Мінливість геному буряків (Beta Vulgaris L.) за інбридингу та в культурі in vitro

Характерною особливістю неморфогенного калюсу є поява високоплоїдних метафаз із надспіралізованими хромосомами (рис. 6). Поряд з цим виявлено інтерфазні ядра з конденсованим хроматином.

Підвищення рівня геномної мінливості супроводжується збільшенням рівня метилування цитозину специфічних послідовностей ДНК. Це ясно видно з результатів рестрикційного аналізу ДНК парою ізошизомерів MspІ та HpaII (рис. 7б). HpaII інтенсивно гідролізує ДНК морфогенного калюсу, у результаті чого утворюється безперервний спектр фрагментів, тоді як MspІ рестриктує ДНК у значно меншому ступені. Відмінності профілів розщеплення ДНК морфогенного калюсу можуть бути наслідком метилування зовнішнього залишку цитозину CpCpGpG-мотивів тільки в одному з полінуклеотидних ланцюжків ДНК.

Між електрофоретичною рухомістю нативної ДНК неморфогенного калюсу і продуктами її гідролізу цими рестриктазами не спостерігається розходжень, внаслідок чого CpCpGpG-послідовності практично цілком ферментативно модифіковані. Тобто, рівень метилування цих сайтів істотно перевищує такий морфогенного калюсу.

У морфогенному калюсі вміст РНК у 2,7 рази більший, ніж у неморфогенному (55,03 ± 2,73 і 19,7± 0,58 мкг/г тканини відповідно). Це свідчить про більшу функціональну активність геному кормових буряків в клітинах морфогенного калюсу порівняно з клітинами неморфогенної тканини.

Результати цього дослідження показали, що як зниження кількості синтезованої РНК, так і збільшення структурних перебудов хромосом, у тому числі їх надспіралізація та конденсація хроматину, які на цитологічному рівні відображують інактивацію генетичного матеріалу, супроводжується більш інтенсивним метилуванням ДНК. Це свідчить на користь того, що ферментативна модифікація цитозину може бути одним з чинників, який підвищує рівень геномної нестабільності.

Разом з тим, аналіз динаміки змін рівня метилування ДНК у системі - експлант - калюс - регенерант дають підстави вважати, що ферментативна модифікація цитозину є поліфункціональним фактором, який також приймає участь у процесах морфогенезу in vitro. Про це, зокрема, свідчать результати, представлені на рис. 7. Рестриктази MspІ і HpaII ефективно гідролізують ДНК експланта (рис. 7а) на велику кількість фрагментів широкого діапазону молекулярних мас, причому в області нижче 4 000 пар нуклеотидів (п.н.) чітко видно фрагменти ДНК різного розміру.

Це вказує на присутність у геномі кормових буряків багатократно повторюваних CpCpGpG-сайтів з обома неметилованими CpG - та CpCpG - мотивами, ряд яких упорядковано розташований через певні інтервали уздовж полінуклеотидних послідовностей ДНК. Електрофоретичні рухливості фрагментів ДНК вихідного експланта, утворені в результаті гідролізу нативної ДНК даними рестриктазами, у цілому не відрізнялися. Той факт, що відбувається зсув смуги продуктів гідролізу ДНК відносно нативної ДНК, свідчить про те, що переважна більшість фрагментів ДНК, середній розмір яких складає ~20 000 п.н., містить сайти розщеплення цих рестриктаз. З огляду на те, що розмір геному буряка дорівнює ~7,1х10⁸ п.н. [Shmidt, 1996], число сайтів, що впізнає і гідролізує ця пара ізошизомерів, складає не менш 35 000. Примітно, що на відміну від експланта в ДНК морфогенного калюсу спостерігається інше розташування HpaII-продуктів - тобто відсутність упорядковано розташованих неметилованих залишків цитозину CpCpGpG-послідовностей уздовж молекули ДНК. У цілому, процес утворення морфогенного калюсу з експланта - листкової пластинки супроводжується підвищенням рівня метилування ДНК. Проте рівень метилування ДНК в морфогенному калюсі значно нижчий ніж у неморфогенному.

ДНК вегетативної бруньки (рис. 7в) так само, як і листкової пластинки, ефективно гідролізується і MspІ, і HpaII. При цьому утворюється широкий спектр фрагментів ДНК, однаковий для обох ферментів рестрикції, тобто на ранніх етапах пагоноутворення у геномі кормових буряків здійснюється гіпометилування залишків цитозину, рівень якого наближається до такого в первинному експланті. У цілому, ці дані підтверджують представлені в літературі уявлення про те, що регенерація може ініціюватися в тих клітинах калюсу, які зберегли нормальний характер метилування ДНК [Kaeppler et al., 2000]. Таким чином, у кормових буряків в культурі in vitro показане варіабельне метилування сайтспецифічних послідовностей ДНК.

Цитологічна та морфологічна мінливість рослин-регенерантів. Цитологічний аналіз регенерантів, отриманих із калюсів на різних етапах культивування, свідчить, що найбільша кількість генетично змінених форм виявляється серед регенерантів, індукованих із калюсів 9-10-го пасажів (табл. 5). У регенерованих рослин відмічено значний рівень морфологічної мінливості. Серед диплоїдних регенерантів виявлено рослини із світло-брунатною, дуже вузькою листковою пластинкою, з майже редукованими черешками та безхлорофільними плямами на листках. Серед тетраплоїдних регенерантів зустрічалися відмінності у забарвленні листя - від салатного до темно-зеленого; виявлено рослини з червоним забарвленням жилок черешків та листя; зрощеними черешками та трикутниковою формою листків, а також карлики. Дослідження рослин першого насіннєвого покоління R₁ показало, що більшість виявлених морфологічних змін мала модифікаційну природу і не зберігалася у нащадків. У рослин R₁ та R₂ успадковувались ознаки вузької форми листкової пластинки та забарвлених жилок листка, що може свідчити про їх генетичну обумовленість.

Таблиця 5. Плоїдність рослин-регенерантів R₀, отриманих із калюсних культур цукрових буряків різних пасажів (на прикладі штамів І-14 та Р-8*)

*штам І-14 отриманий з екпланта диплоїдної рослини сорту Індустріальний; штам Р-8 отриманий з екпланта тетраплоїдної рослини сорту Рамонська 023

Сомаклональна мінливість цукрових буряків за ознакою стерильності пилку. Нами була досліджена природа стерильності диплоїдних регенерантів цукрових буряків, отриманих з калюсних культур 7-9-го пасажів різних інбредних ліній. Серед отриманих рослин поряд з фертильними (92,5%) відзначено стерильні (1,9%) і напівстерильні I (0,9%) та II (4,7%) типів насінники. Для ідентифікації у регенерантів природи стерильності всі рослини зі зниженою пилкоутворюючою здатністю висаджували під парні ізолятори з рослинами лінії 15-47 (генотип Nxxzz), маркованої геном Hl (опушеність листкової пластинки) за якою і проводився добір гібридів. Аналіз гібридних потомств F₁ і F₂ від схрещування більшості регенерантів з рослинами лінії 15-47 показав, що всі вони представлені звичайними фертильними формами. Це свідчить про модифікаційний характер виниклої стерильності рослин.

Прояв ознаки стерильності у насінників регенерантів лінії І-17 дозволив припустити її цитоплазматичну обумовленість. Гібридне потомство F від рослини І-17-2 складалося зі стерильних і напівстерильних першого типу насінників у співвідношенні близькому до 1:1. У результаті насичувального схрещування збільшилася кількість стерильних форм, що підтверджує цитоплазматичну природу стерильності пилку.

Гібридні потомства F₁ рослин-регенерантів І-17-3 і І-17-7, що за фенотипом були віднесені до напівстерильних другого типу, містили стерильні і напівстерильні рослини обох типів у співвідношенні, близькому до теоретично очікуваного (2:1:1). У результаті беккросного схрещування чоловічостерильних рослин цього покоління з тим же запилювачем збільшилася кількість стерильних рослин за рахунок зменшення частки напівстерильних форм, що також свідчить про цитоплазматичну обумовленість стерильності пилку.

Покоління F, отримане від іншого насінника (І-54-1), складалося тільки з фертильних рослин, що дозволило припустити ядерний контроль стерильності. Друге гібридне покоління складалося як з фертильних, так і стерильних рослин у співвідношенні близькому до 3:1 відповідно, що підтвердило наше припущення, оскільки ядерна стерильність буряка контролюється одним рецесивним геном а. Наявність у наших експериментах регенеранта з генною чоловічою стерильністю, імовірно, можна пояснити мутацією ядерних генів, що виникла у результаті тривалого культивування калюсної культури in vitro.

Таким чином, показано, що природа чоловічої стерильності, яка виявляється у регенерантів, може бути різною - як генетично обумовленою, так і мати модифікаційний характер.

Мінливість калюсних культур та рослин - регенерантів буряків за дії стресових чинників

У процесі добору стійких форм досліджено особливості дії біотичних і абіотичних стресових чинників (токсину збудника бактеріозу, сульфатних та хлоридних солей, низької температури) та їх комплексу на генетичну структуру популяцій калюсних клітин кормових буряків та рівень плоїдності рослин - регенерантів. Матеріалом досліджень були калюсні культури, отримані з листкових експлантів диплоїдних рослин сортів Панфільська та Урсус.

Уже в першому пасажі при перенесенні клітинних культур на середовище з сублетальними концентраціями токсину збудника бактеріозу (Pseudomonas syringae pv. аptata) спостерігається достовірне збільшення кількості анеуплоїдних клітин до 18-21% порівняно з 7,3% у контрольного калюсу. У калюсів визначається значна кількість клітин з відхиленнями від нормального процесу мітозу. Виявлено як хромосомні аберації, так і порушення веретена поділу у вигляді багатополюсних мітозів. Відзначені 2-3-ядерні клітини, а також клітини з фрагментацією ядер. Кількість клітин з аномаліями поділу коливалась у калюсів на селективних середовищах від 12 до 16 відсотків, у той час як у контролі їх число не перевищувало 4%, хоча спектр аномалій мітозу був приблизно однаковим. За подальшого пасажування калюсів на селективному середовищі спостерігається спрямована мінливість у бік тетраплоїдних клітин - їх кількість становить понад 50%. Частка анеуплоїдних клітин поступово знижується і не перевищує 10%. Порівняно з контрольним калюсом у резистентних ліній відмічено значно меншу (у 2-3 рази) кількість диплоїдних клітин, а також високоплоїдних (у 2 рази).

Аналогічні результати отримано і при дослідженні цитогенетичного ефекту дії сублетальних доз хлориду та сульфату натрію. Концентрації NaCl (1,5%) та Na₂SO₄ (2%) уже в першому пасажі на селективних середовищах призводять до статистично достовірного збільшення кількості анеуплоїдних клітин. Достовірно зростала і частота аномалій мітозу, пов'язана з порушеннями веретена поділу - від 4-6% в контролі до 17-20% у досліді. Аналіз тканин другого пасажу, що культивувалися на середовищах з високим вмістом солей, показав, що відбувається поліплоїдизація клітин. Порівняно з контролем у досліджених калюсів спостерігали збільшення на 20-30% кількості тетраплоїдних клітин за рахунок зменшення числа клітин вихідного модального класу 2х. Кількість анеуплоїдних клітин зменшується до 5-7% і знаходиться на рівні контролю. Така структура клітинних популяцій зберігалася і у четвертому пасажі культивування на селективних середовищах.

Подібний тип реакції калюсних культур виявлено і після обробки негативною температурою резистентних до токсину збудника бактеріозу ліній. Аналіз хромосомного складу клітинних популяцій токсинрезистентних ліній, які піддавали обробці негативною температурою -5°С протягом 21 години, через 4 тижні після обробки виявив повне зникнення диплоїдних та значне зменшення кількості триплоїдних клітин при домінуванні тетраплоїдних клітин, кількість яких складає не менше 62 - 67%. Така сама генетична структура клітинних популяцій зберігалася і через 3 пасажі після температурної обробки - значних змін ні за рівнем плоїдності клітин, ні за частотою аберацій не виявлено. Таким чином, цитогенетичний аналіз калюсних ліній кормових буряків, резистентних до стресових чинників, виявив подібний тип розвитку культур - збільшення ступеня поліплоїдизації та добір субпопуляції тетраплоїдних клітин, як найбільш пристосованих для росту в умовах стресу.

Разом з тим, нами виявлені специфічні риси дії різних стресових чинників. На селективних середовищах з токсином збудника бактеріозу уже в першому пасажі відмічали достовірне збільшення клітин з абераціями хромосом. Залежно від варіанта кількість таких клітин коливалась від 13 до 18 відсотків (рис. 8). При подальшому культивуванні їх кількість зменшувалася. В анафазних клітинах різного рівня плоїдності спостерігали хроматидні та хромосомні мости, подвійні та одиночні фрагменти. Виявлено анафазні пластинки, які містили 3 - 7 одиночних, тобто хроматидних, мостів на клітину. Сумарна кількість аберантних анафаз з фрагментами становить близько 60% - тобто у спектрі клітинних пошкоджень переважають «свіжі» розриви. Достовірне збільшення їх кількості свідчить про значний генотоксичний вплив токсину збудника бактеріозу на хромосомний апарат клітин і його кластогенний ефект у сублетальній концентрації.

Специфічною рисою дії токсину збудника бактеріозу, яка вияляється на цитологічному рівні, є фрагментація хромосом. Поряд з фрагментацією у калюсів в метафазних пластинках спостерігали явище виникнення мостів злипання хромосом («striсkiness»), яке проявляється в з'єднанні їх хроматиновими тяжами і свідчить про наявність поверхневої липкості хромосом.

Починаючи з 6-го пасажу в метафазних пластинках деяких клітин спостерігали появу DMs («double-minute chromosomes») хромосом. Вони виявляються як маленькі подвійні тільця, часто асоційовані з певною хромосомою. Поява DMs можлива у результаті циклів мостів і утворення ацентричних фрагментів [Coquelle et al., 1989]. Оскільки феномен появи DMs описаний при набутті клітинами резистентності до різних хімічних агентів, то не виключено, що поява таких хромосом у досліджених калюсах також є одним з механізмів утворення стійкості до патотоксину в процесі клітинної селекції.

Специфічними рисами дії солей є поява некротичних клітин з пікнотичними ядрами, злипання хромосом, а інколи і повна аглютинація хроматину. При порівнянні дії абіотичного та біотичного стресових чинників слід зазначити, що, на відміну від токсину збудника бактеріозу, сольовий стрес має більш виражений турбогенний ефект, викликаючи порушення процесів мітотичного поділу. На середовищах з високими концентраціями солей відзначена тенденція до підвищення числа багатополюсних поділів та достовірне збільшення К-мітозів (табл. 6). У той же час мутагенний ефект дії токсину більше проявляється в кластогенних пошкодженнях структури хромосом.

Резистентні до певного стресового чинника калюсні культури характеризуються постійним рівнем та подібним типом структурних перебудов хромосом. Так, вже у третьому пасажі на селективному середовищі з токсином збудника бактеріозу кількість клітин з абераціями знизилася до 7 - 8%. Такий рівень структурних перебудов хромосом у стійких калюсних ліній зберігався протягом тривалого культивування (понад 2 роки).

Таблиця 6. Частота виникнення турбогенних ефектів у клітинах калюсних культур кормових буряків на середовищах з різним вмістом солей

* Достовірно порівняно з контролем при Р=0,95

Аналогічні результати отримано і за скринінгу калюсів з перехресною стійкістю до низьких температур.

Слід відмітити, що регенерація зі стійких до різних стресових чинників калюсів ускладнена, і частота індукції рослин дуже низька. Так, частота регенерації пагонів із резистентних до токсину збудника бактеріозу ліній не перевищувала 4%. При цитологічному дослідженні 46 регенерантів, виявлено рослини різного рівня плоїдності - диплоїдні (23,9%), триплоїдні (15,2%), тетраплоїдні (41,3%) та анеуплоїдні (19,6%). Диплоїдні регенеранти відрізнялися від тетраплоїдних дрібнішими листками. Триплоїдні регенеранти мали подовжену листкову пластинку і черешок. Із лінії 8 виділено анеуплоїдну рослину (2n=37), яка формувала в базальній частині велику кількість мікророзеток.

Із калюсних культур кормових буряків диплоїдного походження, резистентних до хлоридного та сульфатного засолення, регенеровано декілька десятків рослин. Серед регенерантів спостерігали як морфологічно нормальні, так і з аномаліями морфології, які найчастіше проявлялися в потовщенні листкової пластинки та витягнутих ланцетоподібних листках.

Переважаюча більшість регенерантів, індукованих із стійких як до хлоридного типу засолення, так і сульфатного мала диплоїдний каріотип. Разом з тим, виявлено рослини й іншого рівня плоїдності - тетраплоїдні, міксоплоїдні та анеуплоїдні (табл. 7). Слід зазначити, що з калюсних ліній, стійких до хлоридного засолення отримано більшу кількість анеуплоїдних та міксоплоїдних регенерантів, ніж від ліній, резистентних до сульфатного типу засолення.

Таблиця 7. Плоїдність рослин-регенерантів R₀, отриманих з калюсних ліній кормових буряків, резистентних до сольового стресу

Усі міксоплоїдні регенеранти характеризувалися наявністю в апікальній меристемі листків клітин з числом хромосом 2х та 4х. Поліплоїдні метафази складали залежно від рослини 10-30%. Міксоплоїдна природа регенерантів була підтверджена і цитометрично. Виявлено також анеуплоїдні рослини з білятетраплоїдним числом хромосом. Анеуплоїдні форми характеризувалися дуже повільним темпом росту, аномальною морфологією, світло-зеленим забарвленням листків.

У калюсних ліній кормових буряків з перехресною стійкістю до токсину збудника бактеріозу та низьких температур була вивчена реакція на сольовий стрес. Досліди на комплексну стійкість здійснювали на середовищах з NaCl та Na₂SO₄. Частота регенерації у отриманих клітинних ліній, стійких до декількох стресових чинників, виявилась дуже низькою - її рівень не перевищував 1-3%. Тільки у незначної частини клітинних культур з комплексною стійкістю утворювались мікророзетки. На регенераційному середовищі РВ розвивались пагони, які мали морфологічні зміни листків - довгі, голчасті, світло-зеленого кольору, а також ланцетоподібні з темно-зеленим забарвленням. Частина регенерантів виявилася альбіносами.

При цитологічному аналізі рослин, отриманих з калюсів, які росли на середовищі з 2% NaCl (лінії 3п/1, 8п/1, 11п/1) встановлено, що більша частина регенерантів є міксоплоїдами (2х і 4х) або анеуплоїдами з числом хромосом близьким до 4х (табл. 8). У цих рослин відмічали значну (до 12%) кількість клітин з порушеннями мітозу. Спостерігали відсталі хромосоми і фрагменти, злипання хромосом, одиночні мости в анафазах.

Таблиця 8. Плоїдність рослин-регенерантів R₀, отриманих із калюсних культур кормових буряків, стійких до декількох стресових чинників

Більша частина рослин, ініційована з калюсних ліній кормових буряків, які росли на середовищі з 2,5% сульфатним засоленням (лінії 3п/2, 8п/2, 11п/2), також виявилася міксоплоїдами і мала значну кількість клітин з аномаліями мітозу. Серед регенерантів, отриманих з резистентного калюсу, кілька рослин зовсім не формували пагонів і залишалися розеточною формою.

У деяких клітинах калюсних культур з комплексною стійкістю до трьох стресових чинників на стадії пізньої телофази спостерігали відсутність цитокінезу та наявність клітин з двома ядрами. Можливо, що саме з таких клітин відбувається регенерація, чим, мабуть і можливо пояснити переважаючу більшість отриманих міксоплоїдних рослин. Наше припущення ґрунтується на даних інших дослідників, які пояснюють індукцію химерних рослин, зокрема картоплі, саме з таких клітин [Жила и др., 1987]. Разом з тим, не можна виключати і того, що до утворення таких регенерантів залучається одночасно декілька різних клітин [Xena de Enrech et al., 1996; Jelenic et al., 2001].

Висновки

У дисертації викладено теоретичне обґрунтування та результати експериментального вивчення мінливості геному цукрових та кормових буряків за інбридингу і в культурі in vitro та можливостей її використання для створення вихідного селекційного матеріалу. Встановлено закономірності структурно-функціональної мінливості геному культивованих клітин буряків, яка виникає у процесі тривалого культивування in vitro і за дії абіотичних і біотичних стресових чинників та їх комплексу. Отримані результати поглиблюють і уточнюють знання про механізми геномної мінливості, сприяють розробці генетичних основ клітинної селекції, що дозволить цілеспрямовано та ефективніше створювати бажані форми культурних буряків.

1. Виявлено нові морфологічні ознаки буряків та встановлені гени, які їх детермінують: pv₁, pv₂ (паралельне жилкування листків); рcl₁, рcl₂ (зростання черешків); bt (гачкоподібна загнутість верхівок молодих листочків); Hl (опушеність листкових пластинок); dg₁, dg₂ (обмеження росту квітконосних пагонів у насінників кормових буряків).

2. Домінантний характер успадкування та моногенний контроль ознаки «опушеність листкових пластинок» буряків, а також її проявлення вже на ранніх етапах вегетації надає можливість використання цієї характеристики як морфологічного маркера при проведенні генетико-селекційних досліджень. Експериментально доведено, що генотипи з максимальним проявом даної ознаки є універсальними закріплювачами стерильності.

3. Удосконалено метод прямої регенерації пагонів із тканин вегетативних органів буряків, що дозволяє репродукувати у чистоті генетично - цінний селекційний матеріал, збільшує у 2-3 рази вихід регенерантів на один експлант та прискорює розмноження рослин.

4. Встановлено, що процеси калюсогенезу інтенсивніше відбуваються у поліплоїдних форм буряків.

5. Для калюсних штамів, отриманих від експлантів рослин різної плоїдності, характерний конвергентний тип еволюції генетичної структури клітинних популяцій. У калюсів диплоїдного походження виявлена вища швидкість становлення генетичної структури клітинних популяцій порівняно з культурами, отриманими від тетраплоїдних рослин. Сформовані калюсні лінії характеризуються стабільно-гетерогенною генетичною структурою, яка зберігається протягом тривалого культивування.

6. Рівень геномної нестабільності неморфогенного калюсу вищий порівняно з морфогенними культурами уже на перших етапах культивування. Збільшення рівня нестабільності геному неморфогенного калюсу супроводжується інтенсивним метилуванням de novo багатократно повторюваних CCGG-послідовностей ДНК та значним зниженням кількості синтезованої РНК. Це дозволяє припустити участь ферментативної модифікації цитозину у механізмах геномної дестабілізації при культивуванні in vitro.

7. Встановлено варіабельність ферментативної модифікації цитозину в сайт-специфічних послідовностях геному в процесі органогенезу кормових буряків in vitro. Метилування de novo CpCpGpG-мотивів ДНК при дедиференціації і калюсоутворенні та гіпометилування ДНК на стадії утворення вегетативної бруньки до рівня, властивого вихідному експланту, свідчить про те, що ферментативна модифікація цитозину може бути однією з детермінант епігенетичної регуляції та складовою частиною загальної системи генетичної регуляції, яка приймає участь у реалізації процесів морфогенезу in vitro.

8. Сомаклональна мінливість буряків виявляється, зокрема, різним рівнем плоїдності рослин. Найбільша вірогідність добору генетично змінених форм можлива серед регенерантів, індукованих із калюсів 9-10-го пасажу.

9. Вперше досліджено сомаклональну варіабельність рослин-регенерантів цукрових буряків за ознакою стерильності пилку. Показано, що природа чоловічої стерильності, яка виявляється у регенерантів, може бути різною - як генетично обумовленою, так і мати модифікаційний характер.

10. Калюсні лінії кормових буряків, резистентні до різних стресових чинників та їх комплексу, характеризуються збільшенням рівня плоїдності та добором на користь субпопуляції тетраплоїдних клітин. Для таких ліній є властивим наявність генетичного гомеостазу, що виявляється постійним рівнем структурних перебудов та числа хромосом. Це може свідчити про те, що цитогенетичні зміни представляють один із можливих механізмів, які залучаються до набуття стабільної резистентності культивованих клітин до різних стресів.

11. Регенеранти, індуковані з резистентних до різних стресових чинників калюсних культур кормових буряків, характеризуються широким спектром плоїдності. Серед рослин, отриманих з калюсів з комплексною стійкістю, переважають міксоплоїдні форми.

12. Розроблено нові способи контролю гібридності рослин, створення закріплювачів стерильності та міжлінійних гібридів цукрових буряків, які дозволяють значно спростити, скоротити селекційний процес та зменшити його собівартість.

Список опублікованих праць

1. Тищенко Е.Н., Дубровная О.В. Эпигенетическая регуляция. Метилирование ДНК генов и трансгенов растений. - К.: Логос, 2004. - 236 с.

2. Чугункова Т.В., Дубровная О.В., Хризман В.Н., Шевцов И.А. Изучение электрофоретических спектров глобулинов семян для контроля гомозиготности линий сахарной свеклы // Цитология и генетика. - 1992.-Т.26, №6. - С. 3-6.

3. Чугункова Т.В., Дубровная О.В., Шевцов И.А. Цитогенетические особенности каллусных культур диплоидной и тетраплоидной кормовой свеклы // Цитология и генетика. - 1995.-Т.29, №2. - С. 49-55.

4. Чугункова Т.В., Дубровная О.В. Особенности регенерации растений инбредных линий сахарной свеклы в культуре in vitro // Биополимеры и клетка. - 1997. - Т.13, №4. - С. 303-307.

5. Чугункова Т.В., Дубровная О.В. Цитогенетический анализ каллусных культур и растений-регенерантов, полученных из эксплантов сахарной свеклы различной плоидности // Цитология и генетика. - 1998. - Т.32, №4. - С. 9 - 15.

6. Юркова Г.Н., Дубровная О.В., Чугункова Т.В., Лялько И.И. Микроклональное размножение растений сахарной свеклы с генетически детерминированными признаками // Физиология и биохимия культ. растений. - 1999. - Т.31, №3. - С. 227-232.

7. Лялько И.И., Дубровная О.В., Чугункова Т.В. Генетический контроль признака опушенности листовой пластинки у сахарной свеклы // Цитология и генетика. - 1999. - Т.33, №1. - С. 38-43.

8. Лялько І.І., Дубровна О.В., Чугункова Т.В., Шевцов І.А. Характер спадковості нових маркерних ознак листового апарату цукрового буряку // Доповіді НАН України. - 1999. - №3. - С. 201-205.

9. Губанова Н.Я., Дубровная О.В., Чугункова Т.В. Отбор и цитологический анализ устойчивых к токсину Pseudomonas syringae pv. aptata клеточных линий кормовой свеклы и регенерантов из них // Цитология и генетика. - 1999. - Т.33, №4. - С. 9-16.

10. Губанова Н.Я., Дубровная О.В., Чугункова Т.В. Комплексная селекция in vitro на устойчивость клеточных линий кормовой свеклы к токсину возбудителя бактериоза и низким температурам // Биополимеры и клетка. - 2000.-Т.16, №3.- С. 227-232.

11. Губанова Н.Я., Дубровная О.В., Чугункова Т.В. Отбор и сравнительный анализ устойчивых к солевому стрессу каллусных культур кормовой свеклы, полученных из эксплантов различной плоидности // Физиология и биохимия культ. растений. - 2000.-Т. 32, №5.-С. 362-368.

12. Лялько И.И., Дубровная О.В. Проявление признака ограниченного роста побегов у семенников кормовой свеклы // Цитология и генетика. - 2000. - Т. 34, №4. - С. 21-26.

13. Лялько И.И., Дубровная О.В., Шевцов И.А. Проявление признака опушенности листовых пластинок у кормовой свеклы // Цитология и генетика. - 2001. - Т. 35, №4. - С. 48-54.

14. Лялько І.І., Дубровна О.В. Використання морфогенетичних ознак в гетерозисній селекції буряків // Генетика і селекція в Україні на межі тисячоліть. Глава у монографії. Київ: Логос, 2001. - Т.3. - С. 48-54.

15. Лялько І.І., Дубровна О.В., Сидоренко О.С., Баранова Л.П. Використання морфогенетичних ознак при створенні закріплювача стерильності у буряка цукрового // Вісник аграрної науки. - 2001. - №8. - С. 33-35.

16. Губанова Н.Я., Дубровная О.В., Чугункова Т.В. Клеточная селекция кормовой свеклы на устойчивость к нескольким стрессовым факторам // Биополимеры и клетка. - 2002. - Т.18, №3. - С. 565-571.

17. Губанова Н.Я., Дубровная О.В., Чугункова Т.В. Особенности ризогенеза у регенерантов кормовой свеклы, устойчивых к стрессовым факторам // Физиология и биохимия культ. растений. - 2002. - Т.33, №1. - С. 32-38.

18. Лялько І.І., Дубровна О.В. Генетична детермінація деяких морфологічних ознак листкового апарату у цукрового буряка // Физиология и биохимия культ. растений. - 2002. - Т.33, №5. - С. 432-438.

19. Дубровная О.В^., Лялько И.И., Глазко В.И. Сравнительное изучение инбредных линий сахарной свеклы по изоферментным маркерам // Физиология и биохимия культ. растений. - 2003. - Т.34, №2. - С. 144-151.

20. Дубровна О.В. Спектр аберацій хромосом в клітинних популяціях калюсних культур кормових буряків при відборі на стійкість до токсину збудника бактеріозу // Физиология и биохимия культ. растений. - 2003. - Т. 34, №3.-

С. 241-247.

21. Дубровная О.В., Лялько И.И., Парий Ф.Н. Генетический контроль морфологических признаков свеклы (Beta vulgaris L.) // Цитология и генетика. - 2003. - Т.37, №4.-С. 57-72.

22. Дубровная О.В., Тищенко Е.Н. Изменение уровня метилирования ДНК в культуре in vitro кормовой свеклы // Физиология и биохимия культ. растений. - 2003.-Т. 35, №5. - С. 434-440.

23. Дубровная О.В., Тищенко Е.Н. Геномная изменчивость морфогенного и неморфогенного каллуса кормовой свеклы // Цитология и генетика. - 2003. - Т.37, №6. - С. 23-30.

24. Дубровная О.В., Лялько И.И., Губанова Н.Я. Сомаклональная изменчивость растений сахарной свеклы по признаку стерильности пыльцы // Цитология и генетика. - 2004. - Т.38, №5.-С. 24-29.

25. Дубровна О.В. Цитогенетичний ефект дії NaCl та Na₂SO₄ на калюсні культури кормових буряків // Физиология и биохимия культ. растений. - 2005. - Т. 37, №1. - С. 30-36.

26. Деклараційний патент України №59136 А. Спосіб контролю гібридності рослин цукрових буряків / Дубровна О.В., Лялько І.І., Чугункова Т.В., Парій Ф.М. Бюл. №8. - 2003 р. - 6 с.

27. Деклараційний патент України №59137А. Спосіб створення закріплювачів стерильності цукрових буряків / Лялько І.І., Дубровна О.В., Парій Ф.М. Бюл. №8. - 2003 р. - 8 с.

28. Деклараційний патент України №59138 А. Спосіб створення міжлінійних гібридів цукрових буряків / Дубровна О.В., Лялько І.І., Чугункова Т.В. Бюл. №8. - 2003 р. - 7 с.

29. Дубровна О.В., Лялько І.І., Шевцов І.А, Глазко В.І. Генетичні та біохімічні особливості інбредних ліній цукрових буряків з опушеністю листкового апарату // Генетично модифіковані рослини: перспективи та проблеми. - Київ: Парламентське видавництво ВРУ. - 2003. - С. 127-132.

30. Дубровна О.В. Цитологічна мінливість калюсних культур кормових буряків під впливом різних стресових чинників // Приемы повышения урожайности растений: от продуктивности фотосинтеза к современным биотехнологиям. Киев: Национальний аграрный университет. - 2003. - C.108 - 111.

31. Гаврилюк О.Д, Дубровна О.В, Лялько І.І., Журавльова Н.В. Вплив синтетичних регуляторів росту на схожість насіння буряків // Збірник наукових праць ІЦБ УААН. - Випуск №5. - Київ: ІЦБ. - 2003. - С. 171-176.

32. Дубровна О.В., Лялько І.І. Мікроклональне відтворення селекційно-цінних форм цукрових та кормових буряків // Фактори експериментальної еволюції організмів. Збірник наукових праць. Т.1. - Київ: Аграрна наука. - 2003. - С. 410-414.

33. Дубровна О.В., Лялько І.І. Цитогенетична мінливість рослин-регенерантів цукрових буряків, отриманих шляхом прямої регенерації з експлантів різної плоїдності // Фактори експериментальної еволюції організмів. Збірник наукових праць. Т.2. - Київ: КВІЦ. - 2004. - С. 54-59.

34. Тищенко Е.Н., Дубровная О.В., Христан О.О. Вариабельность метилирования ДНК в культуре in vitro кормовой свеклы // Фактори експериментальної еволюції організмів. Збірник наукових праць. Т.2 - Київ: КВІЦ. - 2004. - С. 63-67.

35. Лялько И.И., Дубровная О.В., Чугункова Т.В. Морфологические мутации свеклы и возможности их использования // Естествознание и гуманизм. Сборник научных работ. Т.1, №2. - Томск: Сибирский гос. мед. университет. - 2004. - С. 62-64.

36. Дубровная О.В., Лялько И.И. Стабильность проявления новых маркерных признаков растений сахарной свеклы в культуре in vitro // Мат. Междун. конфер. «Молекулярная генетика и биотехнология». - Минск, октяб. 1998. - С. 177-178.

37. Gubanova N. Ya., Dubrovnaya O.V., Chugunkova T.V., Shevtsov I.A. Complex breeding in vitro on the resistance of Beta L. to a toxin of bacteriosis pathogene and low positive temperature // Inter. Sympos. on Plant Biotechnol. - Kyiv, Оctob., 1998. - Abstracts. - P.45.

38. Чугункова Т.В., Дубровная О.В., Шевцов И.А. Цитогенетический анализ растений-регенерантов, полученных из каллусных линий кормовой свеклы, устойчивых к различным стрессовым факторам // Тез. док. IV совещ. по кариосистематике растений. - Цитология. - 1999.- №12. - С. 1087-1088.

39. Дубровная О.В., Губанова Н.Я., Чугункова Т.В., Лялько И.И. Цитологические особенности растений-регенерантов, полученных из каллусных линий кормовой свеклы с комплексной устойчивостью к нескольким стрессовым факторам // Тез. 4 междунар. Конференции «Геном растений» 10-13 мая 2003, Одесса (Украина). С. 52.

40. Dubrovnaya O.V. Cytogenetic variability of fodder beet callus lines resistant to the toxine of bacteriosis upon durable culturing // VIII Internal. Conference «The Biology of Plant Cells in vitro and Biotechnology». - Saratov, September 9-13, 2003. - Abstracts. - P. 84.

41. Dubrovnaya O.V., Lyalko I.I. Microclonal propagation of sugar beet plants with economically valuable characters // VIII Internal. Conference «The Biology of Plant Cells in vitro and Biotechnology». - Saratov, Septемber 9-13,2003. - Abstracts. - P. 86.

42. Chugunkova T.V., Gubanova N. Ya., Dubrovnaya O.V. Fodder beet cell selection for the resistance to biotic and abiotic stress factors // VIII Internal. Conference «The Biology of Plant Cells in vitro and Biotechnology». - Saratov, Septемber 9-13. - Abstracts. - P. 70.

43. Дубровная О.В., Лялько И.И., Стрелец Л.А. Размножение мужскостерильных форм сахарной свеклы в культуре in vitro для селекции на гетерозис // V съезд общества физиологов растений России. - Пенза, 15-21 сентября 2003. - Пенза, 2003. - Тез. докл. - С. 509.

44. Тищенко Е.Н., Дубровная О.В., Корж Л.П., Христан О.О. Гиперметилирова-

ние ДНК каллюса подсолнечника и кормовой свеклы // V съезд общества физиологов растений России. - Пенза, 15-21 сентября 2003. - Пенза, 2003. - Тез. докл. - С. 527.

45. Лялько И.И., Дубровная О.В. Создание закрепителя стерильности сахарной свеклы с повышенной семенной продуктивностью, маркированного геном Н1 // Материалы конференции, посвященной 100-летию научной селекции в России. - Москва, 9-11 декабря 2003 г. - М.: МСХА. - 2003. - С. 114.

46. Dubrovna O., Lуalko I. Cytogenetical characteristic of mangel callus cultures resistant to a complex of stress factors // First (Inaugural) Ukrainian Congress for Cell Biology. - Lviv, April 25-28. - 2004. - P.198.

47. Дубровная О.В., Тищенко Е.Н. Метилирование ДНК и геномная нестабильность каллусных культур кормовой свеклы (Beta vulgaris L.) // III съезд ВОГиС «Генетика в XXI веке: современное состояние и перспективы развития». - Москва, 6-12 июня 2004. - Москва, 2004. - Тез. докл. Т.2. - С. 330.

48. Лялько И.И., Дубровная О.В. Изучение реакции на ЦМС самоопыленных материалов сахарной и кормовой свеклы, маркированных генами Hl и Hl^var // III съезд ВОГиС «Генетика в XXI веке: современное состояние и перспективы развития». - Москва, 6-12 июня 2004. - Москва, 2004. - Тез. докл. Т.1. - С. 221.

49. Tishchenko E.N., Dubrovnaya O.V. Absence of the competence to morphogenesis of callus culture mangel beet is accompanied by DNA methylation de novo and cytogenetic instability // The 14^th Congress of the Federation of Europen Societies of Plant Biology, August 2004, Cracow, Poland. - Abstract. - P.279.

50. Tishchenko E.N., Dubrovnaya O.V., Zaets I.E. Competence to morfogenesis and CpCpGpG-methylation of mangel beet callus culture // The 4^th International Iran and Russia Conference in Agriculture and Natural Resources, September 2004, ShahreKord, Iran. - Abstract. - P. 89-90.

51. Дубровная О.В., Тищенко Е.Н. Вариабельность метилирования CpCpGpG-последовательностей ДНК в процессе органогенеза in vitro кормовой свеклы // Мат. Междун. конфер. «Молекул. генетика, геномика и биотехнология». - Минск, 24-26 ноября 2004. - С. 153-154.

52. Дубровная О.В., Губанова Н.Я., Лялько И.И. Сомаклональная вариабельность растений-регенерантов кормовой свеклы, индуцированных из каллусных линий с перекрестной устойчивостью к токсину возбудителя бактериоза и низким температурам // Мат. Междун. конфер. «Молекул. генетика, геномика и биотехнология». - Минск, 24-26 ноября 2004. - С. 154-155.

Размещено на Allbest.ru