеаза Lon участвуют в контроле количеста и качества активных форм как белков LuxR2 из психрофильных бактерий A. logei, так и LuxR из мезофильных бактерий A. fischeri. В обоих случаях наблюдается эффект добавления АИ в большой концентрации: увеличивается стабильность активаторов транскрипции (LuxR, LuxR2), и снижается эффект отсутствия шаперонина GroEL\GroES или присутствия протеазы Lon, однако в случае белка LuxR2 этот эффект не компенсируется полностью.

3. Люцифераза из психрофильной бактерии A. logei по термостабильности идентична люциферазе мезофильных бактерий A. fischeri. Однако люцифераза A. logei характеризуется сниженным, по сравнению с люциферазой A. fischeri, уровнем DnaKJE - зависимого рефолдинга.

4. Процессы восстановления нативной структуры (рефолдинг) термоинактивированных люцифераз с участием ТФ из мезофильных и психрофильных бактерий как по скорости реакции, так и по максимальному уровню рефолдинга практически идентичны. DnaKJE -рефолдинг термоинактивированных люцифераз осуществляется со значительно более высокой скоростью и достигает существенно более высокого уровня (до 90% от начального уровня).

5. С увеличением концентрации психрофильного ТФ (ТФPf) максимальный уровень рефолдинга термоинактивированных люцифераз вырастает и достигает плато. Повышение же концентрации мезофильного ТФ (ТФEc) приводит к резкому спаду максимального уровня рефолдинга.

6. В клетках E. coli с мутацией ДdnaKJ появление большого количества ТФEc приводит к снижению их жизнеспособности.

7. Эффективность ТФEc -и ТФPf - зависимого рефолдинга термоинактивированных люцифераз снижается при увеличении термостабильности используемой в качестве субстрата люциферазы.

8. Отсутствие в клетках шаперона ClpB (Hsp100) повышает уровень рефолдинга, проводимого как мезофильным, так и психрофильным ТФ, в отличие от системы DnaKJE, которая формирует с шапероном ClpB эффективную бишаперонную систему.

9. ТФ как из мезофильных бактерий E. coli так и из психрофильных бактерий P. frigidicola не проводит рефолдинг мономерных форм люцифераз.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Ilya V. Manukhov, Ol'ga E. Melkina, Ignatii I. Goryanin, Ancha V. Baranova, and Gennadii B. Zavilgelsky. The N-terminal domain of the Aliivibrio fischeri LuxR is a target of the GroEL chaperonin. // Journal of Bacteriology. - 2010. - V. 192. - № 20. - P. 5549-5551.

2. О. Е. Мелькина, И. И. Горянин, И. В. Манухов, Г. Б. Завильгельский. Триггер Фактор зависимый рефолдинг бактериальных люцифераз в клетках Escherichia coli: кинетика и эффективность рефолдинга, влияние бишаперонной системы DnaKJE-ClpB // Молекулярная Биология. - 2013.- Т. 47. - № 3. - С. 492-497

3. Мелькина О.Е., Горянин И.И., Манухов И.В., Баранова А.В., Колб В.А., Светлов М.С., Завильгельский Г.Б. Триггер Фактор осуществляет рефолдинг гетеродимерных, но не мономерных люцифераз // Биохимия. - 2014. - Т. 79. - № 1. - С. 79-86.

4. Мелькина О. Е., Горянин И.И. GroEL шаперон необходим для фолдинга N-концевого домена LuxR - активатора транскрипции lux-оперона Vibrio fischeri. // Материалы V съезда Вавиловского общества генетиков и селекционеров. - Москва. - 2009. - С. 71.

5. Горянин И.И., Мелькина О.Е., Манухов И.В., Завильгельский Г.Б. Сравнительный анализ активности Триггер Фактора из мезофильных и психрофильных бактерий в процессе ренатурации люцифераз. // VI Съезд ВОГиС и ассоциированные генетические симпозиумы. - Новосибирск - 2014. - С. 45.

6. Хрульнова С.А., Марышев И.В., Манухов И.В., Горянин И.И., Васильева А., Салихова А., Завильгельский Г.Б. Механизмы Quorum Sensing у психрофильных бактерий Aliivibrio logei: сравнительный анализ активности белков-регуляторов LuxR1 и LuxR2. // VI Съезд ВОГиС и ассоциированные генетические симпозиумы. - Новосибирск. - 2014. - С. 178.

Размещено на Allbest.ru