Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Мінливість геному буряків (Beta Vulgaris L.) за інбридингу та в культурі in vitro

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня доктора біологічних наук

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Створення сортів і гібридів буряків, що поєднують високу продуктивність, технологічні якості та стійкість до стресових чинників довкілля, ґрунтується на поглибленому дослідженні генофонду цієї стратегічної для України культури. Більшість сучасних сортів і гібридів створено на близькоспоріднених матеріалах, вони характеризуються звуженою генетичною основою і тому мають ряд суттєвих недоліків. Запобігти цьому можливо, залучаючи у селекційний процес різноманітні форми в якості донорів генетично обумовлених ознак, зокрема самозапильні лінії. Для цього створюються колекції інбредних ліній на основі яких проводиться пошук форм з практично - цінними характеристиками.

Мінливість геному за інбридингу у буряків виявлена на різних рівнях досліджень - морфологічному, цитологічному, біохімічному, молекулярному [Шевцов, 1983; Буренин, Пивоваров, 1998; Малецкий, Колодяжная, 1999; Сubo et al., 1999]. Генетичне вивчення інбредних ліній буряків, отриманих на різних матеріалах, дозволило виділити ряд нових морфологічних мутацій листкового апарату [Кондратенко и др., 1988; Сейлова, Джексимбиев, 1992; Мглинец, 1992; Парий, 1993]. Визначення спадкових змін, які виникають за інбридингу, має не тільки теоретичне значення для розширення наших уявлень про генетичний потенціал даної культури, але й практичну значимість. Зокрема, для використання у гетерозисній селекції значну цінність представляють інбредні лінії з маркерними морфологічними ознаками, які дозволяють контролювати спрямовані схрещування, спростити генетико-селекційний процес. Проте, самозапильних ліній, які легко визначаються за спадковими ознаками, пов'язаними, у першу чергу, з особливостями архітектоніки рослин буряків і фенотипічно стабільних протягом онтогенезу, недостатньо. У зв'язку з цим, ідентифікація нових морфологічних ознак, встановлення їх генетичного контролю та кореляції з господарськими показниками є актуальним як для практичної селекції буряків, так і для подальшого розвитку спеціальної генетики даної культури.

Оскільки буряк перехреснозапильна, гетерозиготна та дворічна рослина, то, використовуючи методи класичної селекції, на створення нових сортів та гібридів потрібно не менше 12 - 16 років. У зв'язку з цим, все більш гостро постає питання пошуку нових нетрадиційних підходів та методів, які б дозволили створити у більш стислі терміни новий селекційний матеріал. Значне місце в генетичних дослідженнях буряків відводиться використанню клітинних технологій. Отримані практичні результати з клітинної селекції на стійкість до абіотичних та біотичних стресових чинників, сомаклональної мінливості, генетичної інженерії [Свирщевская, Бормотов, 1994; Stanys, 1996; Зубенко та ін., 1997; Saunders, Tsay, 1999; Vandenbusshe et al., 2000] свідчать про можливість використання біотехнологічних підходів для розширення генетичного потенціалу культурних буряків та поліпшення існуючих генотипів за багатьма параметрами.

Ці напрямки застосування потребують поглибленого дослідження геномної мінливості соматичних клітин, які вирощують в умовах ізольованого росту. На сьогодні ще недостатньо відомостей про мінливість геному буряків in vitro та впливу умов культивування на спадковий апарат клітин. Відсутні дані про типи, спрямованість та глибину змін, які відбуваються за тривалого культивування калюсних культур. Практично не досліджені питання геномної мінливості, яка виникає за дії абіотичних та біотичних стресових чинників та їх комплексу у процесі добору стійких форм. Дослідження, спрямовані на вивчення даних проблем є актуальними і значимими, оскільки орієнтовані на розширення можливостей біотехнологій буряків і підвищення їх ефективності.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. В основу роботи покладено результати, отримані автором при виконанні розділів планів наукових досліджень за бюджетними темами відділу генетичних основ гетерозису Інституту фізіології рослин і генетики НАН України: «Дослідження генетичних проблем продуктивності рослин та використання гетерозису у буряків» (№ держ. реєстрації 0287.0040199 1991-1996 рр.), «Вивчити генетичні особливості вихідного матеріалу цукрових і кормових буряків та засоби підвищення ефективності його використання» (№ держ. реєстрації 0199U000410 1997-2001 рр.), «Використання гетерозису та поліплоїдії для реалізації генетичного потенціалу при створенні нових гібридів буряків» (№ держ. реєстрації 0323U000199 2002-2006 рр.); Державного фонду фундаментальних досліджень: «Виявити закономірності структурних змін ядерного апарату рослин в залежності від ефекту гетерозису» (№ проекту 5.76, 1992-1994 рр.), «Виявлення механізмів спадковості нових генів-маркерів у цукрового буряка» (№ проекту 5.104, 1992-1994 рр.), «Виявлення механізму генетичної мінливості каріотипів та закономірності утворення в умовах in vitro сомаклонів Beta vulgaris L.» (№ проекту 5.3/54, 1994-1995 рр.); ДНТП Міністерства освіти і науки України: «Створити за допомогою методів селекції in vitro нові лінії буряків, стійкі до комплексу стресових факторів довкілля» (№ держ. реєстрації 01030007505 2003-2006 рр.).

Мета і завдання досліджень. Метою роботи було встановлення особливостей мінливості геному буряків за інбридингу і в культурі in vitro та можливостей її практичного використання для створення вихідного селекційного матеріалу.

Для досягнення зазначеної мети були поставлені наступні основні задачі:

· провести аналіз колекції самозапильних ліній буряків за морфогенетичними характеристиками. Виділити нові морфологічні ознаки рослин, встановити їх генетичну детермінацію та з'ясувати можливість використання цих ознак у генетико-селекційних дослідженнях; провести порівняльну оцінку генотипів мутантних ліній за певними ферментними локусами;

· розробити ефективну систему мікроклонального розмноження буряків для прискореного тиражування цінного генетичного матеріалу;

· дослідити особливості цитогенетичної мінливості та з'ясувати закономірності геномних змін у клітинних популяціях калюсних культур буряків у процесі тривалого культивування;

· провести аналіз хромосомної мінливості та характеру ензиматичного метилування цитозину паліндромних послідовностей ДНК у калюсних культур з різним регенераційним потенціалом;

· визначити залежність ступеня мінливості рослин-регенерантів від тривалості культивування калюсів in vitro; проаналізувати сомаклональну мінливість рослин-регенерантів цукрових буряків за ознакою стерильності пилку;

· дослідити особливості впливу біотичних і абіотичних стресових чинників (токсину збудника бактеріозу, сульфатних та хлоридних солей, низької температури) та їх комплексу на генетичну структуру популяцій калюсних клітин кормових буряків та рівень плоїдності рослин - регенерантів.

Об'єкт досліджень - мінливість геному буряків за інбридингу та в культурі in vitro.

Предмет досліджень - спадкова мінливість самозапильних ліній за морфологічними та біохімічними ознаками; особливості реалізації сомаклональної та індукованої стресовими чинниками мінливості серед калюсних культур та рослин - регенерантів цукрових та кормових буряків.

Методи досліджень. Рослини різних генотипів вирощували в умовах поля та теплиці при застосуванні примусової ізоляції та контрольованого запилення. Рослини-регенеранти (R₀) культивували в умовах світлових кімнат, вегетативних посудинах та в польових умовах.

Методи гібридологічного аналізу використано для встановлення генетичної детермінації нових морфологічних ознак буряків та аналізу природи стерильності регенерантів.

Для з'ясування генотипів мутантних ліній за ферментними локусами використано метод електрофоретичного розділення білків у крохмальному гелі.

Цитологічний та проточної цитометрії методи застосовані для виявлення генетичної гетерогенності клітинних популяцій in vitro та рослин - регенерантів.

Для дослідження сайт-специфічності метилування цитозину використано методи рестрикційного аналізу та електрофорезу ДНК в агарозному гелі.

Метод мікроклонального розмноження застосовували для прискореного відтворення цінного селекційного матеріалу.

Для отримання форм, стійких до абіотичних та біотичних стресових чинників використовували методи прямої та ступінчастої клітинної селекції.

Методи статистичної обробки використано для аналізу експериментальних даних.

Наукова новизна. Виявлено 12 нових мутантних морфологічних ознак буряків, які проявляються на різних фазах онтогенезу рослин, та для 7 з них встановлена генетична детермінація. Показано, що вперше виділена моногенна домінантна ознака культурних буряків - опушеність листкових пластинок - є чіткою сигнальною ознакою для ідентифікації гібридів на різних етапах онтогенезу рослин. З'ясовано, що генотипи, які мають максимально виражений характер прояву ознаки, є повними закріплювачами стерильності для чоловічостерильних форм різного походження.

Розроблено комплекс біотехнологічних прийомів, який дозволив удосконалити метод прямої регенерації пагонів із тканин вегетативних органів рослин буряків і репродукувати у чистоті генетично - цінний селекційний матеріал. Це збільшує у 2-3 рази кількість регенерантів на один експлант та прискорює розмноження рослин.

Вперше проведено порівняльне цитогенетичне дослідження калюсних культур цукрових та кормових буряків, отриманих від експлантів рослин різного рівня плоїдності, за їх тривалого культивування на живильних середовищах та виявлено цитогенетичні закономірності геномних змін при становленні калюсних ліній. Показано конвергентний тип еволюції генетичної структури клітинних популяцій за однакових умов вирощування калюсних штамів. Виявлена неоднакова швидкість становлення генетичної структури клітинних популяцій у калюсів, отриманих від експлантів рослин різного рівня плоїдності.

Вперше здійснено комплексну оцінку генетичної стабільності калюсних культур на ранніх етапах культивування і виявлено особливості цитологічних та молекулярно-генетичних змін у форм з різною регенераційною здатністю. Дістало подальший розвиток уявлення про участь ензиматичної модифікації цитозину в механізмах клітинної диференціації еукаріот. Показано, що метилування ДНК має поліфункціональний ефект у геномі кормових буряків і може розглядатися як епігенетичний та мутагенний чинник у процесах органогенезу in vitro.

Вперше виявлені етапи мікроклонування (калюсні культури 9-10-го пасажів), на яких генетична мінливість може бути з більшою ефективністю використана для отримання рослин з широкою генетичною варіабельністю як вихідний матеріал для генетико-селекційних досліджень. Показано, що чоловіча стерильність, яка виникає у рослин-регенерантів буряків, може мати різну обумовленість.

Вперше на цитологічному рівні досліджена реакція клітин калюсних культур буряків на абіотичні і біотичні стресові чинники. Вивчено цитогенетичні процеси адаптації, які проявляються в змінах генетичної структури клітинних популяцій, зокрема, в змінах числа хромосом. Встановлено, що резистентні до стресових чинників калюсні лінії характеризуються наявністю генетичного гомеостазу, який виявляється постійним рівнем структурних перебудов хромосом та плоїдності клітин. Експериментально доведено, що цитогенетичні зміни представляють один із можливих механізмів, які залучаються до набуття стабільної резистентності культивованих клітин буряків до стресових чинників.

Вперше встановлено відмінності у цитологічних спектрах регенерантів буряків, отриманих із резистентних до різних стресових чинників калюсів. Наукова новизна підтверджена трьома патентами на винаходи.

Практичне значення одержаних результатів. Виділено генетичні джерела з високою закріплюючою здатністю та донори господарсько-корисних ознак, які поповнюють генофонд буряків. Нові гени, алелі та генні комбінації є основою для створення ефективних засобів поліпшення селекційних матеріалів даної культури. Зокрема, гени опушення листкової пластинки можуть бути використані для одержання батьківських форм гібридів з маркерними ознаками, для контролю генетичної чистоти компонентів схрещування і контролю стерильності. Використання ознаки детермінантного росту квітконосних пагонів у практичній роботі дозволяє отримувати матеріали з підвищеною насіннєвою продуктивністю та якістю насіння, що відповідають вимогам інтенсивних технологій вирощування буряків. Одержано вихідний матеріал для створення закріплювача цитоплазматичної чоловічої стерильності цукрових буряків з двома маркерними ознаками - опушеністю листкових пластинок та детермінантним габітусом насінника.

Обґрунтовано та запропоновано до практичного використання в селекційному процесі низку розробок: Деклараційний патент України №59136А - спосіб контролю гібридності рослин цукрових буряків, Деклараційний патент України №59137А - спосіб створення закріплювачів стерильності цукрових буряків, Деклараційний патент України №59138А - спосіб створення міжлінійних гібридів цукрових буряків.

Розроблена система мікроклонального розмноження дозволяє підвищити коефіцієнт розмноження та скоротити період отримання селекційно-цінних рослин буряків.

Одержані результати вносять вклад у розробку генетичних основ клітинної селекції буряків. Матеріали дисертації можуть представляти інтерес для наукових закладів генетико-селекційного напрямку та бути використані при викладанні генетики і біотехнології рослин у вузах.

Особистий внесок здобувача. Результати досліджень, представлені у дисертації, одержано автором роботи у відділі генетичних основ гетерозису Інституту фізіології рослин і генетики НАН України. Автором особисто досліджені цитологічні, біохімічні та молекулярно - генетичні особливості експериментального матеріалу; розроблено систему мікроклонування рослин. Здобувач самостійно здійснила аналіз, інтерпретацію та узагальнення отриманих результатів, запропонувала шляхи впровадження результатів досліджень у генетико-селекційний процес. Автор приймала безпосередню участь у розробці програм досліджень, проведенні лабораторних та польових досліджень. Окремі експерименти та аналізи виконано спільно зі співробітниками відділів генетичних основ гетерозису та генетичної інженерії ІФРГ НАН України, молекулярно-генетичних досліджень Інституту агроекології і біотехнології УААН. Ці дані викладено в спільних публікаціях, авторство здобувача в яких складає 40-90%.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації були представлені та доповідались на VII з'їзді Українського товариства генетиків і селекціонерів (Крим, 2002); V з'їзді товариства фізіологів рослин Росії (Пенза, 2003); IV Міжнародній нараді з каріології та систематики рослин (Санкт-Петербург, 1999); III з'їзді ВТГіС (Москва, 2004); І Міжнародній конференції

«Молекулярная генетика и биотехнология» (Минск, 1998), Міжнародній конференції «Молекулярная генетика, геномика и биотехнология» (Минск, 2004); ІІ International Symposium on Plant Biotechnology (Kyiv, 1998); Науковій конференції «Генетично модифіковані рослини: перспективи та проблеми» (Київ, 2002); IV International Сonference «Plant genome» (Odessa, 2003); VIII International Conference «The Biology of Plant Cells in vitro and Biotechnology» (Saratov, 2003); XIV Congress of the Federation of Europen Societies of Plant Biology (Cracow, 2004); IV International Iran and Russia Conference in Agriculture and Natural Resources (ShahreKord, 2004); Міжнародній науково-практичній конференції, присвяченій пам'яті професора С.І. Лебедєва «Прийоми підвищення врожайності рослин: від продуктивності фотосинтезу до сучасних біотехнологій» (Київ, 2003); First Ukrainian Congress for Cell Biology (Lviv, 2004); Міжнародній конференції, присвяченій 100-річчю наукової селекції у Росії (Москва, 2003). Матеріали дисертації доповідались на науково-теоретичних семінарах Інституту фізіології рослин і генетики НАН України та Інституту молекулярної біології і генетики НАН України.

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 52 наукові роботи. З них: 1 монографія, 1 глава у монографії, 23 статті у провідних фахових виданнях та 3 патенти України.

Обсяг та структура дисертації. Дисертація викладена на 375 сторінках машинописного тексту, складається з вступу, 6 розділів, узагальнення, висновків та списку посилань (504 джерела). Робота містить 61 таблицю та 58 рисунків.

Основний зміст роботи

калюсний буряк геном ний цитогенетичний

Огляд літератури

В огляді літератури розглянуто сучасний стан досліджень спеціальної генетики буряків. Узагальнено відомості стосовно генетичної та епігенетичної мінливості, яка спостерігається за інбридингу. Детально висвітлені причини і механізми змін геному рослин в культурі in vitro. Значна увага приділена особливостям мінливості геному в клітинних популяціях in vitro та сомаклональної варіабельності рослин - регенерантів.

Матеріали і методи досліджень

Матеріалом досліджень була колекція самозапильних ліній буряків, створена у відділі генетичних основ гетерозису ІФРГ НАН України. Використовувались також диплоїдні однонасінні чоловічостерильні форми (ЧС-86, ЧС-2291, КС0081), багатонасінні тетраплоїдні запилювачі (№153 4хММ, №208 4хММ, №311 4хММ) цукрових буряків, отримані у вищезгаданому відділі. У дослідження залучались: диплоїдні однонасінні чоловічостерильні форми кормових буряків (ЧС-49-1, ЧС - 1029) (фірма «КВС», Німеччина); закріплювач стерильності О-типу цукрових буряків КС0086 (ІЦБ УААН); триплоїдні гібриди - Каварось, КВ-Ялтушків, Аррата; сорти цукрових - Білоцерківський однонасінний 45, Індустріальний, Рамонська 023 та кормових буряків - Київський, Урсус, Панфільська.

Для отримання F₁ схрещування батьківських форм проводили в умовах теплиці та поля із застосуванням целофанових і б'язєвих ізоляторів, відповідно. В якості альтернативних форм при вивченні генетичної природи нових морфологічних ознак використовували генотипи з ЦЧС або лінії, що не мали досліджуваної ознаки. Друге гібридне покоління отримували за допомогою групових ізоляторів або на ізольованих клумбах при вільному запиленні рослин.

Для введення в культуру in vitro використовували зріле насіння буряків. Проростки, отримані з насіння, вирощували на модифікованих живильних середовищах ДС-2 [Doley, Sounders, 1989] та МС-2 без фітогормонів [Murashige, Skoog, 1962]. Калюсну тканину отримували на модифікованих живильних середовищах МС, ДС та РВ [Freytag et al., 1988]. Для індукції калюсу використовували різні регулятори росту - БАП, 2,4 - Д, НОК у концентраціях 0,01- 2 мг/л. Подальше культивування отриманих калюсних культур здійснювали на середовищах ДС та МС. Еспериментальний матеріал вирощували при освітленні 3-4 клк з 16-годинним фотоперіодом і температурі 24 2 С.

Цитогенетичний аналіз здійснювали, виключаючи передфіксаційний вплив на мітоз. Готували тимчасові давлені препарати за стандартною методикою (Паушева, 1988). Частоту та типи хромосомних перебудов визначали паралельно з підрахунком числа хромосом в клітинах. Для вивчення рівня плоїдності рослин використовували автоматичний аналізатор «Partec» (Німеччина).

Для створення стійких до засолення клітинних ліній буряків як селективні агенти було використано хлорид та сульфат натрію. Як біотичний стресовий чинник застосовували токсин збудника бактеріозу (Pseudomonas syringae pv. аptata) у сублетальній концентрації 4 мг/л. Температурну обробку калюсу здійснювали за наступних режимів: загартування при 2-6°С від 7 до 14 діб; обробка негативними температурами -2 та -5 С з експозицією від 1 до 21 години.

Основним методом дослідження ізоферментів було електрофоретичне розділення екстрактів білків у крохмальному гелі з наступним специфічним гістохімічним забарвленням (Левитес, 1986).

РНК виділяли за певних модифікацій методу [Маниатис и др., 1984]. Для отримання високомолекулярної ДНК рослин та калюсних культур буряків використовували суттєво модифікований метод Деллапорта [Дрейпер и др., 1991]. Кожну партію очищеної ДНК тестували на присутність інгібіторів ферментів рестрикції шляхом спільного гідролізу з ДНК бактеріофага л.

Концентрацію ДНК та РНК визначали спектрофотометрично на спектрофотометрі М-40 («Carl Zeiss», Німеччина). Електрофорез гідролізованої ДНК проводився в 0,8% та 2%-ному агарозних гелях при напрузі 3-4 в/см протягом 3-6 годин. В якості джерела струму використовували прилад «LKB BROMMA» (Швеція).

Матеріал документували шляхом мікрофотографування за допомогою мікрофотонасадки МФН-11 з фотокамерою «Зеніт» на плівку «Мікрат-200». Використовували мікроскоп «Amplival» («Carl Zeiss», Німеччина). Після проведення електрофорезу гелі фотографували на плівку «Мікрат-300» за допомогою трансілюмінатора «CHROMA 43» («Helling», Німеччина). Для фотографування також було використано цифрову фотокамеру «Benq DC2300».

Експериментально отримані дані обробляли за допомогою методів статистичного аналізу [Рокицкий, 1974].

Нові морфологічні мутації буряків, їх генетичний аналіз та можливості використання в селекції

У результаті фенологічного аналізу колекції самозапильних ліній цукрових буряків за індивідуальними ознаками було виділено 11 диплоїдних ліній 3-5-го поколінь інбридингу, що мали морфологічні особливості, які не зустрічалися серед рослин культурних буряків.

На сорті Межотненська 080 отримано лінію 8-29 (I₄), рослини якої характеризуються незвичайною нервацією листкових пластинок, яку ми назвали «паралельним жилкуванням листків». Серед ліній, закладених на матеріалах голландської селекції, виділено лінію 140-19 (I₅) з вкороченими та потовщеними черешками. Серед матеріалів, отриманих на сорті Арімона, виявлено дві лінії - 205-4 (I₄) та 205-18 (I₄). Рослини лінії 205-4 мали листкові пластинки у яких на ранніх стадіях розвитку припиняється ріст центральної жилки, внаслідок чого відбувається роздвоєння верхівки листка, що робить його схожим на лист гінкго. На більш пізніх стадіях у рослин цієї лінії відмічено зростання двох черешків та листкових пластинок до 2/3 їх довжини, а також зменшення кількості провідних пучків. У рослин лінії 205-18 гіпокотиль, черешки та центральні жилки листків мали яскраво-червоне забарвлення.

Серед форм, отриманих на сорті Веселоподолянська 038, виділено лінію 97-304 (І₄), яка має розпластану розетку, подовжений тонкий черешок та ромбоподібну форму листкової пластинки. Серед 56 ліній, закладених на сортах Верхняцької селекції, виявлено лінію 117-71 (I₃), представлену рослинами, відмінною особливістю яких є стислість молодих листочків та гачкоподібна загнутість їх верхівок до центру розетки.

На церкоспоростійких матеріалах Первомайської селекційної станції отримано чотири мутантні лінії (15-28-I₄, 15-47 - I₅, 15-54 - I₄ та 15-96 - I₃) з незвичною для культурних буряків ознакою, а саме: опушеністю листкових пластинок. Вона починає виявлятися вже на стадії двох пар справжнього листя і зберігається протягом всього онтогенезу. За характером прояву ознаки мутантні рослини поділяються на 4 типи. До першого типу належать рослини, листя яких вкрите великою кількістю довгих, прямостоячих, щільно розташованих ворсинок. Другу групу складають рослини з трихомами, що знаходяться під кутом 60-80° до поверхні листка, кількість яких значно менша порівняно з рослинами першого типу. Рослини з третім типом опушеності мають короткі ворсинки, рідко розташовані по всій поверхні листкової пластинки. Листя рослин четвертої групи відрізняється наявністю поодиноких довгих ворсинок, які знаходяться, головним чином, на центральних та бічних жилках і найбільш чітко виявляються з нижнього боку листка. Для рослин другого року життя цих ліній притаманна ще одна ознака - зростання черешків та листкових пластинок і закрученість їх навколо квітконосного пагона. Ознака опушеності листкових пластинок виявлена також і при аналізі самозапилених матеріалів кормових буряків зарубіжної селекції. Вона відповідає 4-му типу опушеності цукрових буряків, але на відміну від них ворсинки у кормових буряків коротші та густіші і виявляються лише у молодих листків.

На сорті Білоцерківський однонасінний 43 отримано лінію 49-16 (І₅), рослини якої мали суцвіття, що нагадують качан кукурудзи. Квітконосні пагони 2-го порядку дуже короткі і майже не відхиляються від центрального стебла. Квітки розташовані дуже щільно і протягом 1,5-2 тижнів повністю не розкриваються, але їх пиляки трохи виглядають назовні і мають життєздатний фертильний пилок.

Візуальний аналіз самозапилених матеріалів кормових буряків дозволив виділити форми, що характеризуються обмеженим ростом квітконосних пагонів. Відмічена морфологічна варіабельність у прояві даної ознаки, що дозволило розділити насінники на декілька фенотипічних груп. До 1-ї групи віднесено рослини, у яких верхівка центрального пагона припиняла ріст і розвиток на стадії бутонізації насінника. Пагони першого та другого порядків мали нормальний необмежений ріст. Центральний пагін, що припиняє свій розвиток, закінчується тонким стебельцем довжиною 0,5-1,6 см, на кінці якого знаходиться від 7 до 18 невеликих приквітників. До другої групи віднесені насінники, у яких детермінантний ріст проявляється на центральному пагоні та окремих гілках 1-го порядку, які закінчуються покритими листками пагонами-султанчиками різної довжини (0,5 - 4 см). Третю групу склали насінники, всі пагони яких характеризуються обмеженим ростом. У одних насінників закінчення пагонів має форму невеликого трикутника, а у інших пагони закінчуються квіткою.

Стабільність прояву виявлених характеристик у різних умовах вирощування, збереження в наступних за виділеним поколіннях інбридингу дозволило припустити генетичну обумовленість наведених вище ознак. Лінії 49-16, 97-304, 140-19, 205-18 характеризувалися або негативними з практичної точки зору показниками, або не вдалося отримати достатньої кількості насіння для їх розмноження, тому ці форми не залучалися до наступного вивчення. Для подальших генетичних досліджень було відібрано 7 самозапильних ліній цукрових буряків - 8-29, 15-28, 15-47, 15-54, 15-96, 117-71, 205-4 та форми кормових буряків з опушеністю листкових пластинок і обмеженим ростом квітконосних пагонів.

У зв'язку з тим, що вищезгадані морфологічні характеристики у рослин культурних буряків не описані раніше в літературі і виявлені нами вперше, був проведений гібридологічного аналіз, на піставі якого встановлена генетична детермінація цих ознак (табл. 1).

Таблиця 1. Генетичний контроль нових морфологічних ознак буряків

Оскільки ознака «опушеність листкової пластинки» у буряків контролюється моногенно, має домінантний характер, проявляється уже на ранніх етапах вегетації, вона знайшла практичне застосування як морфологічний маркер при проведенні багатьох генетико - селекційних досліджень. Цю ознаку було використано для створення закріплювача стерильності з детермінантним габітусом насінника і маркерною ознакою листкового апарату.

З метою можливого використання при створенні та поліпшенні закріплювачів стерильності цукрових буряків була перевірена реакція на цитоплазматичну чоловічу стерильність форм з опушеним листковим апаратом. У результаті проведених протягом багатьох років досліджень з'ясовано, що лінії з даною ознакою характеризуються досить високою закріплюючою здатністю (на рівні 75-85%). Серед них виділилася лінія 15-47, серед нащадків якої відмічено максимальну кількість стерильних рослин. Аналіз гібридних потомств від схрещування даної лінії з 5 чоловічостерильними формами, показав, що всі вони представлені стерильними (92,3-98,3%) та незначною кількістю (1,7-7,7%) напівстерильних насінників першого типу, які в практичній

селекції використовуються нарівні з повністю стерильними формами. Узагальнюючи отримані результати, можливо припустити, що проаналізована лінія 15-47 відноситься до універсальних закріплювачів стерильності і в цьому відношенні є особливо цінною.

Поєднання таких характеристик як опушеність листкового апарату та висока закріплююча здатність спонукало нас провести комплексну оцінку даних форм за 9-ма генетико-біохімічними системами, що дозволило встановити генотипи ліній за 10-ма локусами, які контролюють відповідні ферменти. Досліджували спектри: алкогольдегідрогенази (АDH, К.Ф. 1.1.1.1), глутаматдегідрогенази (GDH, К.Ф. 1.4.1.3), ізоцитратдегідрогенази (IDH, К.Ф. 1.1.1.42), НАД-залежної малатдегідрогенази (МDH, К.Ф. 1.1.1.37), гексокінази (HК, К.Ф. 2.7.1.1), лейцинамінопептидази (LAP, К.Ф. 3.4.11.1), малік-ензиму (МЕ, К.Ф. 1.1.1.40), 6-фосфоглюконатдегідрогенази (6-PGD, К.Ф. 1.1.1.44), фосфоглюкомутази (PGM, K.Ф. 2.7.5.1).

Порівняльний аналіз спектрів більшості ізоферментів не виявив відмінностей між формами з опушеним і неопушеним листковим апаратом. Виявлено розходження лише за трьома ферментними локусами: ADH1, МE1 і МDH1. Генетична мінливість спостерігається за алельними варіантами структурного гена Ме1, що кодує малік-ензим. Лінії, рослини яких несуть маркерну ознаку опушеності, характеризуються алельним варіантом Ме1-F даного гена, на відміну від альтернативних форм, де виявляється тільки алель Ме1-S. З'ясовано, що лінії з сигнальною ознакою представляють собою гомозиготи за алелем Mdh1-Р.

У всіх вивчених самозапильних ліній, за винятком 15-47, спектр АDH представлений однією зоною активності з електрофоретичною рухомістю, характерною для FF гомозигот. У рослин з максимальним проявом ознаки опушеності (генотип Нl₁Нl₁) виявлено аномальний спектр алкогольдегідрогенази, доповнений ще однією ізоформою, яка має значно меншу рухомість (рис. 1). Оскільки за своєю четвертинною структурою алкогольдегідрогеназа є димером, то у гетерозиготі спектр даного ферменту звичайно представлений трьома ізоферментами, два з яких гомодимери, а один - гетеродимер.

На нашу думку, виявлений аномальний спектр АDH, що має у своєму складі лише 2 ізоформи, можливо інтерпретувати як наслідок повної інактивації алеля Adh1-S у гетерозиготі, що можливо пов'язане з генетичними змінами в структурній частині даного локусу. На підставі отриманих результатів можливо припустити певний зв'язок між генами Adh1, Hl та генами закріплення стерильності.

Виділення нових морфологічних характеристик, отримання даних про можливість їх практичного використання в гетерозисній селекції буряків і, разом з тим, дворічний цикл розвитку, труднощі збереження генотипів у чистоті та можливі втрати за подальшого самозапилення призвели до необхідності розробки нових методів розмноження носіїв таких ознак у необхідній кількості.

Розробка системи мікроклонування in vitro буряків із господарсько - корисними ознаками

Введення в культуру in vitro. Насіння самозапильних ліній і інших форм буряків витримували 5-7 діб при температурі 4°С для стратифікації. Непошкоджені зрілі зародки після звільнення від оплодня та стерилізації (70% етанол - 1 хвилина; 15% розчин «Белізни» - 10 хвилин; 4 зміни дистильованої стерильної води - 15 хвилин) переносили у стерильні чашки Петрі з 5 шарами фільтрувального паперу, змоченого автоклавованою водою, і ставили на проростання при розсіяному освітленні. Через 1-2 доби спостерігалося проростання. Життєздатність зародків у різних генотипів складала від 30 до 60%. Отримані стерильні проростки вихідних материнських рослин для дорощування пересаджували у стаканчики на модифіковане нами живильне середовище ДС-2.

Оптимізація середовища для культивування проростків привела до повного виключення з його складу фітогормонів - як ауксинів, так і цитокінінів. Зниження вмісту макроелементів у живильному середовищі у 2 рази та сахарози з 3 до 2% також добре позначилось на розвитку проростків. Коли рослини досягали висоти 5 см і мали 4 справжні листки, їх переносили в більший посуд на те саме безгормональне середовище. Оптимізація режиму вирощування введених в культуру генотипів цукрових та кормових буряків показала, що вони ростуть та зберігають життєздатність протягом тривалого часу (до 8-10 тижнів) без пересадок на свіжі живильні середовища при температурі 24 ± 2°С і освітленні 3-4 клк. Рослини підтримували в укоріненому вигляді на середовищі ДС-2, щоб постійно мати достатню кількість вихідного матеріалу.

Оптимізація живильних середовищ для індукції прямого морфогенезу. Для індукції прямої регенерації пагонів із експлантів було проаналізовано декілька відомих регенераційних середовищ [Detrez et al., 1988; Банникова и др., 1995; Знаменская, Жужжалова, 1995; Редько та ін., 1997; Rady, 1998]. Проте на цих середовищах процеси морфогенезу з експлантів самозапильних ліній практично не спостерігалися, а у інших матеріалів відбувалися з дуже низькою частотою. Застосування добавок деяких органічних сполук (вітаміну С, аспарагінової кислоти, триптофану, гліцину) також не принесло очікуваних результатів.

У зв'язку з цим, було випробовувано декілька варіантів модифікованих середовищ МС та РВ. Лише на середовищі РВ, яке містило великий набір вітамінів та амінокислот, вдалося отримати пряму регенерацію у всіх досліджених самозапильних ліній цукрових буряків з маркерними ознаками. Слід зазначити, що і в інших досліджених генотипів буряків регенераційні процеси більш успішно проходили на середовищі РВ. Тому в подальшому воно використовувалося нами як основне для індукції прямого морфогенезу з тканин різних експлантів.

Вибір типу експланта. Використання листкових експлантів культивованих in vitro рослин першого року життя на ранніх стадіях росту має певну перевагу, оскільки надає можливість скоротити термін отримання рослин de novo та значно підвищити коефіцієнт розмноження [Sounders, Doley, 1986; Detrez et al., 1988; Богомолова и др., 1997; Kulshreshtha, 1997]. Зважаючи на це, в якості експлантів ми проаналізували не тільки окремо взяті черешки і листки, а й листок з черешком разом. При використанні експлантів з черешків частота регенерації серед досліджених нами форм цукрових буряків різного рівня плоїдності не перевищувала 10% у диплоїдних генотипів, 8% - у триплоїдних та 15% - у тетраплоїдних (табл. 2).

Коли експлантом слугував листок, регенераційна здатність була низькою і у всіх генотипів не перевищувала 4%. Найефективнішим для усіх протестованих 28 зразків (у тому числі й самозапильних ліній з маркерними ознаками та різним рівнем загальної комбінаційної здатності) виявилося використання як експланта листка з черешком. У диплоїдних форм регенераційна здатність у цьому разі підвищувалася до 15-30%, у триплоїдних - до 17-22% та 28-36% - у тетраплоїдних.

Таблиця 2. Частота регенерації пагонів із експлантів різного типу у цукрових буряків на середовищі РВ

*Достовірно на 5% рівні значущості при попарному порівнянні типів експлантів (черешок та листок з черешком) у окремих генотипів

Регенерація адвентивних пагонів відбувалась, як правило, на адаксіальній поверхні експлантів. Основним її типом було утворення бруньок. Процеси регенерації спостерігали на черешку і центральній жилці листка. На одному експланті формувалось від 8 до 15 пагінців, а при повторних пересадках на свіже середовище РВ їх кількість збільшувалась до 20-40 шт.

Суттєво підвищити частоту регенерації експлантів вдалося, збільшивши термін перебування вихідних рослин на регенераційному середовищі. Найбільшу частоту регенерації спостерігали на експлантах, отриманих від пробіркових рослин, що пройшли триразову пересадку на середовище РВ (термін одного пасажу - 20 діб).

Аналіз частоти регенерації пагонів у різних генотипів цукрових та кормових буряків виявив, що ріст рослин на живильному середовищі протягом одного пасажу забезпечує індукцію мікророзеток лише на рівні 15 - 36%, у той час як після трьох пасажів регенерація підвищувалась в 2-3 рази (табл. 3).

Таблиця 3. Частота регенерації мікророзеток залежно від часу перебування вихідних рослин на живильному середовищі РВ

*Різниця між частотою регенерації у 1-му та 3-му пасажах достовірна при Р=0,95

Проте, збільшення тривалості перебування материнських рослин на цьому середовищі до 6 пасажів негативно позначалось на частоті регенерації і нерідко призводило до вітрифікації і припинення росту. Найчастіше регенерація відбувається на експлантах, одержаних від рослин певного морфотипу. Найвищу її частоту спостерігали на експлантах від пробіркових рослин з широкоовальною формою листкової пластинки і коротким черешком. Найменша регенераційна здатність відмічена у рослин з ланцетоподібним листям і подовженим черешком.

Досліди засвідчили, що розмноження рослин можна суттєво прискорити, якщо виключити культуру експлантів і одержувати мікропагони на материнській рослині, яку тричі пересаджували на середовище РВ. У цьому випадку спостерігали масову закладку дочірніх розеток біля основи рослин.

Укорінення рослин-регенерантів та переведення їх у грунт. Пагони довжиною 1-2 см спочатку переносили для дорощування на оптимізоване нами живильне середовище ДС-1 (1/2 МаЕ за МС, 1% сахарози, без фітогормонів), яке сприяє швидкому розвитку пагонів у всіх досліджених генотипів. Через 7-10 діб висоту 4-6 см. Для стимуляції процесів ризогенезу та масового укорінення мікророзеток було проаналізовано декілька варіантів середовищ з різним вмістом регуляторів росту. Зокрема, найкращі результати для самозапильних ліній з опушеністю листкового апарату були одержані на середовищі ДС-51 (МаЕ за МС + 1 мг/л ІМК). Через 10-20 діб до 60-80% регенерантів формували корені. Дослідження інших генотипів цукрових та кормових буряків показали, що коренеутворення у 70 - 80% регенерантів також викликає індолілмасляна кислота у концентрації 2 мг/л.

Регенеранти з розвиненою кореневою системою переносили спочатку у вазони із прожареним піском і для підтримання вологого середовища накривали скляними посудинами. Створення високої вологості в перші 2-5 діб після пересадки дозволяє забезпечити збереження матеріалу на 90 відсотків. Через тиждень рослини із піску пересаджували у відкритий грунт. Приживлюваність регенерантів у ґрунті складала від 70 до 90%.

Разом з тим, використання методу мікроклонального розмноження шляхом індукції адвентивних пагонів безпосередньо із клітин експланта не виключає можливості отримання цитологічно неоднорідного потомства [Славова, 1980; Амерханова, 1988; Detrez, 1989; Mikami et al., 1989]. У зв'язку з цим, було досліджено цитологічну стабільність регенерантів, отриманих шляхом прямого морфогенезу з експлантів різної плоїдності.

Цитогенетичний аналіз проростків, отриманих із тканин диплоїдних експлантів, не виявив суттєвих відмінностей між регенерантами і вихідними формами. Кількість генетично змінених рослин серед регенерантів у всіх досліджених генотипів не перевищувала 3-5%. При дослідженні регенерантів, отриманих з експлантів поліплоїдних форм, встановлено, що переважна більшість з них також не відрізнялася за рівнем плоїдності від вихідних материнських рослин. Частота появи змінених форм знаходилася на рівні 5-7%. Слід зазначити, що і при отриманні регенерантів шляхом активації пазушних меристем на самій материнській рослині було виділено рослини різного рівня плоїдності. У диплоїдних генотипів їх кількість складала 1-3%, а у поліплоїдних форм варіювала від 2 до 4 відсотків. Аналогічні результати отримано і за скринінгу рівня плоїдності одержаних регенерантів методом проточної цитометрії.

На підставі отриманих результатів запропоновано наступну схему мікроклонального розмноження і підтримання рослин буряків з селекційно-корисними ознаками. Її етапи відображено на рисунку 2. Розроблений комплекс біотехнологічних прийомів підвищує частоту регенерації з експлантів та прискорює розмноження рослин.

Мінливість геному культивованих клітин та рослин - регенерантів буряків

Поряд із прямою регенерацією пагонів безпосередньо із клітин екcпланта для мікроклонального розмноження буряків використовують ще один підхід - індукцію регенерації із калюсних тканин. Для індукції пухкого калюсу нами були використані експланти, отримані з рослин, які вирощували на безгормональних середовищах МС та ДС-2. Сегменти листків та черешків переносили на живильні середовища, доповнені БАП у концентрації 0,5- 2 мг/л, і культивували у темряві при температурі 21°С. Через 4 тижні їх субкультивували на те саме середовище, але вже без регулятора росту, на якому і спостерігали утворення пухкого калюсу при повному або частковому некрозі вихідного експланта. Найкращі результати отримані на середовищі МС при концентрації БАП 0,5 мг/л для генотипів кормових буряків та 1 мг/л - для цукрових. Підвищити частоту калюсогенезу вдалося використовуючи експланти з материнських рослин, які тричі були пересаджені на середовище МС, доповнене 0,25 мг/л БАП, а також експланти з рослин-регенерантів 2-3-го пасажів, отриманих шляхом прямого морфогенезу на гормональному середовищі РВ. Встановлено, що у досліджених генотипів цукрових та кормових буряків краще всього калюс утворюється на листках і, меншою мірою, на черешках. Результати досліджень калюсоутворення у різних селекційно-цінних форм буряків свідчать, що цей процес пов'язаний із специфічними особливостями генотипу, в тому числі з рівнем плоїдності. Показано, що серед досліджених генотипів процеси калюсогенезу більш інтенсивно відбуваються у поліплоїдних форм (табл. 4).

Таблиця 4. Частота калюсоутворення із експлантів листків у цукрових буряків різного рівня плоїдності на середовищі МС

*Різниця між показниками достовірна при Р=0,95

Особливості хромосомної мінливості калюсних культур, отриманих від експлантів різної плоїдності. Аналіз мінливості складу клітинних популяцій калюсів, отриманих від диплоїдних та тетраплоїдних експлантів цукрових та кормових буряків, показав, що суттєві відмінності у розподілі клітин за числом хромосом, обумовлені різним рівнем плоїдності вихідного матеріалу, спостерігаються лише у первинному калюсі (рис. 3). У даній тканині переважають клітини з числом хромосом, відповідним рівню плоїдності вихідної рослини - 2х (отриманих від диплоїдних експлантів) та 4х (виділених від тетраплоїдних). При пасажуванні калюсів, отриманих від диплоїдних експлантів, вже у 1-му пасажі достовірно збільшувалася кількість поліплоїдних клітин. Калюси тетраплоїдного походження 1-го пасажу характеризувались наявністю диплоїдних та триплоїдних клітин. І вже у 2-му пасажі із різного вихідного формувалися міксоплоїдні штами з розмахом варіювання числа хромосом у клітині від 1х до 16х без досить чіткого модального класу.

Подальше культивування штамів, отриманих від експлантів різної плоїдності, супроводжувалося поліплоїдизацією культур. Процес поліплоїдизації інтенсивніше відбувався у штамів диплоїдного походження. Тому штами, отримані від диплоїдних рослин, до 12-15-го пасажу мали такі ж модальні числа хромосом, як і штами від тетраплоїдних експлантів. Разом з тим, у штамів такого ж віку, отриманих від тетраплоїдних рослин, спостерігали більшу різноманітність клітин за числом хромосом, що може бути пов'язане із неоднаковою швидкістю становлення культур. Таким чином, для калюсних штамів буряків, отриманих від експлантів рослин різної плоїдності, характерний конвергентний тип еволюції генетичної структури клітинних популяцій. Сформовані калюсні лінії характеризуються стабільно-гетерогенною генетичною структурою, яка зберігається протягом тривалого культивування.

Дослідження спектра та частоти хромосомних перебудов в анафазах показало, що на ранніх етапах культивування виявляється широкий спектр аберацій, представлений фрагментами, мостами та клітинами з одночасною наявністю і мостів, і фрагментів. Кількість останніх складає не менше 50% від усіх порушень. Первинним калюсам, отриманим від експлантів різної плоїдності, властивий досить низький рівень пошкоджень хромосом - у калюсів диплоїдного походження він не перевищував 2-3%, а у тетраплоїдних - 4%. У культур 2-го пасажу рівень аберацій підвищується до 7 - 11%. У сформованих штамів, ініційованих від диплоїдних рослин, виявлено меншу кількість клітин з перебудовами (4-6%) порівняно з культурами, отриманими від тетраплоїдних рослин (7-9%). Певні відмінності в динаміці змін частоти структурних перебудов у калюсних культур можуть бути пов'язані з різною швидкістю становлення штамів, отриманих від експлантів різної плоїдності, а також неоднаковим темпом елімінації пошкоджених клітин.

У всіх калюсних ліній 12-15-го пасажів, отриманих від різних експлантів, у спектрі аберацій домінують мости без фрагментів. Анафази зі свіжими розривами зустрічаються зрідка.

У метафазах виявлено надспіралізовані та кільцеві хромосоми, асиметричні транслокації, хромосоми з розривами, дицентрики, фрагменти хромосом. Виявлені зміни морфології хромосом можуть бути результатом втрати хроматину при фрагментації чи обміні хроматином при розривах та воз'єднанні.

Вивчення динаміки змін генетичної структури клітинних популяцій сформованих штамів кормових буряків протягом пасажу показало певні зміни частоти зустрічальності клітин різного рівня плоїдності.

По-перше, клітини з найнижчим у даних культурах рівнем плоїдності (2х) ділилися у першій половині пасажу. По-друге, у максимумах мітотичної активності ділилися клітини практично всіх рівнів плоїдності, які властиві даному штаму. По-третє, кількість тетраплоїдних клітин має тенденцію до зменшення в період підвищення кількості мітозів, що особливо чітко проявляється в першій половині пасажу. Всі ці моменти є спільними для штамів різного походження. Проте, в цілому встановлені коливання хромосомних чисел протягом циклу вирощування істотно не змінювали модальних класів, які формувалися тетраплоїдними та октоплоїдними клітинами.

Геномна мінливість морфогенного і неморфогенного калюсу кормових буряків. Результати наших досліджень свідчать, що процес культивування in vitro калюсних культур буряків супроводжується істотними змінами структурно-функціонального стану їх клітин. При цьому спостерігається широкий спектр геномних перетворень, який на цитологічному рівні виявляється як у змінах числа хромосом, так і в змінах рівня та типів їх структурних перебудов. Одним із передбачуваних механізмів, у результаті яких підвищується частота хромосомної мінливості in vitro, є метилування цитозину в ДНК [Phillips et al., 1994; Finnegan et al., 2000]. Для обґрунтування цієї гіпотези нами було проведене порівняльне дослідження низки цитологічних характеристик і рівня метилування CpCpGpG - сайтів ДНК морфогенного і неморфогенного калюсу кормових буряків (отримані з листкового експланта диплоїдної рослини чоловічостерильної форми 10-29) на ранніх етапах культивування. Уже в перших пасажах встановлено істотні відмінності як за хромосомним складом клітинних популяцій (рис. 4), так і за частотою аберацій хромосом (рис. 5) між калюсами різного типу. Порівняно з морфогенним калюсом у неморфогенного і ступінь поліплоїдизації, і частота структурних перебудов хромосом значно вища.