Засоби діагностики та профілактики інфекційного ринотрахеїту великої рогатої худоби в Україні

Проведеними дослідженнями встановлено, що в організмі морських свинок при введенні суспензії культури Bacillus alvei штаму 413 синтезуються аглютинуючі антитіла специфічні до вірусу ІРТ у титрі 5,0 log₂ та віруснейтралізуючі специфічні антитіла у титрі 3 log₂ . На клітинному рівні була встановлена активізація системи мононуклеарних фагоцитів (табл. 1).

Порівняльне вивчення імунної відповіді на введення препаратів із шт. 413 та шт. 332 Bac. alvei показало, що організм дослідних морських свинок в обох групах відреагував підвищенням показника макрофагальної трансформації мононуклеарів (ПМТМ). Однак більш виражене збільшення ПМТМ було відмічено у тварин першої групи (з 414,2 % до 71,03,3 %), та менш виражене у тварин другої групи (з 39,40,9 % до 57,33,1 %). Цей факт пояснює появу незначного збільшення рівню гуморального імунітету на введення препарату, виготовленого з бактерій штаму 332 Bacillus alvei.

Препарат, виготовлений з використанням шт.413 Bacillus alvei, індуцирував синтез антитіл у більшій кількості, ніж референтний штам герпесвірусу 1 “ІРТ-LG” (ПМТМ підвищився з 40,63,4 % до 55,34,9 %). Цей феномен може бути обумовлений звісним імунодепресивним впливом герпесвірусів на імунний статус тварин.

У той же час, відмічено значне підвищення у тварин першої та третьої груп фагоцитарного індексу (ФІ) до 66,42,1 % та 72,73,5 % (співвідносно), а також фагоцитарного числа (ФЧ) до 16,20,2 та 14,50,7 (співвідносно) з вірогідністю в порівнянні з контролем - ФІ 37,52,5 % та ФЧ 4,10,5.

Через 14 діб серологічними дослідженнями в РНГА та РН була встановлена наявність специфічних віруснейтралізуючих антитіл до вірусу ІРТ у морських свинок першої групи, яким вводили препарат з бактерій шт.413 Bac.аlvei та у тварин третьої групи, яким вводили герпесвірус 1 штам “ІРТ-LG” у титрі 3,0 log₂. У тварин другої групи та контрольних присутність віруснейтралізуючих антитіл у сироватках крові тварин не встановлено.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Таблиця 1

Результати вивчення імуногенної дії препарату з шт.413 Bac. аlvei на морських свинках

Примітка: Різниця вірогідна відносно значеня до введення препаратів * - (Р) ? 0,05; ** - (Р) ? 0,5;

ПМТМ - показник макрофагальної трансформації мононуклеарів;ФІ - фагоцитарний індекс;

ФЧ - фагоцитарне число; ** - дослідження через 24 години.

Размещено на http://www.allbest.ru/

68

Введення морським свинкам дослідних та контрольної групи епізоотичного штаму герпесвірусу 1 “4016” через 2 години у тварин першої групи викликало зниження ПМТМ до 55,53,3 %, а у тварин третьої групи підвищення ПМТМ до 59,52,4 %.

Отримані дані характеризують активну нейтралізацію герпесвірусу 1 специфічними антитілами у тварин першої групи та високі імуногенні властивості штаму “ІРТ-LG”. При цьому треба відзначити, що підвищився ФІ з 66,42,1 % до 71,31,3 %, ФЧ з 16,20,2 до 16,90,1 у тварин першої групи, а у тварин третьої групи ФЧ з 14,50,7 до 15,70,4.

Змін клінічного стану морських свинок першої та третьої груп не було встановлено. В той же час у тварин другої групи було встановлено зниження ПМТМ до 40,03,2 %, ФІ до 39,01,2 %. Через 24-48 годин у морських свинок відмічено пригнічення, зниження апетиту.

У тварин п'ятої групи через 2 години після введення штаму “4016” було встановлено значне підвищення ПМТМ з 41,02,5 % до 68,01,8 %; ФІ з 37,81,4 % до 64,42,2 %; ФЧ з 4,20,3 до 5,20,3. Однак вже через 24 години ПМТМ знизився на 12,4 %, ФІ на 44,4 %, ФЧ на 26 %, що характеризує депресивний стан системи мононуклеарних фагоцитів.

Збереженість високого рівня ПМТМ у тварин третьої групи (59,52,4 %), ФЧ (15,70,4) і титру специфічних до вірусу ІРТ антитіл (4,6 log₂) при незначному зниженні ФІ, свідчить про активізацію гуморальної ланки імунного захисту та ефекторної стадії імунної відповіді активізованими макрофагами.

Таким чином встановлено, що препарат виготовлений з бактерій Bacillus alvei штаму 413, проявляє імуномодулюючий вплив на стан щеплених тварин й активізує систему мононуклеарних фагоцитів на рівні з референтним штамом герпесвірусу 1 “ІРТ-LG”, має імуногенні та протективні властивості.

Визначення на телятах специфічності антитіл, що синтезуються організмом тварини при введенні імунізуючого препарату “Ритравак Б” проти ІРТ ВРХ . Для визначення специфічності антитіл у сироватках крові дослідних тварин, що синтезуються на введення “Ритравак Б” у дозі 100 млрд мікробних клітин при підшкірному введенні дворазово з інтервалом в 21 добу, вони були досліджені в РН зі штамом "ІРТ-LG" на перещеплюваній культурі клітин трахеї теляти (ТТ) та в РНГА з еритроцитарним антигеном. Дані серологічних досліджень свідчили, що введення препарату активізувало в організмі щеплених тварин синтез специфічних до герпесвірусу 1 аглютинуючих антитіл у титрі 11,50,29 log₂ та віруснейтралізуючих у титрі 5,00,41 log₂.

У подальшому був проведений дослід з визначення специфічності антитіл, що синтезуються в організмі телят на введення “Ритравак Б” з використанням в якості контрольного штаму “ІРТ-LG” герпесвірусу 1. Групи тварин для досліду були сформовані з мінімальним рівнем специфічних антитіл до вірусу ІРТ, який дорівнював 5,2 log₂.

Тваринам двох дослідних груп (16 голів) внутрішньом'язово вводили “Ритравак Б” в дозі 10 см³ (концентрацією 10 млрд. мікр. кл/см³ ). Тваринам контрольної групи (5 голів) вводили аналогічним методом МПБ.

Через 7 діб рівень специфічних антитіл до вірусу ІРТ у щеплених тварин першої дослідної групи дорівнював 8,60,2 log₂, а через 21 добу він складав 9,40,41 log₂ та віруснейтралізуючих антитіл у титрі 5,0±0,4 log₂ з вірогідністю Р?0,01. Того ж дня телятам першої дослідної групи (11 голів) внутрішньом'язово вводили вірусутримуючий матеріал (штам "ІРТ-LG") у дозі 2 х 10^-5,5 ТЦД₅₀. Телятам другої дослідної групи (5 голів) вводили аналогічним способом препарат “Ритравак Б”.

Через 5 діб після введення штаму "ІРТ-LG", серологічними дослідженнями в РНГА було встановлено, що титр аглютинуючих антитіл короткочасно знизився з 9,40,41 log₂ до 3,01,14 log₂, а через 12 діб підвищився до 8,10,44 log₂ з вірогідністю Р?0,01. Цей факт свідчив про специфічну нейтралізацію культурального вірусу синтезованими антитілами, які вироблялися на введення препарату “Ритравак Б”. У телят другої дослідної групи титр специфічних антитіл до вірусу ІРТ склав 8,80,58 log₂.Через 24 доби рівень антитіл у тварин першої групи дорівнював 8,60,31 log₂, у тварин другої групи 8,60,24 log₂, у тварин контрольної групи 5,20,37 log₂ (Р?0,01).

Таким чином встановлено, що імунізуючий препарат “Ритравак Б” проти ІРТ ВРХ стимулює в організмі щеплених тварин синтез антитіл специфічних до вірусу ІРТ й може використовуватися як засіб специфічної профілактики цього захворювання.

Визначення методу введення імунізуючого препарату “Ритравак Б” проти ІРТ ВРХ З метою визначення найбільш ефективного методу введення препарату “Ритравак Б”, в умовах господарства було сформовано чотири дослідні групи телят 6-місячного віку (по 5 голів) та контрольна група тварин (5 голів) з імунним фоном антитіл до вірусу ІРТ у титрі 5,0 log₂.

Препарат “Ритравак Б” вводили телятам у дозі 10 см³ з концентрацією 10 млрд. мікробних кл/см^3: дворазово з інтервалом 21 добу: першій групі - внутрішньом'язово; другій групі - підшкірно; третій групі - інтраназально; чотвертій групі - інтратрахеально; п'ятій групі (контрольній) вводили МПБ внутрішньом'язово. Кров для дослідів відбирали з яремної вени телят до початку досліду та через кожні 7 діб після останнього введення препарату.

При внутрішьом'язовому методі введення “Ритравак Б” синтез специфічних до вірусу ІРТ антитіл після першого введення через 21 добу був у титрі 6,60,4 log₂, а після другого введення у той же термін 8,60,2 log₂. Через 2 місяці рівень специфічних антитіл утримувався на високому рівні й складав 7,80,2 log₂.

Підшкірний метод введення характеризувався більш поступовим збільшенням титрів антитіл від 5,40,6 log₂ через 21 добу після першого введення до 8,00,4 log₂ через 1 місяць після завершення циклу вакцинації. Інтраназальний метод введення забезпечив максимальний рівень специфічних антитіл - 7,00,8 log₂ через 14 діб після другого введення препарату й поступово протягом 2 тижнів знижувався до 5,60,4 log₂. Інтратрахеальний метод введення імуногенного препарату забезпечив синтез специфічніх антитіл до вірусу ІРТ з максимальними показниками через 7 діб (6,40,6 log₂) та через 2 місяці (6,80,8 log₂).

При серологічних дослідженнях телят контрольної групи була відмічена динаміка зміни рівня специфічних антитіл, характерна для хронічного перебігу ІРТ ВРХ. Вона відрізнялась періодичністю утворення піків титрів антитіл до герпесвірусу 1 через 7, 14 діб, 2 місяці у титрі 7,4 log₂-7,8 log₂ і основною характерною ознакою епізоотичного процесу при ІРТ ВРХ - великою різницею рівнів титрів специфічних до вірусу ІРТ антитіл (від негативних до 10,0 log₂) в гурті тварин. Найбільш ефективним методом введення препарату проти ІРТ ВРХ “Ритравак Б” був внутрішньом'язовий, який забезпечив стабільний ріст специфічних до вірусу ІРТ антитіл на високому рівні (7,8-8,6 log₂) протягом 2 місяців (термін досліджень).

Вивчення дії імунізуючого препарату “Ритравак Б” проти ІРТ ВРХ при інтраназальному та пероральному методах введення новонародженим телятам. З метою вивчення імуногенної дії препарату “Ритравак Б” проти ІРТ ВРХ у досліді на новонароджених телятах при комбінованому методі введення (інстиляційним та аліментарним) на клітинному рівні, нами визначалися ПМТМ, ФІ, ФЧ. В якості контролю використовували тварин пасивно імунізованих сироваткою реконвалесцентів, виготовленою в лабораторії вивчення вірусних хвороб молодняка ІЕКВМ.

Досліди проводили на новонароджених телятах живою вагою 50-53 кг (голштинофризької породи). Телятам першої групи (6 голів) препарат вводили через 20-30 хвилин після народження перорально в дозі 200,0 см³ (з концентрацією 2,5 млрд. мікр.кл/см³) та інтраназально по 1 см³ (5 млрд. мікр.кл/см³) в кожну ніздрю за 30-40 хвилин до першої дачі молозива. Тваринам контрольної групи (3 голови) аналогічним методом вводили сироватку крові реконвалесцентів.

Від усіх новонароджених телят до введення, через 24, 48 годин, та 25 діб після введення препарату “Ритравак Б” відбирали кров для проведення гематологічних, імунологічних та серологічних досліджень.

Серологічними дослідженнями встановлено, що після введення “Ритравак Б” через 48 годин відмічається зростання титрів специфічних до вірусу ІРТ антитіл з 4,20,54 log₂ до 5,70,21 log₂, а при введенні сироватки крові реконвалесцентів з 2,70,33 log₂ до 5,70,33 log₂, що свідчить про мобільну ефективність обох препаратів. При інтраназально-пероральній імунізації препаратом “Ритравак Б”, було відмічено її стимулюючу дію на трансформаційну активність мононуклеарних клітин й зріст їх функціональних характеристик. Через 24 години у тварин дослідної групи ПМТМ крові збільшився з 20,81,3 % до 28,01,06 %, ФІ підвищався з 28,71,0 % до 36,31,54°%, а ФЧ збільшилося з 3,30,2 до 4,90,29 (Р?0,01).

Через 25 діб після введення препарату “Ритравак Б” ПМТМ збільшився до 42,31,98 %, а ФІ підвищився до 36,21,05 % (Р?0,01), ФЧ залишилося на високому рівні й склало 3,90,11 (Р?0,05).

У телят контрольної групи, яких пасивно імунізували сироваткою крові реконвалесцентів, через 24 години відмічено значне підвищення ПМТМ з 20,01,7 % до 27,71,86 % й незначні збільшення ФІ з 28,02,0 % до 29,01,15 % й ФЧ з 3,20,15 до 3,50,34. Але через 25 діб у телят контрольної групи ПМТМ та ФІ знизилися майже до початкових значень (20,01,7 % та 28,02,0 %), а ФЧ залишилося на високому рівні (3,60,4).

Отримані результаті свідчать, що препарат “Ритравак Б” при інтраназальному та пероральному введені активізує синтез антитіл специфічних до вірусу ІРТ (5,70,21 log₂) та підвищує ПМТМ на 103,3 %, ФІ на 26,4 %, а також посилює фагоцитоз на 18,1 %. Встановлено, що активна імунізація інстиляційним та аліментарним методом у порівнянні з пасивною імунізацією, специфічно активізує ланку імунної реактивності при щепленні телят на високому рівні та впродовж більшого терміну (25 діб, термін досліду).

Комісійна апробація імунізуючого препарату “Ритравак Б” проти ІРТ ВРХ У відповідності з наказом №4 Головного Державного департаменту ветеринарної медицини від 5 лютого 1998 р. комісією, за затвердженою методикою, було проведено випробування імунізуючого препарату “Ритравак Б” проти ІРТ ВРХ.

Апробацію імунізуючого препарату проводили на телятах 8-місячного віку, живою вагою 180-210 кг, з яких були сформовані 2 дослідні групи (по 5 голів) та 1 контрольна (4 голови). Серологічними дослідженнями сироваток крові телят до початку досліду було встановлено в них імунний фон до герпесвірусу 1 у титрах 7,8 log₂-8,6 log₂. Першій групі телят препарат “Ритравак Б” вводили в дозі 10 см³, телятам другої групи в дозі 20 см³, з концентрацією 10 млрд. мікробних кл/см³, внутрішньом'язово в ділянку верхньої третини шиї. Телятам контрольної групи вводили живильне середовище МПБ з інактиватором у дозі 10 см³ аналогічним методом.

Рівень та динаміка синтезу специфічних до вірусу ІРТ антитіл у дослідних тварин двох груп свідчила про високу імуногенну активність препарату впродовж 3 місяців. Після першого введення препарату через 7 діб відмічено незначне зниження рівню титрів специфічних антитіл у тварин першої групи з 8,60,24 log₂ до 7,20,37 log₂, а у тварин другої групи з 7,80,37 log₂ до 5,80,37 log₂, що може відбуватися в результаті зв'язування їх з антигеном та асиміляцією організмом. На 21 добу рівні титрів специфічних антитіл до вірусу ІРТ у биків двох дослідних груп підвищилися й дорівнювали 8,00,32 log₂ та 7,00,32 log₂. Треба відзначити, що зменшилася різниця рівней титрів специфічних антитіл у групах щеплених телят.

У телят першої групи через 7 діб після щеплення не було встановлено зміни рівня титрів антитіл, але вже на 14 добу він підвищився й дорівнював 10,30,75 log₂, а на 21 добу відповідно 11,50,5 log₂ (Р?0,01). Цей показник був піком фази гуморальної реакції “плато” й в подальшому відмічалося незначне зниження рівня антитіл, але він залишався на високому рівні (9,331,2 log₂-10,330,33 log₂) протягом терміну досліджень.

Друге щеплення не викликало зниження рівней специфічних антитіл у тварин другої дослідної групи, а їх значне підвищення в лог-фазі вторинної гуморальної відповіді з 7,00,32 log₂ до 9,330,88 log₂ свідчило про відсутність супресивної дії препарату. Подальшими дослідженнями було встановлено, що вже через 14 діб після щеплення настала фаза гуморальної відповіді “плато”, тобто стабілізації титрів специфічних антитіл до вірусу ІРТ, який підтримувався протягом послідуючих 2,5 місяців (термін досліду) на високому рівні 10,50,5 log₂ -11,50,5 log₂ (Р?0,05).

Встановлені характерні відміни в динаміці гуморальної відповіді телят, що були в стані персистентної інфекції (ІРТ), при щепленні імунізуючим препаратом проти герпесвірусної інфекції.

Вірусологічні дослідження, проведені з метою встановлення факту можливості активації персистуючого герпесвірусу 1 в організмі тварин при введенні препарату “Ритравак Б”, в РН та РІФ показали, що його введення не викликало реактивації вірусу ІРТ в організмі телят, а сприяло зниженню кількості продукуємого вірусу. Подальші вірусологічні дослідження вакцинованих телят підтвердили, що препарат “Ритравак Б” сприяє переходу персистентної герпесвірусної інфекції з динамічного стану в статичне.

Гематологічними дослідженнями встановлено, що введення препарату “Ритравак Б” телятам викликає значне підвищення лейкоцитарного індексу інтоксикації (ЛІІ), тобто активізує проліферацію сегментоядерних нейтрофільних гранулоцитів - рухливих високодиференційних клітин крові, котрі мобільно реагують на функціональні зміни в організмі й виконують фагоцитарну та бактерицидну функції. В подальшому (через 21 добу) зниження ЛІІ свідчило про активізацію ефекторного механізму гуморального імунітету.

Біохімічними дослідженнями в сироватках крові, відібраних від дослідних та контрольних телят до початку щеплення, був визначений рівень IgM, який склав 2,44-2,52 мг/см³, що перевищувало показник норми - 1,5 мг/см³. Цей факт, поряд з показниками серологічних досліджень, свідчив про активацію імунної системи телят. Рівень IgG був нижче норми (15 мг/см³) й дорівнював 14,0-14,58 мг/см³.

Після першого введення препарату “Ритравак Б” рівень IgM незначно зменшився, в той час як кількість IgG різко зменшилася до 12,28-12,4 мг/см³. IgG більш реактивні й продукуються в організмі зі швидкістю 28 мг/кг живої ваги на добу, тому їх значне підвищення протягом наступних 7-14 діб до рівня 15,12-15,49 мг/см³ у тварин обох дослідних груп співпадає з літературними даними й свідчить про імуногенну активність досліджуваного препарату.

Друге введення препарату викликало різке зниження протягом 14 діб рівня IgM до 1,94-2,06 мг/см³, а IgG до 10,7-11,3 мг/см³, але й підвищення їх рівня було стрімким і через 7 діб вони досягли максимальних значень. Високий рівень IgG та IgM через 1 місяць після завершення циклу імунізації був вірогідний (Р?0,05).

Показники рівня IgG та IgM у контрольних телят відрізнялись відсутністю значних коливань й утримувались протягом всього терміну досліджень приблизно на одному рівні: IgM 2,550,6-2,530,08 мг/см³, IgG 14,580,99- 14,50,46 мг/см³ .

Подальші (до 3 місяців, терміну досліджень) коливання вмісту імуноглобулінів по класах було незначним й склало: у тварин першої групи IgM 2,74-2,55 мг/см³, IgG 13,4-13,7 мг/см³; у тварин другої групи IgM 2,4-2,55 мг/см³, IgG 14,8-13,9 мг/см³, що характеризувало достатню імунологічну напруженість, викликану щепленням тварин.

Відмічені зміни концентрації вітаміну Е у крові телят дослідних груп. Після першого щеплення концентрація вітаміну Е значно знизилась через 7 діб у першій групі з 34,06,0 мг/см³ до 19,25,25 мг/см³, а у телят другої групи з 14,80,8 мг/см³ до 11,22,0 мг/см^3. Ця динаміка обумовлюється інтенсивним використанням вітаміну Е як внутріклітинного антиоксиданту, який захищає від окислення ліпідів й збереженості окислювально-відновлюваних реакцій організму. В подальшому, після другого введення препарату, було відмічено зростання вмісту загального токоферолу в тварин першої групи до 25,91,4 мг/см³, а в тварин другої групи до 20,50,47 мг/см^3., що може характеризувати стабільність внутрішнього гомеостазу організму.

Рівень циркулюючих імунних комплексів (ЦІК) через 7 діб після першого введення “Ритравак Б” підвищився в телят обох дослідних груп, але швидкість збільшення показників у тварин першої групи була вищою, й через 1 місяць після завершення щеплення, у порівнянні з початковим рівнем 0,19 мг/см³ досяг 0,22 мг/см³. Синтез ЦІК характеризував повноцінність імунологічної відповіді щепленого організму й нейтралізацію чужорідного генетичного агенту.

Встановлене нашими дослідженнями зниження IgG та IgМ після кожного введення “Ритравак Б” при збільшенні рівня ЦІК, свідчить що вони були активізовані в присутності еквівалентної кількості антигену та антитіл. Відзначено, що доза 100 млрд. мікробних клітин препарату “Ритравак Б” забезпечила більш стабільне підвищення показників ЦІК через 21 добу після введення (з 0,19 мг/см³ до 0,24 мг/см³) з подальшим зниженням до 0,22 мг/см³ протягом 14 діб. Цей факт свідчить, що препарат “Ритравак Б” імуногенний й неспроможний провокувати імунологічний конфлікт в організмі персистентно інфікованих вірусом ІРТ тварин.

Гістологічними дослідженнями встановлена спроможність препарату “Ритравак Б” активізувати первинні та вторинні лімфоідні органи. Встановлено, що дворазове щеплення препарату сприяє збільшенню утворення центрів розмноження в лімфатичних вузлах. Встановлене в гістологічних препаратах селезінки через 3 місяці після щеплення заповнення поверхні дендритних ретикулярних клітин лімфоцитами та макрофагами є посиланням для активізації детермінованих В-лімфоцитів, їх проліферації та диференціації для синтезу антитіл й накопичення їх в червоній пульпі. Таким чином, вивченням гістологічних зрізів лімфатичних вузлів, селезінки, тимуса телят при щепленні препаратом “Ритравак Б” встановлено, що реакція макрофагальних клітин відзначається вже через 7 діб після імунізації і зберігається до 3 місяців.

За результатами комісійних випробувань імунізуючий препарат “Ритравак Б” проти ІРТ ВРХ визнано нешкідливим, ареактогенним, імуногенним і рекомендовано для використання з профілактичною метою ВРХ з 20-денного віку при загрозі захворювання та для племінних тварин.

Розробка вакцини живої проти інфекційного ринотрахеїту ВРХ “ІРТ-LG”.

Нешкідливість штамів герпесвірусу 1 визначали на білих мишах. Були сформовані чотири групи білих мишей по 10 голів живою вагою 18-20 г. Вірусутримуючу рідину з дослідними штамами “ІРТ-LG”, “Молдавський”, “ТК” в титрах 10-^5,5 ТЦД₅₀ вводили білим мишам підшкірно по 0,2 см³. Штам “ІРТ-LG” не викликав місцевої запальної реакції та загибелі мишей протягом 10 діб спостереження. В дослідній групі тварин, де вводили штам “Молдавський”, загинуло 2 миші, а в групі тварин, імунізованих штамом “ТК”, загинуло на 7 добу 5 мишей. Штам “ТК” визначено патогенним, штам “Молдавський” слабопатогенним.

Штам герпесвірусу 1 “ІРТ-LG”, за показниками нешкідливий, ареактогенний, імуногенний, визначено претендентом до вакцинного.

Конструювання вакцини живої проти інфекційного ринотрахеїту великої рогатої худоби “IPT- LG”. З метою отримання максимальної репродукції герпесвірусу 1 штаму “ІРТ-LG” на перещеплюваній лінії культури клітин ТТ було визначено оптимальне сполучення живильного середовища, яке забезпечило вихід вірусу з титром інфекційної активності 6,5 lg ТЦД₅₀. Для визначення живильних властивостей використовували наступні живильні середовища: середовище Ігла; середовище 199; сироватка крові ВРХ без консерванту нативна виробництва “Конотопм'ясо” (м. Конотоп). До використання сироватку досліджували на наявність специфічних антитіл до герпесвірусу 1.

Були проведені досліди з введенням до сполучення живильного середовища для репродукції герпесвірусу 1 штаму “ІРТ-LG” на перещеплюваній лінії культури клітин ТТ “Геосену” (реєстраційний № 75 933.4, Наумець З.П.), який за біохімічними показниками, ростовими властивостями наближується до 0,5 % гідролізату лактальбуміна. Встановлено, що живильне середовище, утримуюче геосен та середовище 199 анапарантно, з додаванням 10 % сироватки ВРХ, було ефективним і забезпечило репродукцію герпесвірусу 1 штаму “ІРТ-LG” в титрі 5,5 lg ТЦД₅₀, що є достатнім рівнем для виробництва живого вакцинного препарату.

Визначення захисного середовища для ліофілізації вакцини живої проти ІРТ ВРХ “ІРТ-LG”. Ліофілізації піддівали вакцину живу “ІРТ-LG” у титрі 5,5 lg ТЦД_50. зі захисними середовищами: лецитин (0,1 %, 0,05 %), желатин (0,1 %, 0,5 %, 1,0 %), сахароза (5,0 %, 10,0 %, 20,0 %), геосен (50 %, 40 %, 30 %, 20 %, 10 %, 5 %), середовище Фрайя-Грейса (10 %, 5 %, 1 %).

За результатами дослідів найбільш ефективними захисними середовищами для ліофілізації вакцини живої “ІРТ-LG” визначено геосен до обсягу 30 %, середовище Фрайя-Грейса 5 % та 10 %, сахароза 10 %.

Визначення оптимального режиму ліофілізації вакцини живої проти ІРТ ВРХ “ІРТ-LG”. Вакцину живу “ІРТ-LG” з додаванням захисного середовища стерильно розфасовували у пеніцилінові флакони по 3 дози (6 см³), по 50 доз у флакони об'ємом 250 см³ (100 см³), по 100 доз у флакони обсягом 500 см³ (200см³). Пристінне заморожування проводили у два етапи в ролернім бункері НZ 12 (-50°С). Вакцину заморожували до температури мінус 17-22^оС протягом 60 хвилин, потім доморожували в субліматорі ліофілізаційної установки LZ 45.27 до температури мінус 48-52^оС протягом 5-12 годин. Швидкість заморожування 0,4-0,5єС в хвилину.

Ліофілізацію проводили при вакуумі 25 годин. Основне висушування вільної води проходило при температурі 36-40^оС протягом 25-30 годин. Опосередковано про це свідчили параметри опірності матеріалу, який з 27 ЕОМ через 26 годин досягав 100 ЕОМ, що характеризує мінімальну вологість у ліофілізованому матеріалі. В останні 4 години сушіння підігрів матеріалу до температури до 28-30°С здійснювали зі швидкістю 3-5єС в годину. Додавання захисного середовища до заморожуваної біосистеми знижувало крапку кристалізації гідратного шару води, в результаті чого зворотна денатурація ліпопротеінових комплексів не відбувалася. Режим ліофілізації забезпечив вихід вакцини в обсязі до 90 % зі збереженістю інфекційного титра 5,5 lg ТЦД₅₀.

Вивчення імуногенності вакцини живої “IPT-LG” у дослідах на лабораторних та сільськогосподарських тваринах. Згідно з наказом №7 Головного Державного інспектора ветеринарної медицини України від 26 лютого 1997 року була проведена комісійна перевірка “Вакцини живої проти інфекційного ринотрахеїту великої рогатої худоби “ІРТ-LG””.

Перевірку вакцини живої “ІРТ-LG” проводили на лабораторних тваринах - морських свинках (2 групи по 5 голів, вагою 300 г кожна) в умовах віварію ІЕКВМ, та сільськогосподарських тваринах - телятах (2 групи по 5 голів) в умовах ізольованого утримання на виробництві. Кров відбирали у морських свинок зі серця, в телят з яремної вени.

Встановлено, що введення вакцини сприяло синтезу специфічних до герпесвірусу 1 антитіл у морських свинок у титрах 2,4-3,8 log₂, у телят безмолозивних у титрі 6,4 log₂. За результатами проведеної комісійної перевірки зроблено висновок, що вакцина є імуногенною як для лабораторних, так і сільськогосподарських тварин.

Вивчення протективної дії вакцини живої проти ІРТ ВРХ “IPT-LG”.

З метою вивчення протективних властивостей вакцини живої “IPT-LG“ були проведені досліди з інфікування щеплених нею згідно з настановою щодо використання тварин епізоотичним штамом герпесвірусу 1 “4016”. Встановлено, що до щеплення в гурті тварин (телята 4-6 місячного віку) рівень специфічних до герпесвірусу 1 антитіл складав 9,0 log₂ при різниці рівней 7,0 log₂. Після вакцинації через 1 місяць у тварин титр специфічних антитіл дорівнював 10,5 log₂ при різниці рівней 2,0 log₂. Високий рівень специфічних до вірусу ІРТ антитіл у тварин реєстрували протягом 6 місяців, при цьому максимальним він був на 2-й місяць після вакцинації і досягав титру 10,8 log₂, на 3-й місяць - 10,1 log₂, на 5-й місяць - 9,7 log₂, на 6-й місяць - 8,6 log₂.

З дослідної групи тварин були відібрані 12 голів телят зі середнім рівнем специфічних до герпесвірусу 1 антитіл 7,2 log₂ й перевезені на експериментальну базу ІЕКВМ. Після 7-денної адаптації тварин, їм був введений внутрішньом'язово епізоотичний референтний штам герпесвірусу 1 “4016” в дозі 2 х 10^-6,0ТЦД_50.

Контрольним телятам (3 голови), завезеним із благополучного за ІРТ господарства, був введений штам герпесвірусу 1 “4016” в аналогічній дозі та методом.

Клінічними спостереженнями змін стану дослідних тварин характерних до ІРТ ВРХ не визначено, температура тіла тварин була нормальною (40,5С). Титр специфічних антитіл до герпесвірусу 1 в сироватках крові дослідних тварин через 7 діб складав 10,1 log_2. У телят контрольної групи через 5-14 діб відмічені характерні клінічні ознаки ІРТ ВРХ.

Встановлений факт свідчить, що вакцина жива проти ІРТ ВРХ “ІРТ-LG” має протективні властивості у відношенні до патогеннів штамів герпесвірусу 1, а титр специфічних до вірусу ІРТ антитіл 9,0 log₂ та вище є захисним й спроможний забезпечити епізоотичне благополуччя гурту тварин щодо цього захворювання протягом 6 місяців.

Комісійна апробація вакцини живої проти ІРТ ВРХ “IPT-LG”. На наступному етапі було проведено випробування вакцини жиої “ІРТ-LG” на телятах 8-місячного віку, які утримували в умовах експериментальної бази ІЕКВМ.

Серологічними дослідженнями встановлено, що у телят при рівні імунологічного фону специфічних до вірусу ІРТ антитіл у титрі 9,60,75 log2, після першого введення вакцини титр антитіл через 21 добу підвищився незначно - до 9,80,58 log2 (Р?0,01), а після другого введення він дорівнював 12,0 log2 (Р?0,01), який тримався протягом 3 місяців. У телят контрольної групи, яким вводили живильне середовище 199, рівень специфічних антитіл до вірусу ІРТ поступово знижувався з 8,50,29 log2 до 7,30,33 log2 протягом 1 місяця.

Вірусологічними дослідженнями за характерною ЦПД в моношарі культури клітин ТТ встановлена присутність герпесвірусу 1 в лімфатичних вузлах, слизовій оболонці хоан та легенях протягом 3 місяців. Вірус ІРТ ідентифікували в реакції нейтралізації на культурі клітин ТТ з комерційними гіперімунними сироватками ІРТ.

Була проведена титрація окремих ізолятів із лімфатичних вузлів (через 21 добу після вакцинації) й встановлено, що вірус ІРТ репродукувався в титрі 10^-2,5-10 ^_3,25ТЦД₅₀. За літературними даними, інфекційна активність герпесвірусу 1 на такому рівні характерна для імунологічної регуляції персистентної інфекції й не викликає загострення або ознаків клінічного перебігу ІРТ.

Визначено, що у телят контрольної групи, які були в контакті з вакцинованими (разом утримувались на пасовищі), протягом досліду реєстрували в РІФ антиген вірусу ІРТ з проб слизової оболонки хоан. Але протягом усього досліду герпесвірус 1 не було ізольовано з внутрішніх органів, що свідчить про відсутність інфікування й опосереднено підтверджує безпечність використання вакцини живої “ІРТ-LG” у виробничих умовах.

Гематологічними дослідженнями був визначений лейкоцитарний індекс інтоксикації (ЛІІ) у телят дослідної та контрольної групи. Встановлення у щеплених телят зниження ЛІІ та стабільному утриманні його на низькому рівні свідчило, що вакцина жива “ІРТ-LG” сприяє синтезу в крові імунокомпетентних клітин ефекторного ланцюга імунного захисту.

Біохімічними дослідженнями встановлено, що у телят, щеплених вакциною живою “ІРТ-LG”, через 7 діб рівень IgM незначно знизився з 2,550,08 мг/см³ до 2,50,06 мг/см³, але на 21 добу досяг максимальних показників 2,780,04 мг/см³. У цей період було проведено друге щеплення, й рівень IgM знизився через 7 діб до 2,350,07 мг/см³, а потім підвищився через 21 добу до 2,60,09 мг/см³. Через 1 місяць після завершення вакцинації рівень IgM знизився до рівня показників у тварин контрольної групи 2,50,2-2,530,08 мг/см³.

При визначенні IgG встановлено, що на 7-й день після вакцинації він знизився з 14,670,85 мг/см³ до 13,630,67 мг/см³, в той час як в контрольній групі тварин протягом всього терміну досліду він утримувався на досить стабільному рівні 14,50,99-15,041,2 мг/см³.

Максимальних показників рівень IgG досяг на 21 добу після першого введення вакцини й дорівнював16,030,3 мг/см³ (Р?0,01). Після другого щеплення кількість IgG протягом 14 діб знижалася й досягла рівню 10,11,2 мг/см³, що свідчить про активну нейтралізацію антигену специфічними антитілами.

Рівень ЦІК після першого введення вакцини живої “ІРТ-LG” через 7 діб не змінився у порівнянні з показником до щеплення й дорівнював 0,240,02 мг/см³, а через 21 добу було відмічено незначне зниження його рівня до 0,200,01 мг/см³, що співпадало з підвищенням рівню IgG та IgM. Через 21 добу після завершення вакцинації рівень ЦІК зменшився до 0,180,006 мг/см³, та в подальшому протягом 21 доби підвищувався до 0,270,75 мг/см³ .

Відмічено зниження через 21 добу після кожного введення вакцини кількості вітаміну Е у щеплених тварин на 6,6-5,4 мг/см³ у порівнянні з контрольними, де рівень загального токоферолу підвищився після вакцинації на 0,4 мг/см³. Цей факт обумовлюється більш інтенсивним використанням антиоксиданту (вітаміну Е) у щеплених тварин .

Встановлена динаміка змін кількості IgМ та IgG характеризувалася протягом 7-14 діб зменшенням рівня після введення вакцини живої “ІРТ-LG” з послідуючим зростанням рівня IgG, як високо спеціалізованих антитіл вторинної імунної відповіді, що свідчить про високі імуногенні властивості вакцини. Імунологічна напруженість щеплених телят у періоди зменшення рівня імуноглобулінів у крові в перші доби після щеплення вакцини живої “ІРТ-LG” забезпувалась підвищенням кількості імунних комплексів, спроможних позитивно впливати на протективний захист тварин при герпесвірусній інфекції.

Гістологічними дослідженнями через 7 діб після вакцинації встановлена значна активізація реактивних центрів у селезінці, міграція та заповнення лейкоцитами червоної пульпи є передумовою для їх диференціації в плазматичні клітини. Через 3 місяці після вакцинації в селезінці було зафіксовано в області червоної пульпи значне збільшення кількості лімфоцитів та плазматичних клітин. Встановлені морфофункціональні зміни імунокомпетентних органів у щеплених вакциною живою “ІРТ-LG” телят свідчать про відсутність імунодепресивного впливу препарату.

Державною комісією зроблено висновок, що вакцина жива проти ІРТ ВРХ “ІРТ-LG” є нешкідливим, нереактогенним, специфічним, високоімуногенним препаратом, здатним у стаціонарному осередку інфекції в організмі щеплених тварин ініціювати синтез специфічних до вірусу ІРТ антитіл на захисному рівні.

Впровадження розроблених засобів діагностики та активної імунізації у системі заходів із боротьби та профілактики ІРТ ВРХ.

Хронічний перебіг ІРТ ВРХ. У господарствах Хмельницької області, в яких нашими дослідженнями був встановлений стаціонарний осередок інфекції, була використана вакцина жива “ІРТ-LG” згідно з настановою. Через 2 місяці після проведення щеплення при епізоотологічному обстеженні та серологічних дослідженнях проб від ВРХ встановлено, що вже після першої вакцинації титри специфічних антитіл до герпесвірусу 1 у тварин продуктивного гурту підвищились й мали мінімальну (2-3 log₂) різницю титрів антитіл; у корів титр специфічних антитіл до вірусу ІРТ склав 10,2 log₂, а у телят - 6,5 log₂. За даними пункта штучного запліднення після щеплення вакциною живою “ІРТ-LG” у продуктивного маточного поголів'я не спостерігалися клінічні ураження, характерні для ІРТ ВРХ. За даними зоотехнічної служби району перегули корів дійного стада зменшились з 85 % до 45-50 %. Зареєстровано зменшення та зникнення загострення перебігу респіраторного синдрому ІРТ ВРХ у телят. Господарства провели 4 щеплення вакциною живою “ІРТ-LG” протягом 2 років й перешли до використання імунізуючого препарату “Ритравак Б” з профілактичною метою.

Ефективність вакцини живої “ІРТ-LG” при імунізації корів (6-7 місяць тільності) визначили за наявністю високого рівня колостральних специфічних антитіл до вірусу ІРТ у телят до 10-добового віку (до 5 log₂), які випоювалися молозивом вакцинованих матерів.

За результатами досліджень встановлено, що у стаціонарному осередку ІРТ, при загостренні перебігу захворювання, вакцина жива “ІРТ-LG”, спроможна активізувати синтез специфічних до вірусу ІРТ антитіл на рівні 8,0-10,0 log₂. Важливо відзначити, що при ремісії захворювання на ІРТ з ознаками клінічного перебігу в стаді невакцинованих тварин, реєструються проби крові з титрами антитіл у сироватці від негативних до 12,0 log₂. Систематичне використання вакцини живої “ІРТ-LG” позитивно впливає на стабілізацію епізоотичної ситуації з ІРТ ВРХ в господарствах, які були стаціонарними осередками інфекції.

Встановлено, що при порушенні виконання системи з боротьби та профілактики ІРТ (перегрупування тварин, невчасна ревакцинація, використання спермодоз контамінованих антигеном вірусу ІРТ, не випоювання телятам молозива в перші 2 доби) перебіг ІРТ може проявитися клінічно в генітальній формі у теличок до 20-денного віку.

Особливе значення щодо ефективності здійснених протиінфекційних засобів при герпесвірусній інфекції має систематичність виконання заходів боротьби та профілактики ІРТ ВРХ. Нами проводилося епізоотологічне обстеження господарств Овідіопільського району Одеської області з причини перегулів тварин із клінічним проявом вагінітів і ендометритів у корів. За результатами проведених лабораторних досліджень патматеріалу в РН та встановлення стаціонарності осередку інфекції, була рекомендована та використана вакцина жива “ІРТ-LG”.

У результаті проведених нами заходів після закінчення щеплень через 18-20 тижнів клінічний прояв генітальної форми ІРТ у корів знизився на 90 %. Загибелі телят з клінічним проявом респіраторної форми ІРТ не відмічено. В подальшому при дотриманні схеми вакцинації відмічена відсутність клінічного прояву ІРТ ВРХ, підвищення збереженості молодняка на 9%, вихід телят на 100 корів 89%, також відмічено зниження захворюваності телят респіраторними хворобами на 75 %, нормалізацію відтворної функції у корів, зниження кількості вибракування корів.

За результатами ветеринарної звітності районного підприємства ветмедицини і зоотехнічної звітності фахівців господарств Овідіопільського району Одеської області, проведеними клінічними і серологічними дослідженнями контрольованого поголів'я ВРХ встановлено, що застосування вакцини живої “ІРТ-LG” у виробничих умовах у стаціонарному вогнищі інфекції сприяє припиненню клінічного прояву захворювання; забезпечує підвищення на 15-20 % кількість тварин, що приходять в охоту; забезпечує синтез специфічних антитіл при внутрішньом'язовому введенні вакцини 1-10-денним телятам у титрі до 9,0 log₂, у дорослих тварин до 12 log₂ з різницею рівнів антитіл 1-3 log₂.

Загострення перебігу ІРТ ВРХ при ввезенні імпортного поголів'я. Аналізуючі результати проведеної роботи в господарстві Дніпропетровської області Синельниківського району, де вводилось до гурту ВРХ імпортне поголів'я, було встановлено, що спалах і загострення захворювання ІРТ відбулося внаслідок надходження худоби, приховано інфікованої герпесвірусом 1. За даними лабораторних досліджень був підтверджений діагноз ІРТ ВРХ і враховуючи стаціонарність осередку інфекції та загострення захворювання, проведено щеплення вакциною живою “ІРТ-LG” до припинення клінічного прояву захворювання й відтворення продуктивності тварин. Також проводили регулярний серологічний контроль поголів'я для встановлення напруженості імунітету до герпесвірусу 1 та до вірусів ПГ-3 й ВД.

У господарстві планово і систематично проводились заходи із боротьби й профілактики ІРТ ВРХ згідно з розробленими рекомендаціями лабораторії вивчення вірусних хвороб молодняка ІЕКВМ. Це забезпечило зниження клінічного (генітального та респіраторного) прояву захворювання як у дорослих тварин, так і у молодняка з 47% до 23%; забезпечило збереженість молодняка до 99 %; середньодобовий приріст збільшився з 429 г до 471 г; сприяло підвищенню продуктивності корів до 5200 кг молока на одну фуражну корову, в тому числі в корів голштинофризької породи до 9200 кг; підвищенню рентабельності виробництва молока з 38 % до 47 %; сприяло встановленню стабільності епізоотичної ситуації з ІРТ ВРХ і дозволило в подальшому перейти до застосування імунізуючого препарату “Ритравак Б”. За даними показників ефективності господарства у 2001 році рентабельність виробництва молока зросла до 72 %, а захворюваність ВРХ на ІРТ скоротилася до 5 %.

Протягом 1999-2001 років в цьому господарстві нами проводилась науково-виробнича робота за участю спеціалістів господарства й була розроблена та впроваджена схема активної імунізації новонароджених телят проти ІРТ імунізуючим препаратом “Ритравак Б”. Використання препарату “Ритравак Б” інтраназальним та пероральним методом введення, передбачаючим можливі шляхи передачі та інфікування герпесвірусами, дозволило профілактувати ІРТ серед молодняку ВРХ, отримувати для відтворення стад здорового поголів'я телят, вирощування та відгодівля яких рентабельна у товарно-промислових тваринницьких господарствах.

Перебіг ІРТ в племенному господарстві. Позитивний досвід використання препарату “Ритравак Б” був отриманий у племзаводі ВРХ Чернигівської області. Тварин товарного гурту ВРХ, неблагополучних з ІРТ, рекомендовано було щепити вакциною живою „ІРТ-LG” (ТУУ 46.15.293-98). Враховуючи заборону продажу та використання інфікованої сперми як в господарстві, так і за його межами, позитивні серії проб сперми були вилучені та знищені, усі бики племзаводу щеплені препаратом “Ритравак Б” (ТУУ 46.15.386-99).В результаті досліджень через 6 місяців встановлено, що у биків, щеплених препаратом “Ритравак Б”, рівень специфічних до вірусу ІРТ антитіл був у титрі 7 log₂. Дослідженнями серій сперми биків, скомпрометованих щодо ІРТ, в РІФ позитивних проб не було виявлено.