В производстве творога на конечное содержание кишечной палочки в продукте оказывали влияние также санитарно-гигиенические условия его выработки, длительность процессов сквашивания.

Т.С. Суховой (1974) установлено также изменение культурально-биохимических свойств бактерий группы кишечной палочки под влиянием совместного развития с мезофильными молочнокислыми стрептококками. В этом отношении наиболее лабильными были цитратоположительные палочки (Gitrob. freundii), у которых менялись такие свойства, как способность продуцировать ацетилкарбинол и сероводород Н₂S, характер реакции с метиловым красным, способность использовать цитрат.

При производстве кефира отмечалась обратная закономерность в изменении содержания кишечных палочек: в отдельных случаях небольшое количество их можно обнаружить в молоке в момент заквашивания, а из готового продукта их уже не удается выделить. По наблюдениям В.И. Букановой (1952, 1955) такую резкую разницу в характере развития кишечной палочки при производстве кефира можно отчасти объяснить бактерицидными свойствами отдельных образцов кефира по отношению к кишечной палочке. В этих образцах кефира всегда обнаруживались дрожжи типа Torulopsis kefir, сбраживающие лактозу. В тех же образцах кефира, в которых дрожжей не было, кишечная палочка выявлялась в больших количествах.

Представляют интерес данные, полученные А.К. Максимовой и Э.Е. Грудзинской (1969), о подавляющем действии на бактерии группы кишечной палочки уксуснокислых бактерий, выделенных из кефирных грибков. Возможно, что уксуснокислые бактерии также влияют на конечный результат, связанный с антибиотическим действием кефира на кишечные палочки. Эти наблюдения позволяют сделать вывод о том, что в зависимости от условий производства количество бактерий группы кишечной палочки в кисломолочных продуктах может как резко уменьшаться, так и значительно увеличиваться.

ВЗАИМООТНОШЕНИЯ МЕЖДУ МОЛОЧНОКИСЛЫМИ БАКТЕРИЯМИ И ПЛЕСЕНЯМИ

Взаимоотношения, складывающиеся между молочнокислыми бактериями и плесенями (Oidium lactis), носят примерно такой же характер, как и взаимоотношения между молочнокислыми бактериями и дрожжами. Плесени предпочитают для своего развития низкие значения рН среды, что создается в результате жизнедеятельности молочнокислых бактерий. В то же время присутствие плесеней, вызывающих протеолиз белков молока и повышение рН, благоприятно действует на молочнокислые бактерии и продлевает их жизнеспособность при совместном длительном культивировании с этими микроорганизмами. М. Антила, В. Антила и Ж. Каукка (1966), добавляя к закваске для финского кислого молока молочную плесень и дрожжи Candida pseudotropicalis, добились улучшения вкуса, уменьшения отделения сыворотки и повышения количества летучих кислот в готовом продукте.

Лекция 4. Первичная микрофлора кисломолочных продуктов

Закваска - основная и наиболее важная часть первичной микрофлоры кисломолочных продуктов. С внесением её молоко обогащается микроорганизмами в 10-100 раз, поэтому микробиология заквасок является одним из важнейших разделов микробиологии этих кисломолочных продуктов. От качества заквасок в значительной мере зависят весь ход процесса выработки кисломолочных продуктов и качество их.

Количество компонентов, входящих в состав микрофлоры заквасок.

В мировой практике существуют две основные тенденции установления количества компонентов, входящих в состав заквасок: составление заквасок из одного штамма и из нескольких штаммов. В СССР и в странах Западной Европы почти с самого начала применения заквасок был установлен принцип составления заквасок из двух или более штаммов - многоштаммовых. Применяя этот принцип, можно создать закваску более разностороннего качества путем введения штаммов, повышающих активность, улучшающих аромат, консистенцию продукта. Кроме того, использование нескольких штаммов одного вида должно способствовать большей устойчивости закваски к неблагоприятным условиям: если под влиянием их один-два штамма утратят свою активность, сквашивание будет осуществлено остальными штаммами. В настоящее время многоштаммовые закваски применяют при производстве сыра и масла в Англии, ФРГ и других европейских странах. При производстве йогурта применяют обычно двухштаммовые закваски. В РФ многоштаммовые закваски используют для выработки сыра, масла и кисломолочных продуктов. Применение таких заквасок затрудняется сложностью их подбора с учетом взаимоотношений и возможным изменением первоначального состава микрофлоры при их пересадках в производственных условиях.

Одноштаммовые закваски до последнего времени широко применяли в Австралии и Новой Зеландии при производстве масла и сыра (X, Уайтхед и Г. Кокс, 1933, 1935). Преимущество этого принципа состоит в том, что штаммы могут быть тщательно изучены, подобраны к условиям производства и при подборе заквасок не требуется вносить корректировки на возможные изменения в метаболизме бактерий при совместном культивировании. Однако такие закваски имеют существенные недостатки:

невозможно сочетать в одной культуре свойства активных кислото- и ароматообразователей;

в случае поражения такой закваски бактериофагом происходит быстрый и полный лизис культуры, что приводит к прекращению производственного процесса.

Последнее обстоятельство заставило разработать ряд мероприятии по предотвращению развития бактериофага при данном методе. За последние годы наметилось сближение этих двух направлений - подбор заквасок из двух, максимально трех штаммов, тщательно проверенных по всем своим свойствам и способности к совместному развитию в промышленных условиях

Специфические свойства продукта. При подборе культур следует учитывать специфические свойства, которые желательно получить у готового продукта. Например, составляя закваски для творога, необходимо учесть, что микроорганизмы закваски должны активно повышать кислотность в начале цикла производства, но способность их к дальнейшему кислотообразованию должна быть ограничена. Таким требованиям удовлетворяют молочнокислые стрептококки. Однако из молочнокислых стрептококков нужно выбрать культуры, которые обладали бы хорошим вкусом и ароматом. Поэтому целесообразно наряду с культурами Str. lactis вводить Str. acetiinicus или Str. diacetilactis. Для продуктов, в процессе производства которых предусмотрено отделение части сыворотки от сгустка (творог и пр.), подбирают культуры, образующие сгустки, легко отделяющие сыворотку. Для продуктов, в производстве которых нужно предотвратить отделение сыворотки, рекомендуется подбирать культуры, дающие при свертывании молока сгустки сметанообразной консистенции.

С целью получения продуктов с лечебными свойствами в состав закваски вводят ацидофильные бактерии, специально подобранные дрожжи и т.д. Подобным же образом учитывают свойства культур и при подборе заквасок для других кисломолочных продуктов. На необходимость подбора культур с учетом специфических свойств продуктов указывает также М. Тепли (1972).

Температурные режимы производства. При подборе культуры следует учитывать температурные режимы того или иного технологического процесса. Если процесс осуществляется при 20-30° С, то в закваске должны преобладать мезофильные микроорганизмы, но при необходимости можно вводить и термофильные; при температурах 40-45° С нужно выбирать термофильные виды.

Взаимоотношения между культурами. При подборе заквасок в специальных лабораториях устанавливают их сочетаемость. Для этого выделенные штаммы мезофильных молочнокислых стрептококков проверяют в первую очередь на наличие среди них антагонистов. Этот метод был разработан Т.Г. Романович (1954), в дальнейшем он был развит и усовершенствован Л.А. Банниковой с сотр. (1966). Сущность метода, разработанного Л.А. Банниковой, заключается в том, что прогретые фильтраты культуральной жидкости одного штамма (по 1 мл) вносят в 10 мл стерильного обезжиренного молока с метиленовым голубым. По разнице в скорости восстановления другим штаммом метиленового голубого в молоке с фильтратом и без фильтрата выявляют наличие антагонистического действия. При отсутствии антагонистического действия разницы в скорости восстановления не наблюдается.

В дальнейшем в соответствии с методом, разработанным Л.А. Банниковой, из отобранных культур, преобладающих в данной закваске, составляют основы, проводят их органолептическую оценку и устанавливают энергию кислотообразования. Она не должна быть ниже энергии кислотообразования самого активного штамма из входящих в основу. Затем к основе добавляют культуры стрептококков - ароматообразователей, снова проводят органолептическую оценку и устанавливают наличие аромата. Удачно подобранные закваски могут в течение ряда лет сохранять свои первоначальные свойства. Сочетаемость культур термофильных молочнокислых стрептококков и болгарской палочки выявляют путем ежедневных пересевов составленных комбинаций в течение 15 дней (Н.М. Николов, 1966, Е.В. Мельникова, 1973). Если после такого длительного культивирования в закваске сохраняются оба вида микроорганизмов, считают, что между ними сложились симбиотические взаимоотношения. На производстве поведение микроорганизмов заквасок во многом зависит от микрофлоры, содержащейся в пастеризованных молоке или сливках. В свою очередь и микробы закваски могут сильно влиять на развитие посторонней микрофлоры незаквасочного происхождения. Следовательно, изучение взаимоотношений между микрофлорой заквасок и микрофлорой пастеризованного молока представляет исключительный практический интерес, так как результаты его можно использовать при подборе культур для заквасок, а также для выбора оптимального количества вносимой закваски. Проведенные исследования показали, что при применении закваски, состоящей из Str. lactis, в молоке накапливаются продукты их обмена в концентрациях, стимулирующих развитие термоустойчивых молочнокислых палочек. В таких случаях целесообразно снижать количество вносимой закваски с 5 до 2-3%. Г. Паткуль и М. Бутакова (1965) отметили, что подбор заквасок по их способности подавлять постороннюю микрофлору позволяет повысить их стойкость в производственных условиях. Впоследствии И.В. Цареградская установила возможность подбора заквасок, состоящих из антагонистов по отношению к термоустойчивым палочкам. В настоящее время подбор микрофлоры заквасок по признаку подавления термоустойчивой молочнокислой палочки введен как обязательный в практику работы специальных лабораторий. Не менее важна и способность молочнокислых бактерий противостоять влиянию на них посторонней микрофлоры. В связи с этим Г.М. Паткуль (1968) предложила проверять молочнокислые бактерии на их устойчивость к фенолу - продукту метаболизма некоторых посторонних бактерий молока. В дальнейшем И.В. Цареградская, Л.А. Банникова, установили, что, если культуры подобраны по энергии кислотообразования, сочетаемости, стойкости при пересадках, они как правило, устойчивы к фенолу в используемых дозах.

Изменчивость молочнокислых бактерий в процессе их культивирования. При культивировании молочнокислые стрептококки быстро утрачивают первоначальную активность, поэтому в лабораториях обычно проводят большую работу по их проверке и отбору наиболее стойких культур для пополнения коллекций.

Еще С.А. Королев (1932 г.) отмечал, что среди многих сотен культур молочнокислых стрептококков, находившихся под его наблюдением в течение 10 лет, ему встретились лишь несколько штаммов, не изменявших быстро своих свойств. Он считал, что на подборе таких стойких культур должна базироваться работа по составлению заквасок, хотя не исключал возможности применения наряду с ними и свежевыделенных, не проверенных на стойкость заквасок. Однако это указание часто не учитывалось микробиологами; во многих лабораториях до сих пор продолжают выделять свежие штаммы и составлять на их основе закваски, которые быстро теряют свои первоначальные свойства. Л.А. Банниковой и С.Б. Задояна (1974) проведена работа, которая позволила в значительной мере объяснить факты быстрой утраты свежевыделенными культурами своих первоначальных свойств пассажной изменчивостью этих микроорганизмов.

Культуру высевают на плотную питательную среду и выделяют в чашки 100 колоний. Все колонии проверяют на энергию кислотообразования. Если на протяжении года (особенно весной) у большинства культур, выделенных из колоний, установлена близкая по величине и значительная энергия кислотообразования, считают, что культура обладает компактной популяцией и сохранит свои свойства при пассировании. Если же среди выделенных из колоний культур обнаруживается много культур с разной энергией кислотообразования, считают, что в исследуемой культуре большой разброс клеток по данному признаку и она может быстро утратить активность в процессе пересевов.

Проведенная работа показала также возможность направленного отбора культур для заквасок и целесообразность использования немногих хорошо изученных штаммов. Путем поддерживающего отбора (выделения наиболее активных культур после рассева) можно сохранять ценные культуры молочнокислых бактерий на протяжении длительного времени.

МИКРОФЛОРА ЗАКВАСОК ДЛЯ КИСЛОМОЛОЧНЫХ ПРОДУКТОВ

В закваски для творога входят чистые культуры мезофильных молочнокислых стрептококков (Str. lactis, Str. cremoris, Str. acetoinicus). Подбирают культуры, сквашивающие молоко с образованием сгустка колющейся консистенции, хорошо выделяющего сыворотку. При производстве сметаны применяют закваски, состоящие из культур Str. lactis, Str. cremoris, Str. diacetilactis или Str. acetoinicus, образующих при сквашивании молока сгустки сметанообразной консистенции, а при производстве любительской сметаны закваску мезофильных и термофильных стрептококков, которую вносят в равных количествах.

Для приготовления простокваши обыкновенной используют закваску мезофильных молочнокислых стрептококков (Str. lactis, Str. acetoinicus) с добавлением или без добавления культур болгарской палочки; для простокваши мечниковской и южной, йогурта, напитков "Южный" и "Снежок” - культуры болгарской палочки и термофильных стрептококков или симбиотическую закваску, состоящую из этих микроорганизмов.

Для украинской простокваши (ряженки) и варенца применяют закваску термофильных молочнокислых стрептококков. При недостаточно выраженной кислотности готового продукта в закваску дополнительно можно вводить культуры болгарской палочки или применять симбиотическую закваску.

При производстве ацидофилина используют культуры мезофильных молочнокислых стрептококков, ацидофильной палочки и кефирной закваски в равных количествах. Закваска ацидофильных палочек состоит из слизистых (10-20%) и неслизистых (80-90%) культур. В зависимости от местных условий эти соотношения можно изменять. Для ацидофильной простокваши применяют чистые культуры мезофильных молочнокислых стрептококков и ацидофильной палочки.

При выработке ацидофильного молока и ацидофильной пасты в качестве закваски применяют чистые культуры ацидофильной палочки (в том числе до 20% слизистых культур к общему количеству закваски), а при производстве ацидофильно-дрожжевого молока в качестве закваски используют ацидофильную палочку и дрожжи, сбраживающие лактозу и обладающие антибиотическими свойствами. При производстве кумыса из кобыльего молока используют чистые культуры болгарской и ацидофильной палочек и дрожжи, сбраживающие и не сбраживающие лактозу. Те же культуры применяют и для кумыса из коровьего молока. Закваска для диетической простокваши состоит из культур ацидофильной палочки и молочнокислых стрептококков кишечного происхождения.

СОХРАНЕНИЕ АКТИВНОСТИ ЗАКВАСОК В ЛАБОРАТОРНЫХ УСЛОВИЯХ

Методы сохранения молочнокислых культур основаны на снижении скорости обмена веществ организмами и отделении клеток от продуктов их обмена. Обмен веществ микроорганизмов подавляется при снижении температуры или удалении влаги. При использовании этих методов для улучшения сохранения культур добавляют лактозу, сухое молоко и пр. Неблагоприятное действие кислоты снижают, добавляя буфер, например мел, и другие соединения. Клетки от продуктов обмена отделяют центрифугированием и в дальнейшем их помещают в питательную среду, содержащую защитные вещества. Практически методы, основанные на этих двух принципах, комбинируют. Например, после выращивания клетки отделяют от культуральной среды, распределяют их в новой среде и затем высушивают. В настоящее время чистые культуры и закваски молочнокислых бактерий сохраняют в жидком, высушенном и замороженном состоянии.

Жидкие культуры и закваски. Одним из наиболее старых способов сохранения чистых культур молочнокислых бактерий является поддержание их жизнеспособности путем периодических пересевов в стерильном молоке или других питательных средах. После внесения культуры в молоко (в пробирках) его выдерживают при температуре, оптимальной для развития данного вида микроорганизмов, и по окончании свертывания молока сохраняют до следующей перевивки. Частота пересевов зависит главным образом от температуры, при которой хранят культуры между пересевами. Если культуры после свертывания молока хранят при комнатной температуре, пересевать их в свежее молоко нужно не реже, чем через 5-7 дней (С.А. Королев, 1932, А.М. Скородумова, 1963). Если культуры хранят в холодильнике при 3-4° С, то их можно пересевать значительно реже: культуры мезофильных молочнокислых стрептококков и молочнокислых палочек - через 15-20 дней, термофильных стрептококков - через 20-30 дней.

Как правило, в процессе хранения в результате отмирания части клеток активность заквасок снижается, поэтому для восстановления первоначальной активности культур перед употреблением рекомендуется пересевать их в свежее молоко.

Для сохранения активности культур большое значение имеет своевременное прекращение жизнедеятельности микроорганизмов после сквашивания молока. Если культуры сразу после свертывания молока поместить в холодильник, то их первоначальная активность сохраняется, по крайней мере, в течение 8 дней. В то же время культуры, которые выдерживали в термостате после образования сгустка для дальнейшего созревания, часто оказывались неактивными уже через 3-4 дня хранения при 4-5° С (Е.М. Фостер, 1962). Некоторые авторы рекомендуют направлять культуры на холодильное хранение до образования сгустка (Б. Рийтер и А. Моллер-Мадсен, 1963). Добавляя к молоку мел, иногда можно сохранить культуры до 3-5 месяцев. X.Ц. Ольсену (1959) удалось сохранять удовлетворительную активность молочнокислых бактерий при 7,5-10° С в течение 8 месяцев в молоке, содержавшем 20% глицерина, 3% поваренной соли и 30% сахарозы.

Чтобы снизить влияние качества и состава молока на молочнокислые бактерии и предотвратить изменение их свойств, за границей (США и пр.) используют среды более постоянного состава: молоко, восстановленное из сухого обезжиренного или цельного молока одной проверенной партии или молоко от коров одной фермы. Сборное молоко считается лучшим, чем молоко от одного животного, так как средний химический состав его более постоянный. Однако даже в средах с постоянным составом желательно максимальное сокращение числа пересадок культур для сохранения их первоначальных свойств.

Культуры и закваски в высушенном состоянии. Культуры молочнокислых бактерий сушат сублимацией, закваски смешиванием с крахмалом, методами распыления и сублимации (лиофлизации).

Метод смешивания с крахмалом. Сущность метода заключается в высушивании заквасок путем смешивания с предварительно высушенным крахмалом. В дальнейшем он был усовершенствован предложено высушивать закваски, смешанные с крахмалом, в вытяжном сушильном шкафу током нагретого воздуха при температуре не выше 40° С. В процессе сушки заквасок этим методом погибает значительная часть микрофлоры и изменяются свойства микроорганизмов, входящих в состав закваски.

Метод распыления. Сущность его состоит в том, что в стерильное обезжиренное молоко с повышенным (до 16%) содержанием сухих веществ (перед стерилизацией в него добавляют сухое обезжиренное молоко) вносят 1% закваски молочнокислых бактерий. Заквашенное молоко выдерживают при температуре, оптимальной для развития данных микроорганизмов, и нейтрализуют 10% -ным раствором едкого натра до кислотности исходного стерильного молока. Нейтрализованную закваску высушивают на распылительной сушилке при температуре поступающего воздуха не выше 130° С и в зоне распыления - не выше 50° С. Сухие культуры смешивают с сухим стерильным крахмалом в пропорции 1:

1. Закваска, полученная этим методом, при влажности не выше 4-5% может сохранять достаточно высокую активность 3 мес. и более.

Метод получения сухих заквасок из бактериального концентрата. По этому методу микроорганизмы закваски выращивают в жидкой питательной среде, основа которой состоит из сыворотки и гидролизованного молока. Для стимуляции роста молочнокислых стрептококков рекомендуется применять трехзамещенный лимоннокислый натрий и сернокислый марганец, а для стимуляции роста молочнокислых палочек - дрожжевой автолизах и смесь буферных солей.

После выращивания на этой среде клетки бактерий отделяют от культуральной жидкости центрифугированием. Полученную биомассу разводят в стерильном обезжиренном молоке, содержащем 16% сухих веществ, и высушивают на распылительной сушилке. В сухой закваске, приготовленной этим методом, после хранения на холоде в течение 6 месяцев содержатся миллиарды клеток в 1 г. При высушивании бактериального концентрата путем смешивания с крахмалом методом распыления, где часть операций производится открыто, невозможно получить абсолютно чистую культуру. Кроме того, при высушивании закваски, состоящей из разных штаммов микроорганизмов, последние по-разному реагируют на неблагоприятные условия сушки. В результате этого трудно сохранять нужные соотношения между отдельными компонентами микрофлоры. Метод сублимации. Сущность метода состоит в высушивании бактериальных клеток, находящихся в замороженном состоянии, при высоком вакууме.

В последние годы проведена работа по подбору оптимальных условий приготовления заквасок, высушенных сублимацией из бактериального концентрата. Полученный концентрат, смешанный с защитной средой, фасуют во флаконы и высушивают при строго определенных режимах, после чего флаконы укупоривают. Подобраны условия выращивания и сушки заквасок разного видового состава микрофлоры. Выявлены основные факторы, влияющие на жизнеспособность заквасок, высушенных методом сублимации: состав среды и условия накопления клеток, способ их отделения, состав защитной среды, температура и длительность высушивания, конечная влажность (И.В. Лагода, Л.А. Банникова, 1970). Разработан метод прогноза стойкости сухой закваски путем прогрева ее сразу после выработки при 80° С в течение 30 мин. Установлено, что, если в закваске после термостатирования остается 27-38% живых клеток, она будет стойкой при хранении в течение 4-5 мес.

Исследования показали, что закваски, высушенные сублимацией, содержат 3-5 млрд. клеток в порции (0,1 г.). Применение их позволяет получать абсолютно чистую в микробиологическом отношении закваску при оживлении ее в стерилизованном молоке. В процессе хранения на холоду она полностью сохраняет свою жизнеспособность и соотношение компонентов микрофлоры в течение 4-5 мес.

Этим методом сушат также коллекционные культуры, которые можно использовать в течение ряда лет. По данным разных исследователей, выживаемость клеток составляет 40-80%, а иногда и 90% (в зависимости от индивидуальных свойств культуры и условий высушивания). Высушенные штаммы следует хранить при температуре не выше 10° С.

Культуры и закваски в замороженном состоянии. С целью полного прекращения жизнедеятельности микроорганизмов, максимального сокращения числа пересадок культур при хранении применяют быстрое замораживание их при низких температурах (-18-г--25°С). В замороженных культурах удается получать от 75 до 90% живых

клеток от первоначального количества (Э.М. Фостер и др., 1962). Эти колебания зависят прежде всего от условий замораживания, а также от возраста культур, подвергавшихся замораживанию, и рН среды. Максимальную активность культур после дефростации удавалось получить, если их замораживали в логарифмической или в начале стационарной фазы роста. Нейтрализация культуры перед замораживанием или отделение клеток от культуральной среды с последующим внесением их в молоко с рН 7 также позволяет повысить активность замороженных культур.

Коллекционные культуры можно сохранять длительное время без перевивок в замороженном состоянии при температуре - 25°С. По данным Л.А. Банниковой (19536), ароматообразующие молочнокислые стрептококки в течение 6 мес. выдержки при - 25° С сохраняли свои свойства - способность к кислотообразованию, накоплению летучих кислот, ацетоина, диацетила. После размораживания культуры несколько дольше свертывали молоко, но полностью восстанавливали активность уже после первой пересадки в молоко, ацидофильные культуры сохраняют антибиотическую активность в течение длительного времени при - 25° С с пересевами и последующим замораживанием через б мес. Имеются сообщения о возможности сохранения замороженных при - 30° С культур в достаточно жизнеспособном состоянии в течение ряда лет (Э.М. Фостер, 1962; Е. Воле, Дж. Моко, 1967 и др.). За последние годы в разных странах проведены исследования по получению бактериальных концентратов, замороженных в жидком азоте В таких концентратах обычно хорошо сохраняется микробиологический состав заквасок. Они предназначены не для длительного хранения, а для непосредственного использования в производстве.

СОСТАВЛЕНИЕ И СОХРАНЕНИЕ КОЛЛЕКЦИЙ ЧИСТЫХ КУЛЬТУР И ЗАКВАСОК

Исключительно кропотливая и трудоемкая работа по выделению, изучению чистых культур и подбору заквасок молочнокислых бактерий может оказаться малоэффективной, если не будут приняты меры по длительному сохранению их. Во многих странах (США, Англия) для этой цели созданы национальные коллекции. В нашей стране в Институте микробиологии АН СССР создана общесоюзная коллекция (для всех микроорганизмов), во ВНИМИ - отраслевая (для кисломолочных продуктов) коллекция молочнокислых бактерий и микроорганизмов - вредителей молочного производства. Коллекция предназначена для снабжения культурами специальных лабораторий, выпускающих закваски для цельномолочной промышленности и научно-исследовательских учреждений.

СХЕМА РАБОТЫ С ЗАКВАСКАМИ НА ПРОИЗВОДСТВЕ Схему работы с заквасками на чистых культурах, применяемую в производственных условиях, можно представить следующим образом.

Чистые культуры

Жидкие, сухие закваски, получаемые в готовом виде из специальных лабораторий

Лабораторная закваска, приготовляемая в лаборатории на стерилизованном молоке

В специальных лабораториях из чистых культур готовят сухие или жидкие закваски, которые можно классифицировать как чистые культуры. Закваски, полученные из лаборатории в сухом виде, хранят в холодильнике. По мере необходимости их оживляют и в дальнейшем поддерживают так же, как и жидкие, перевивая в пробирки со стерилизованным молоком через 10-15 дней и храня между перевивками в холодильнике. Чистые культуры используют для приготовления лабораторной закваски на стерилизованном или кипяченом (если отсутствует автоклав) молоке.

Все виды лабораторной закваски используют для приготовления первичной производственной закваски на пастеризованном молоке или, где это возможно, на стерилизованном. Кроме того, лабораторную закваску, приготовленную на активных чистых культурах, применяют непосредственно для заквашивания молока или сливок при производстве кисломолочных продуктов.

Первичную закваску для выработки продуктов используют непосредственно в производстве. На производстве не рекомендуется проводить последующие пересадки закваски, так как это приводит к загрязнению закваски и снижению ее активности. Все закваски оживляют в стерильном молоке, а затем ежедневно для приготовления лабораторной закваски в бутылочках используют разные партии.

Лаборатория чистых культур ВНИИМСа рекомендует схему использования сухих заквасок для сыров с низкой температурой второго нагревания и для мягких сыров, исключающую многократные пересадки. В Польше эта схема разработана и принята также для сыроделия (Б. Хабай, Т. Рапшинский и др., 1966). В соответствии с этой схемой сухую закваску из одной пробирки вносят примерно равными порциями в 7 бутылок или колб со стерилизованным либо пастеризованным молоком, получая лабораторную (по терминологии ВНИИМСа - первичную) закваску. После свертывания закваску хранят при 5-8° С и ежедневно в течение 7 дней используют для приготовления первичной производственной (по терминологии ВНИИМСа - вторичной) закваски 1 бутылку. В день использования последней бутылки вновь готовят 7 бутылок со стерильным молоком и заквашивают их сухой культурой обязательно другой даты изготовления. Этот способ приготовления закваски принято называть трехрядным. Применение его на сыродельных заводах способствует получению более чистой в микробиологическом отношении закваски и предупреждает развитие на производстве бактериофага, так как при этом исключается длительное пассирование закваски в производственных условиях.

Трехрядный способ можно рекомендовать и для производства кисломолочных продуктов (главным образом творога) в тех случаях, когда трудно поддерживать лабораторные закваски на стерильном молоке в пробирках.

ПРИГОТОВЛЕНИЕ ЛАБОРАТОРНОЙ ЗАКВАСКИ

Для приготовления лабораторных заквасок желательно использовать обезжиренное молоко с содержанием сомо не ниже 8%, чистым вкусом, кислотностью не выше 19-20° Т. Емкости для закваски должны быть тщательно вымыты и высушены. Молоко разливают в бутылки емкостью 1 л и укупоривают ватными пробками или специальными колпачками. При изготовлении большого количества закваски удобно пользоваться алюминиевыми бидонами емкостью 10 л.

Стерилизуют молоко при 120° С в течение 15-20 мин. Стерилизованное охлажденное молоко заквашивают рабочими культурами, строго соблюдая условия асептики.

При использовании сухих заквасок, высушенных способом сублимации, край флакона обжигают на пламени горелки, вливают во флакон 5-7 мл стерильного молока и после растворения закваски все содержимое флакона выливают в 2 л стерилизованного молока. При использовании жидких заквасок количество вносимой закваски рассчитывают в зависимости от времени, которое необходимо для получения готовой закваски. Если молоко заквашивают вечером, в конце рабочего дня, а закваска должна быть готова утром, то достаточно вносить 0,1% закваски.

Заквашенное молоко выдерживают при температуре, оптимальной для развития входящих в нее микроорганизмов, а в случае применения комбинированной закваски, состоящей из микроорганизмов с разным температурным оптимумом, - при температуре, обеспечивающей сохранение нужного соотношения между микроорганизмами. Закваску для творога готовят при температуре 26-30° С, для сметаны - при 24-26° С, обыкновенной простокваши - 30-35°, ацидофильно-дрожжевого молока - 25-30° С, закваску болгарской палочки и термофильного стрептококка - при 40-45° С, ацидофильной палочки - 38-40°.

До использования готовую закваску хранят в холодильнике или холодильной камере. Лабораторная закваска представляет собой чистую культуру или смесь чистых культур микроорганизмов. Следует отметить, что при производстве заквасок на стерильном молоке в лабораторных условиях часто образуются дряблые неустойчивые сгустки. В то же время эта закваска, внесенная в пастеризованное молоко, дает хорошие, плотные сгустки. Поэтому не следует отбраковывать закваску на стерильном молоке из-за недостаточно плотного сгустка, если при испытании культур в пробных стаканах на пастеризованном молоке они давали удовлетворительные сгустки.

Процесс приготовления симбиотических заквасок, состоящих из термофильных стрептококков и болгарской палочки, закваски для кумыса и ацидофильно-дрожжевого молока имеет специфические особенности.

Приготовление симбиотической закваски. Симбиотическую закваску после оживления ее из сухой культивируют следующим образом. В стерилизованное молоко при температуре 43-45° С вносят стерильной пипеткой 1% симбиотической закваски. Молоко сквашивают при 43° С, сгусток образуется через 2 ч 30 мин. - 2 ч 50 мин. Сразу после образования сгустка закваску вынимают из термостата и просматривают микроскопический препарат. В поле зрения микроскопа должно обнаруживаться большое количество стрептококков и 5-10 палочек в закваске для ряженки, простокваши, варенца, 10-15 палочек - в закваске для йогурта.

Если в микроскопическом препарате обнаруживается палочек больше, чем требуется, то количество вносимой закваски при последующем пересеве снижают до 0,5-0,7%. Если количество их недостаточно, то дозу закваски увеличивают до 1,2-1,5%. Готовую закваску хранят при 3-5° С, пересевают 1 раз в неделю. Оставшуюся закваску используют для приготовления необходимого количества рабочей лабораторной закваски, которую готовят ежедневно, как указано выше. Наиболее распространенный порок, возникающий при культивировании симбиотической закваски в производственных условиях, - вытеснение стрептококков палочками и как следствие этого - потеря закваской активности. Это происходит потому, что на практике все лабораторные закваски готовят в течение ночи, так же поступают и с симбиотической закваской, у которой сгусток образуется очень быстро - за 2,5 ч. В результате длительной выдержки в закваске повышается кислотность и стрептококки отмирают. При таких условиях в результате двух-трех пересевов закваска становится непригодной для дальнейшего использования.

В случае необходимости из лабораторной закваски готовят производственную. Молоко пастеризуют при 92-95° С с выдержкой 20 - 30 мин, охлаждают до 43-45° С, вносят в него 1% лабораторной закваски и тщательно перемешивают. Сгусток образуется через 2 ч 30 мин - 2 ч 50 мин, и его сразу начинают охлаждать при перемешивании, которое производят в течение первых двух часов 3-4 раза через 15-20 мин. Кислотность готовой закваски должна быть 80-85° Т, микроскопический препарат должен быть такой же, как и у лабораторной закваски для соответствующих продуктов.

Приготовление закваски для кумыса из коровьего молока. Технология приготовления закваски разработана Л.А. Банниковой с сотр. (1970). Закваску можно готовить из отдельных штаммов в соответствии с требуемым составом микрофлоры или из жидкой симбиотической закваски, получаемой из лаборатории. Жидкую симбиотическую закваску, состоящую из специально подобранных штаммов молочнокислых палочек и дрожжей, освежают путем пересадки в стерильное обезжиренное молоко, подогретое до 37°С, внося ее в количестве 5%. Молоко перемешивают и термостатируют при 37° С, где оно сквашивается в течение 12-16 ч. Во время сквашивания сразу после образования сгустка закваску несколько раз перемешивают. После сквашивания закваску выдерживают 4-6 ч при 18-20° С для накопления дрожжей, а затем не менее суток в холодильнике, где хранят до следующей пересадки. Вторичную и последующие лабораторные закваски готовят на стерильном обезжиренном молоке при температуре 26-28° С, внося в него 5 - 7% закваски. Пересадки лабораторной закваски производят через день не более 10 раз.

Производственную закваску готовят на обезжиренном молоке, пастеризованном при 92-95° С с выдержкой 20 мин и охлажденном до 26-28° С, внося в него 5-7% лабораторной закваски. Молоко перемешивают и оставляют на 6-7 ч при 26-28° С до образования сгустка кислотностью 85-90° Т. Закваску перемешивают 10-15 мин и выдерживают для развития дрожжей и нарастания кислотности до 110-115° Т (примерно Зч). За это время ее перемешивают не менее 10 раз по 5 мин, после чего готовую закваску охлаждают. В поле зрения микроскопа при микроскопировании препаратов закваски должно обнаруживаться от 3 до 25 клеток дрожжей при большом количестве незернистых темноокрашенных палочек. При приготовлении закваски для кумыса особенно большое значение имеет ее перемешивание, цель которого интенсифицировать развитие дрожжей.

Приготовление закваски для ацидофильно-дрожжевого молока. Для приготовления лабораторной закваски в 0,5 л стерильного обезжиренного молока при температуре 37-40° С вносят 10 мл свежеприготовленной чистой культуры ацидофильной палочки и 10-15 мл смыва специально подобранных дрожжей, выращенных на картофельно-лактозном агаре при 25-30° С в течение 2-3 дней (до появления на поверхности агара обильного роста дрожжей). Заквашенное молоко выдерживают при 30-32° С до образования сгустка, который появляется через 12 ч. Полученную закваску выдерживают при комнатной температуре 12-24 ч, периодически ее перемешивая для накопления дрожжей, а затем охлаждают до 3 - 5° С и хранят при этой температуре до употребления. Производственную закваску готовят на обезжиренном молоке, пастеризованном при 92-95° С с выдержкой 20-30 мин и охлажденном до 37-40°С. В молоко вносят 2-3% лабораторной закваски, перемешивают и в течение 10-12 ч сквашивают при 30-32° С. Далее поступают так же, как при приготовлении лабораторной закваски.

ПРИГОТОВЛЕНИЕ ПРОИЗВОДСТВЕННОЙ ЗАКВАСКИ

Для приготовления производственной закваски применяют пастеризованное молоко, хотя, как показывает практика, при использовании стерилизованного молока получается закваска более активная и чистая в микробиологическом отношении.

Производственную закваску готовят чаще всего или в ваннах длительной пастеризации (ВДП) или в специальных заквасочниках. Ванны целесообразно наполнять молоком через нижний штуцер. При этом исключается возможность попадания сырого молока. Сырое молоко может также попасть в пастеризованное из трубопроводов через нижний штуцер при недостаточно хорошо притертых кранах. Во избежание этого после наполнения молоком ванну отключают от общего трубопровода. Молоко нагревают при перемешивании до 92-95° С, после чего отмечают начало пастеризации и выдерживают его при этой температуре 20-30 мин.

По окончании пастеризации молоко охлаждают до температуры, оптимальной для развития микроорганизмов, входящих в состав закваски, и, соблюдая строжайшую чистоту (проносят край бутылки с чистой культурой над пламенем горелки или обтирают его спиртом), вносят в него лабораторную закваску. Количество закваски устанавливают в зависимости от условий производства. При внесении 5% закваски для творога сквашивание происходит в течение 5-6 ч, при внесении 1% образование сгустка длится примерно 8-10 ч. После внесения закваски молоко тщательно перемешивают и оставляют до образования сгустка. В процессе сквашивания молока необходимо поддерживать температуру, оптимальную для развития микроорганизмов данной закваски. После образования сгустка закваску охлаждают. Все операции - пастеризацию, охлаждение, заквашивание, сквашивание - производят в одной емкости. Переливание в другие емкости не допускается.

В отличие от лабораторной производственную закваску нельзя рассматривать как чистую культуру бактерий. При всей тщательности проведения пастеризации в молоке неизбежно остаются споры, которые погибают лишь при температуре выше 100° С, а при малейшем нарушении режима пастеризации в нем остаются термоустойчивые молочнокислые бактерии. Если споровые микроорганизмы не представляют опасности и, по существу, не развиваются на фоне бурного молочнокислого процесса, происходящего при сквашивании, то молочнокислые палочки, содержащиеся в молоке даже в незначительном количестве (1 - 10 клеток в 1 мл), могут отрицательно влиять на качество закваски. Поэтому закваску необходимо контролировать очень тщательно. Периодически следует проверять эффективность пастеризации молока и чистоту закваски.

ПОВЫШЕНИЕ АКТИВНОСТИ ЗАКВАСОК

Имеются три основных пути повышения активности заквасок: добавление специальных веществ, стимулирующих биохимическую активность обычных, рядовых культур; получение культур, обладающих повышенной биохимической активностью; повышение микробиологической чистоты и активности заквасок совершенствованием методов их культивирования на производстве. Некоторые исследователи (М.Л. Спекк, 1962 и др.) рекомендуют молоко, предназначенное для культивирования молочнокислых бактерий, обогащать различными экстрактами растительных и животных тканей, а также гидролизатами белков. Действительно, содержащиеся в этих субстратах витамины, комплекс аминокислот и пептидов значительно повышают жизнеспособность и энергию кислотообразования молочнокислых бактерий. Однако при решении вопроса о применении добавок необходимо учитывать следующее обстоятельство. Если культуры, адаптированные к развитию в молоке, содержащем активаторы, перенести в сравнительно неблагоприятные условия, то они будут развиваться хуже, чем культуры, выращиваемые на средах без веществ-активаторов. Делаются попытки использовать вещества-активаторы непосредственно в производственных условиях. В качестве активатора применяют экстракт панкреатиновой железы в количестве 0,2%. Продолжительность сквашивания и получения готового сыра коттедж значительно сокращалась (примерно на 10%), если к молоку добавляли экстракт панкреатиновой железы (М.Л. Спекк и др. 1958).

Аналогичное действие оказывает введение в молоко одновременно с закваской небольших доз сычужного фермента.

В ЧР (Б. Гилмар, М. Тепли, 1969) разработана рецептура специальных активаторов, в состав которых входят на 500 мл дистиллированной воды: дрожжевой экстракт (10 г), кислый гидролизах казеина (15 г), энзиматический гидролизат казеина (15 г), пептон (15 г), вытяжка из телячьего мяса (150 мл), вытяжка из телячьего сердца (150 мл), вытяжка из панкреатиновой железы (150 г), 85% -ная молочная кислота (20 мл).

Перспективно использовать в качестве активаторов молочнокислых бактерий микробов-симбионтов - дрожжей, уксуснокислых бактерий и пр. В этих случаях характер активизации несколько иной. Добавляя вещества-активаторы, вносят в среду сразу значительную их дозу. Микробы-симбионты вырабатывают те же самые вещества, но в небольшом количестве и равномерно. При этом эффект получается разный: в первом случае активность микроорганизмов резко повышается, но в отсутствие веществ-активаторов также резко падает; во втором случае активность возрастает не столь интенсивно, но проявляется в присутствии симбионтов постоянно, а иногда сохраняется и в чистой культуре после разделения с микробом-симбионтом.

В качестве примера можно привести данные, полученные при исследовании микрофлоры кефирных грибков. Установлено, что в этих грибках преобладают ароматообразующие стрептококки, которые в чистой культуре свертывают молоко медленно. Однако в присутствии дрожжей и уксуснокислых бактерий эти малоактивные бактерии прекрасно развиваются.

Известно, что кефирная закваска значительно реже теряет свою активность, чем закваска, приготовленная на чистых культурах молочнокислого стрептококка.

Улучшить качество и повысить активность закваски можно, сократив число пересадок закваски на производстве. При пересадках активность закваски снижается главным образом в результате развития в ней бактериофага. Это в свою очередь приводит к постепенному увеличению количества микроорганизмов незаквасочного происхождения - остаточной микрофлоры пастеризованного молока (преимущественно термоустойчивых молочнокислых палочек). Массовые исследования заквасок для творога и сметаны на Останкинском молочном комбинате показали, что в первичной производственной закваске термоустойчивые молочнокислые палочки содержались исключительно редко (примерно в 1-2% закваски). При исследовании вторичной производственной закваски было установлено, что в 50% ее содержалось более 25000 клеток палочек в 1 мл и в 25% - менее 25000 в 1 мл. Палочки в количестве менее чем десятки тысяч в 1 мл уже нельзя обнаружить микроскопированием закваски, поэтому такая закваска обычно выпускается лабораторией в производство. Использование первичной производственной закваски, а там, где это позволяют условия (оснащенность лаборатории, объем производства и т.д.), и лабораторной значительно повышает их микробиологическую чистоту, активность и исключает обсеменение молока с закваской термоустойчивыми молочнокислыми палочками.

В последние годы за рубежом при производстве сыра непосредственно в сырную ванну вносят сухие сублимированные или замороженные концентраты, что позволяет исключить процесс приготовления закваски (При этом исключается обсеменение заквасок в процессе пересадок в производственных условиях и повышается качество продукции). Однако широкое использование их затрудняется необходимостью транспортирования заквасок в специальных контейнерах, сохраняющих низкую температуру. Установлено, что замороженные культуры можно использовать и для непосредственного заквашивания молока при производстве кисломолочных продуктов - сквашенной пахты и сыра коттедж.

ИСТОЧНИКИ ПЕРВИЧНОЙ МИКРОФЛОРЫ НЕЗАКВАСОЧНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ

Молоко (или сливки). Микрофлора молока (или сливок) состоит из остаточной микрофлоры после пастеризации и микрофлоры, попадающей в молоко или сливки при прохождении через оборудование. Естественно, что чем эффективнее режим пастеризации и чем ограниченнее контакт пастеризованного молока после пастеризации с оборудованием, тем меньше в нем микроорганизмов незаквасочного происхождения. Поэтому при производстве заквасок применяют пастеризацию при 90-95° С и длительную выдержку (10-30 мин) при этих температурах. При этом все операции выполняют в той же емкости, в которой проводили пастеризацию. В пастеризованном молоке, попадающем в емкости для заквашивания и сквашивания кисломолочных продуктов, могут содержаться десятки, сотни тысяч клеток в 1 мл.

Оборудование. При недостаточно тщательной мойке и дезинфекции оборудования в 1 мл смыва со 100 см² содержится до 1-50 тыс. клеток микроорганизмов. В 1 мл смыва со 100 см² поверхности чисто вымытого оборудования обнаруживаются единицы и десятки клеток. Микрофлора, обнаруживаемая на оборудовании, по составу более разнообразна, чем остаточная микрофлора пастеризованного молока. Она может состоять из представителей остаточной микрофлоры пастеризованного молока (термоустойчивых молочнокислых палочек, стрептококков кишечного происхождения и термофильных), микроорганизмов закваски (Str. lactis, молочнокислые палочки и дрожжи) и бактерий группы кишечной палочки (в случае недостаточно тщательной санитарной обработки оборудования). Все эти микроорганизмы не только остаются на оборудовании, но и при наличии на нем минимального количества молока или воды активно развиваются. По наблюдениям Б.Л. Беловицкой, основным источником обсеменения молока термоустойчивыми молочнокислыми палочками при прохождении его через оборудование является молочный камень. С целью дезинфекции оборудование чаще всего обрабатывают водным раствором хлорной извести с содержанием активного хлора 200 мг/л. Установлено, что термоустойчивые молочнокислые палочки выдерживают концентрацию активного хлора до 300 мг/л и, следовательно, не уничтожаются при хлорировании оборудования. Эффективным способом уничтожения бактерий группы кишечной палочки и резкого снижения общего количества бактерий является стерилизация труб в специальных стерилизаторах или пропаривание. Практика показывает, что применяемые методы санитарной обработки оборудования не всегда достаточно эффективны. При подборе моющедезинфицирующих средств необходимо учитывать воздействие их не только на бактерии группы кишечной палочки, но и на технически важную микрофлору - термоустойчивые молочнокислые палочки и другие микроорганизмы, значительно более устойчивые к неблагоприятным воздействиям, чем кишечная палочка.

Вода. По микробиологическим показателям вода должна удовлетворять следующим требованиям: в 1 мл должно содержаться не более 100 бактерий. Титр кишечной палочки должен быть не менее 300 мл. Как правило, вода удовлетворяет этим требованиям. Однако возможны случаи, когда она становится источником обсеменения оборудования и продукции такими группами микроорганизмов, как Е. coli, а иногда и более опасными представителями кишечной микрофлоры. Это может быть при недостаточно хорошо продуманном монтаже водопроводной сети на предприятии, когда вода из бойлера (обычно менее чистая) смешивается с холодной, поступающей непосредственно из водопроводной сети или артезианской скважины.

Наполнители. С наполнителями (сахаром изюмом, цукатами) в кисломолочные продукты попадают дрожжи и плесени. Кроме того, они могут служить источником обсеменения продуктов споровой микрофлорой и бактериями группы кишечной палочки.