Біотехнологія одержання комплексних антианемічних препаратів та їх застосування для корекції адаптивних систем організму поросят в постнатальному онтогенезі

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень доповідалися на щорічних засіданнях Науково-технічної ради при Державному департаменті ветеринарної медицини Міністерства аграрної політики України протягом 2000-2005 рр.; під час наукових звітів та на конференціях Білоцерківського державного аграрного університету в 1994-2006 рр. та на інших наукових форумах, зокрема: на Всесоюзній нараді ”Новые аспекты участия биологически активных веществ в регуляции метаболизма и продуктивности сельскохозяйственных животных“ (Боровск, 1991); XIII міжнародній міжвузівській науково-практичній конференції “Новые фармакологические средства в ветеринарии“ (Санкт-Петербург, 2001); науково-практичній конференції “Нові технології та біотехнології у виробництві продукції тваринництва“ (Біла Церква, 2002); міжнародній науково-практичній конференції “Актуальні проблеми ветеринарної медицини в умовах сучасного ведення тваринництва” (Феодосія, АР Крим, 2003); науковій конференції докторантів та аспірантів “Наукові пошуки молоді на початку XXІ століття” (Біла Церква, 2003); міжнародній науково-практичній конференції “Молоді вчені у вирішенні проблем аграрної науки і практики” (Львів, 2003); VII міжнародній науково-практичній конференції “Наука і освіта - 2004” (Дніпропетровськ, 2004); міжнародній науково-практичній конференції “Сучасні аспекти розробки, маркетингу і виробництва ветеринарних препаратів” (Феодосія, АР Крим, 2004); науково-практичній конференції “Проблеми становлення галузі тваринництва в сучасних умовах” (Вінниця, 2005); міжнародній науково-практичній конференції “Ветеринарна медицина - 2005: сучасний стан та актуальні проблеми забезпечення ветеринарного благополуччя тваринництва” (Ялта, АР Крим, 2005); міжнародній науково-практичній конференції “Стан, проблеми та перспективи сучасної аграрної науки і практики” (Львів, 2005); міжнародній науковій конференції “Ветеринарні препарати: розробка, контроль якості та застосування” (Львів, 2005); VII International Conference of Young Scientists (TF, CUA. Prague, 2005); міжнародній науково-практичній конференції “Сучасні проблеми ветеринарної медицини у свинарстві” (Київ, 2006); Всеукраїнському з'їзді екологів (Вінниця, 2006); V державній науково-практичній конференції “Аграрна наука - виробництву” (Біла Церква, 2006).

Публікації. Основні положення дисертаційної роботи опубліковані у 40 наукових працях, з яких 22 статті у фахових виданнях, що входять до переліку, затвердженого ВАК України; 6 - у матеріалах і тезах конференцій; за результатами роботи розроблено 4 Технічні умови, 4 методичні рекомендації, отримано 4 патенти.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається зі вступу, огляду літератури, загальної методики та основних методів дослідження, результатів досліджень, узагальнення результатів досліджень, висновків та пропозицій виробництву, списку використаних джерел та додатків. Робота викладена на 362 сторінках комп'ютерного набору, містить 14 рисунків, 76 таблиць. Список літератури включає 509 джерел, у тому числі 201 - іноземні.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Огляд літератури. Проведено аналіз метаболізму Феруму в організмі тварин з метою об'єктивної оцінки ефективності, безпечності та допустимості застосування ферумвмісних препаратів. Наведено відомості щодо причин виникнення анемії поросят, з'ясовано розвиток постнатальних змін у клітинах системи гемопоезу внаслідок переходу організму до легеневого типу дихання. Розглядаються біотехнологічні аспекти можливості створення комплексних препаратів з антиоксидантними властивостями з використанням сучасних мембранних технологій.

Загальна методика й основні методи досліджень. Експериментальна частина, апробація та виробничі перевірки результатів досліджень виконані на білих щурах, безпородних кролях, клінічно здорових поросятах. Дослідження проводились протягом 1994-2005 рр. у лабораторіях НДІ екології та біотехнології Білоцерківського державного аграрного університету (БДАУ), кафедри фізики та вищої математики БДАУ, кафедри ветсанекспертизи і патанатомії БДАУ, Інституту колоїдної хімії та хімії води ім. О.В. Думанського НАН України, Київського науково-дослідного інституту судових експертиз Міністерства юстиції України, лабораторії токсикології Державного науково-дослідного контрольного інституту ветеринарних препаратів та кормових добавок (Львів). Науково-господарські досліди та впровадження результатів досліджень було проведено на базі навчально-дослідних господарств БДАУ, Чеського аграрного університету, м. Прага (Czech Republic) та в АТЗТ “Агро-Союз”, Сінельніківського району Дніпропетровської області. Дослідження проводили за загальною схемою.

Мета 1-ї серії дослідів - розробка біотехнологічних методів одержання металокомплексних сполук для профілактики аліментарної анемії сільськогосподарських тварин.

У модельних дослідах з метою одержання феритину, що є аналогом природних кластерних сполук Феруму, та вивчення його властивостей використовували гомогенат печінки свині. Феритин виділяли та очищували за методами Harrison P.M. (1978) і Лунева В.Е. и др. (1993). Отриманий феритин містив ~ 12 % Феруму від сухої маси. В модельних умовах in vitro одержували апоферитинові субодиниці, які не містять Феруму, шляхом діалізу проти 1% тіогліколевої кислоти (рН 5,5) з наступним діалізом проти 0,1 М натрій-боратного буферу, рН 8,5 (Лунев В.Е. и др., 1993). Спектри поглинання феритину, які, головним чином, обумовлені присутністю Феруму та розміром міцел молекул, вивчались у видимій та ультрафіолетовій ділянках спектра, на спектрофотометрі Specord М-400 (Німеччина).

Синтез комплексних сполук мікроелементів (Cu, Zn, Co) із гліцином здійснювали за методом, який виключає координацію органічного розчинника (Григор'єва Г.С. та ін., 1998); pН-метричне дослідження процесів комплексоутворення здійснювали за допомогою універсального іономіра ЭВ-74.

Комплекси Селену синтезовані в лабораторії НДІ екології та біотехнології шляхом механічної активації сумішей метіоніну з селенітом натрію (Луговая З.А. и др., 1998). Композицію комплексів мікроелементів створювали на основі суміші індивідуальних координаційних сполук. Будова металокомплексів підтверджена даними мікроелементного аналізу за допомогою атомно-абсорбційного спектрофотометра ААС-3, вивченням електронних та коливальних (інфрачервоних) спектрів (Накамото К., 1991; Браун Д. та ін., 1992).

Електронні спектри поглинання створених комплексів записували на спектрофотометрі Specord M-400 (Karl Zeiss, Jena), інфрачервоні - одержані у вазеліновій олії на спектрофотометрі Specord M-80 у лабораторії фізики та вищої математики БДАУ. Незалежну арбітражну оцінку підтвердження комплексоутворення проводили в лабораторії Київського НДІ судових експертиз Міністерства юстиції України на спектрофотометрі Specord M-80.

Для одержання висококонцентрованих стабільних колоїдних розчинів Феруму використані мембранні технології (Cho J., Amy G., 2000). Дослідження з адаптування існуючих сучасних мембранних технологій до розв'язання проблеми створення висококонцентрованих стабільних колоїдних розчинів декстрину Феруму проводили в лабораторіях НДІ екології та біотехнології у тваринництві та Інституту колоїдної хімії та хімії води ім. О.В. Думанського НАН України. Матеріалом для дослідження були мембранні фільтри з полісульфонаміду.

Для проведення біотехнологічних досліджень та виробництва препаратів у лабораторіях НДІ екології та біотехнології у тваринництві БДАУ та Інституту колоїдної хімії та хімії води ім. О.В. Думанського НАН України сконструйована пілотна установка: біореактор, ультрафільтраційна система, яка складається із трьох блоків, ємності з розподільною та запорною апаратурою, помпи плунжерного типу з мембранним модулем на основі керамічних фільтрувальних елементів, трубопровідів і плоскорамного мембранного модуля з ультрафільтраційними мембранами. На цій пілотній установці одержані комплексні антианемічні препарати Полімет та Полімет-Селен.

Токсикологічні дослідження препаратів на тваринах (щурах, кролях) виконували відповідно до методичних рекомендацій “Токсикологічний контроль нових засобів захисту тварин” (Косенко М.В. та ін., 1997; Коцюмбас І.Я та ін., 2005), розроблених Державним науково-дослідним контрольним інститутом ветеринарних препаратів та кормових добавок. Для визначення стабільності препаратів використовували модифікований прискорений ізотермічний метод (Котиков С.В. и др., 1991).

Друга серія досліджень включала вивчення впливу одержаних препаратів на зоотехнічні, гематологічні, біохімічні та господарсько-економічні показники при профілактиці аліментарної анемії.

Проведено три науково-господарські досліди, а отримані результати перевіряли в умовах виробництва. Методи постановки дослідів грунтувалися на ідентичності всіх факторів, крім досліджуваного. В усіх трьох дослідах групи формувалися з новонароджених поросят за принципом аналогів, враховуючи вік, стать, породу, живу масу (Кононенко В.К., Ібатуллін І.І., 2000).

У першому досліді, що проводився на базі навчально-дослідного господарства БДАУ, було сформовано три групи поросят по 20 голів - дві дослідні й одна контрольна.

У 3-денному віці поросятам внутрішньом'язово вводили по 2мл: у першій групі - препарат Полімет, у другій - препарат Урсоферан. Поросята контрольної групи отримували фізіологічний розчин.

Зважування поросят проводили на 3-, 15-, 35- і 60-й дні після народження. Кров для дослідження відбирали на 5-, 10- та 15-й дні життя.

У другому досліді, що проводився на базі навчально-дослідного господарства БДАУ, було сформовано три групи поросят по 25 голів - 2 дослідні та одна контрольна.

У 3-денному віці тваринам внутрішньом'язово вводили по 2мл: у першій групі - препарат Полімет-Селен, у другій - Урсоферан. Поросята контрольної групи отримували фізіологічний розчин у дозі 2 мл.

Зважування поросят проводили на 2-, 15-, 21-, 30- та 60-й дні після народження. Кров для дослідження відбирали на 5-, 10- та 15-й дні життя.

У 2002-2003 роках в умовах свинокомплексу АТЗТ "Агро-Союз" проведено виробничу апробацію застосування препаратів Полімет та Полiмет-Селен. Було створено три дослідні групи тварин, яким за затвердженою схемою уводили антианемічні профілактичні препарати. Контрольна група тварин отримувала Суїферон у дозi 5 мл + повторне введення через 10 i 20 днiв по 5 мл. Дослiдним тваринам уводили препарат Полімет та Полiмет-Селен в дозi 2 мл одноразово. Кількість поросят у групах становила по 750 голів. Зважування поросят проводили на 3-, 21- та 40-й дні життя.

У 2002-2005 роках ефективність застосування антианемічних препаратів вітчизняного виробництва вивчалася на базі навчально-дослідного господарства Чеського аграрного університету. Було сформовано 3 групи поросят по 30 голів. У 4-денному віці тваринам внутрішньом'язово вводили: першій групі - препарат Полімет у дозі 2 мл, другій - препарат Ферибіон, доза введення та концентрація Феруму аналогічні; третій групі вводили препарат Полімет-Селен у дозі 2 мл. Зважування поросят проводили на 4-, 15-, 30- та 60-й дні життя.

Визначення ефективності дії препаратів здійснювали за приростами живої маси та збереженістю поголів'я.

Методи досліджень. У крові визначали вміст гемоглобіну гемоглобінціанідним методом на приладі SPEKOL 11 (Левченко В.І., 2002), кількість еритроцитів та лейкоцитів - пробірковим методом у лічильній камері з сіткою Горяєва, вміст гемоглобіну в еритроциті (ВГЕ) та кольоровий показник (КП) - за таблицями (Маханько А.В., Герасименко В.Г., 1974).

Вміст білка в сироватці крові визначали за Lowry O.H. (1951); загальну залізозв'язувальну здатність сироватки крові (ЗЗЗ) - за методикою фірми “Агат”; вміст сульфогідрильних груп (HS-груп) - за Ellman G., (1959); концентрацію Феруму, Купруму, Цинку та Кобальту в сироватці крові - методом атомно-абсорбційної спектрофотометрії на приладі AAS-3 (Хавезов И., 1983). Концентрацію Селену досліджували флуорометричним методом з 2,3-діамінонафталіном (Антонов Б.И. и др., 1991).

Вміст сполук з ізольованими подвійними зв'язками (СІПЗ), дієнових кон'югатів (ДК), кетодієнів та сполучених триєнів визначали у гептан-ізопропанольних екстрактах крові тварин за методом, описаним Волчегорским И.А. и др., (1989), гідропероксидів ліпідів за Гавриловим В.Б. та Мишкорудною М.И. (1983), кількість кінцевих продуктів ПОЛ (ТБК-активних продуктів) в плазмі крові оцінювали за методом Коробейниковой Э.М. (1989), активність ферментативного та неферментативного ПОЛ у мембранах еритроцитів вивчали за швидкістю накопичення ТБК-активних продуктів за методом, описаним Стальной И.Д., Гаришвили Т.Г. (1977).

Глутатіонредуктазну (ГР) активність (ГР; НАДФ?Н): окиснений глутатіон оксидоредуктаза, КФ 1.6.4.2) еритроцитів визначали за методом Юсуповой Л.Б. (1989), а глутатіонпероксидазну (ГПО) активність (ГПО; глутатіон: пероксид гідрогену оксидоредуктаза, КФ 1.11.1.9) - за методом, описаним Моин В.М. (1986).

Для визначення церулоплазміну (ЦП) застосовували модифікований метод, в якому використано реакцію з о-фенілендіаміном (Сиверина О.Б. та ін., 1986). Каталазну активність (КАТ; пероксид гідрогену: пероксид гідрогену оксидоредуктаза, КФ 1.11.1.6) визначали у реакції з молібдатом амонію за методом Королюк М.А. и др. (1988). Супероксиддисмутазну активність (СОД; супероксид: супероксидоксидоредуктаза, КФ 1.15.1.1) знаходили за методом, який грунтується на інгібуванні ферментом відновлення нітросинього тетразолію у присутності NADH і феназинметасульфату (Журкин А.Т., Дубинина Е.Е. и др., 1988).

Вміст вітаміну Е визначали в реакції з залізодипіридиловим реактивом (Антонов Б.И. и др., 1991), кількість відновленого глутатіону (GSН) визначали за методом, який оснований на взаємодії сульфогідрильних груп з реактивом Елмана (1960).

Активність амінотрансфераз (АсАТ; L-аспартат: 2-оксоглутарат амінотрансфераза, КФ 2.6.1.1), (АлАТ; L-аланін: 2-оксоглутарат амінотрансфераза, КФ 2.6.1.2), лужної фосфатази (ЛФ; КФ 3.1.3.1) і загального білірубіну визначали з використанням стандартних наборів реактивів науково-виробничої фірми “SIMKO”. Дослідження вмісту сечовини проводили за кольоровою реакцією з діацетилмонооксимом (Marsh W., Miller H., 1965). Вміст оксипроліну у м'язовій тканині знаходили за методикою Дінарієвої Г.П. та ін. (1979), триптофану - за методикою Fische F. (1960).

Результати досліджень опрацьовували за стандартними статистичними методами у програмі Microsoft Excel. Вірогідність різниці між групами оцінювали за критерієм Стьюдента (Плохинский Н.А., 1969 ).

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Технологія конструювання кластерних сполук феруму. Сформульована нами концепція створення та підвищення ефективності біопрепаратів базується на використанні механізмів, які мають місце в організмі ссавців. Підгрунтям при створенні нетоксичного препарату було використано молекулу феритину з кластерними сполуками Феруму (III) у її складі, яка в організмі бере участь у депонуванні цього елемента (Яцимирский К.Б., 1979).

Теорія росту кристалів дає підставу вважати, що шляхом регулюванння процесу їх утворення можна контролювати кількість ядер і ступінь заповнення молекул феритину. Враховуючи, що оболонки апоферитину в умовах in vitro можуть накопичувати Ферум та утворювати продукт, подібний до феритину (Харисон П.М. и др., 1978), нами були проведені експерименти в умовах in vitro щодо відтворення цих молекул. Піддані перевірці такі підходи:

1. Відтворення міцел феритину в присутності апоферитинових субодиниць та солей Феруму (ІІ) у розчині бікарбонатного буферу (рН=7,6) при додаванні Оксигену. 2. У розчині трис-буферу (pH 6,6-7,4) в присутності молекул апоферитину та солей Феруму (ІІІ). 3. Апоферитинові субодиниці, солі Феруму (ІІ) у безбуферному розчині (pH 5,8-7,4), додаванні КIО₃ та Na₂S₄O₆. 4. В присутності апоферитинових субодиниць та солей Феруму (ІІI) поступово додавали розчин NH₄OH (Харисон П.М. и др., 1978). Порівнюючи спектри відтворених молекул феритину із спектральними характеристиками нативного феритину, виявили, що найбільш близькими за спектральними характеристиками є міцели, які отримані за підходом 1.

Молекула нативного феритину захищена та стабілізована білковою оболонкою, але для захисту створених кластерних міцел Феруму неможливо використати чужорідні білки чи пептиди через їх антигенність, тому були проведені дослідження з використання інших біополімерів - вуглеводів. Декстран, що використовується в антианемічних препаратах, є імпортованим продуктом. З огляду на це, як стабілізуюча речовина був використаний одержаний за розробленою нами технологією модифікований декстрин, який має переваги над декстраном. Технологічна схема його одержання включає підготовку сировини, температурну декстринізацію (120?С), введення модифікатора (NaН₂РО₄), виділення та очищення модифікованих декстринів, контроль якості одержаного продукту.

Результати досліджень щодо відтворення молекул феритину було взято за основу технології конструювання захищених міцел Феруму (III) гідроксиду, які за своїми фізико-хімічними та біологічними характеристиками максимально наближені до природних сполук, що накопичують залізо, - феритинів.

У модельних умовах шляхом регулювання швидкості надходження модифікованого декстрину, який формує оболонку, проводили відтворення міцел - аналогів феритину в присутності декстрину та солей Феруму (ІІ) у розчині бікарбонатного буферу (рН=7,6) при додаванні Оксигену. Таким чином контролювали умови кристалізації кластерів за рахунок підвищення локальної концентрації Феруму, яка сприяє утворенню поліядерних комплексів, що є основою нативного феритину.

Сконструйовані кластерні сполуки містять Ферум (III) гідроксид, а розміри одержаних міцел наближені до розмірів та характеристик міцел феритину, що підтверджується спектральними параметрами одержаних комплексів. Як стабілізуюча речовина використаний одержаний за розробленою нами технологією модифікований фосфатом декстрин. Внаслідок такого технологічного прийому ми отримали феродекстринову композицію.

Згідно з розробленою технологією одержана феродекстринова структура стабілізованих сполук Феруму складається із ядра, що містить активну речовину у вигляді кристалітів (великих кластерів) Феруму (III) гідроксиду, захищену вуглеводно-фосфатною оболонкою, яка у фізіологічних умовах не має прооксидантної дії, характерної для іонів та низькомолекулярних комплексів Феруму. Така структура наближена до природної структури молекули феритину.

Технологія одержання металохелатних комплексів. Наступним завданням було створення композиції металокомплексних сполук. Ендогенні мікроелементи перебувають виключно у вигляді координаційних сполук з органічними лігандами - простими та складними компонентами тканин та рідин організму. Для підвищення біодоступності та нешкідливості металовмісних препаратів іонні сполуки мікроелементів замінюються їх комплексами з органічними лігандами (Григор'єва Г.С. та ін., 1998; Захаренко М., Шевченко Л., 2004).

Синтез металокомплексних сполук здійснено за методом, який передбачає взаємодію iона відповідного металу (Си, Zn, Cо) у складі водного розчину його солі з водним розчином еквімолярної суміші ліганду (гліцину). Композицію комплексів мікроелементів створювали на основі суміші індивідуальних координаційних сполук.

Структура одержаних комплексних сполук була підтверджена методами ультрафіолетової (УФ) та інфрачервоної (ІЧ) спектроскопії, а їх чистота - елементним аналізом за допомогою методу атомно-абсорбційної спектрофотометрії.

Аналіз досліджуваних електронних спектрів, при яких змінюється енергетичний стан електронів, дає змогу зробити висновок, що при послідовному заміщенні молекул води у координаційній сфері акваіона Cu(H₂O)₆ ²⁺ молекулами бідентного гліцину та утворюванні декількох хелатних циклів, змінюється геометрія комплексів, збільшується стійкість координаційного поліедра внаслідок хелатного ефекту та збільшення кількості більш міцних зв'язків метал - Нітроген в екваторіальній площині комплексу (Иванов С.В. и др., 1991). Атом Купруму стає більш позитивним і сильніше притягує ліганди у площині, віддзеркаленням чого є зсув максимуму смуги поглинання у короткохвильовій ділянці спектра. Це підтверджує результати, що одержані у комплексах Купруму з аланіном (Иванов С.В., Троцюк И.В.,1994).

Інфрачервона (коливальна) спектроскопія є одним з найбільш зручних методів дослідження комплексів та місць локалізації координаційних зв'язків. У коливальному спектрі виділяють характеристичні частоти, які часто дуже істотно зсуваються при хелатоутворенні. На цій підставі можна зробити висновок про утворення та місце локалізації координаційного зв'язку в металохелатах (Белами Л., 1963, Накамото К., 1991; Браун и др., 1992). При координації донорних атомів функціональних груп амінокислот з іонами металів змінюється інтенсивність та положення смуг валентних та деформаційних коливань.

Дослідження ІЧ-спектра координаційних сполук Купруму дало змогу встановити, що положення смуг та інтенсивність валентних коливань карбоксильних груп у спектрах комплексів відрізняється від їх положень у спектрах амінокислоти, яка має дві смуги поглинання іонізованої карбоксильної СОО- групи: 1597 см-¹ - валентні асиметричні коливання та 1412 см-¹ -симетричні коливання (Накамото К., 1991).

Одночасно, при утворенні хелатних сполук амінооцтової кислоти з іонами Купруму відбуваються зміни в положеннях максимумів і вигляді смуг коливань аміногрупи в ІЧ-спектрах комплексів; максимум валентних та деформаційних коливань зміщується в область більш високих частот (відповідно: (Н₂) 3320 см^-1 - 3000 см-¹; (Н₂) 1608 см-¹ ). Наведені дані свідчать про утворення координаційних сполук амінокислоти з іонами Купруму, при цьому в утворенні комплексу беруть участь карбоксильна та аміногрупи. Амінокислота виконує функції бідентатного ліганду, утворюючи з іоном Купруму хелатний комплекс (Накамото К., 1991; Захаренко М.О. та ін., 2004).

Використання мембранних технологій для одержання препаратів. Наступним завданням було одержання висококонцентрованих стабільних колоїдних розчинів Феруму, які необхідні для одержання препарату, котрий містить цей елемент у кількості, що дозволяє його одноразове використання тваринам. Для здійснення мети було розроблено методику, що передбачає використання сучасних мембранних технологій. Мембранні процеси надзвичайно зручні для автоматизації виробництва і дозволяють працювати із найбільш нестійкими, лабільними речовинами (Moreno F., Valderrabano F., 1998).

Основою сконструйованої ультрафільтраційної системи є мембранний блок.

Принцип дії блоку заснований на мембранному розподілі компонентів водного розчину. Цей процес реалізується в плоскорамному мембранному модулі, що складається з фільтрувальних елементів-рамок із закріпленими на ньому полісульфонамідними мембранами, які не піддаються бактеріальній деградації. Розроблена спільно зі співробітниками Інституту колоїдної хімії та хімії води ім. О.В. Думанського НАН України система для ультрафільтрації і концентрування - модульного типу. Комірки плати з мікропористими мембранами об'єднані в модулі із загальною площею фільтрувальної поверхні близько 5 м². Модулі, у свою чергу, зібрані у блок, у корпусі котрого розміщені тримачі для плат і штуцери, через які надходить фільтрувальний розчин та відводиться очищений і концентрований продукт.

Фільтрувальні елементи відокремлені один від одного герметизуючими прокладками. Пакет стиснутий між плитами з колекторами для подачі та відведення розчину. Очищення міцелярного продукту відбувається за рахунок прокачування розчину за допомогою плунжерної помпи і фільтрування розчину, який містить електроліти та органічні продукти, що використовуються для стабілізації колоїду. При цьому електроліти розчину колоїду відфільтровуються мембраною у режимі тангенціальної ультрафільтрації з наступним поверненням в ємність з вихідним продуктом. Для масштабування процесу та збільшення загальної площі ультрафільтрації нами розроблено двосекційний мембранний модульний блок, площа фільтрувальної поверхні якого досягає 10 м².

Основним об'єктом для проведення біотехнологічних досліджень та виробництва продукції є сконструйований біореактор, який виготовлений із хімічно інертного матеріалу, ємністю 250 л, обладнаний якірною мішалкою для перемішування речовин і поліпшення теплообміну, зі змінною частотою обертання, верхнім люком для завантаження сировини в реактор та нижнім зливом. Вивантаження та перекачування розчину в інший апарат здійснюється за допомогою помпи. На стадії лабораторних досліджень були визначені основні гідродинамічні й масообмінні характеристики біореактора, розроблені окремі вузли системи, що дозволило досягти необхідних техніко-економічних показників роботи реактора. Розробка конструкції, оснащення різними периферійними приладами дозволило значно розширити його технологічні можливості як при проведенні експериментів, так і під час експлуатації біореактора.

Пілотна установка з виробництва комплексних антианемічних препаратів складається з наступних приладів та обладнання для здійснення технологічного процесу: зворотно-осмотична система для одержання апірогенної води, модульні мембранні блоки ультрафільтрації, помпа, реактор. Технологічна схема пілотного виробництва включає конструктивні особливості: мембранну систему ультрафільтрації з декількох блоків-секцій та потужну помпу плунжерного типу, які дозволяють одержати продукцію в межах промислового виробництва.

Одержану за допомогою зворотно-осмотичної системи апірогенну воду помпою перекачують у реактор, де суміш інкубують при додаванні модифікованого декстрину, солей Феруму, стабілізаторів та ін., внаслідок чого отримують стійкі кластерні сполуки Феруму.

Після інкубації одержаний продукт піддають ультрафільтрації, вводять хелатні комплекси металів, знову піддають ультрафільтрації з доведенням кінцевого продукту до стандартизованих параметрів, які закладено в ТУ У на відповідний препарат (ТУ У 24.4.00493712.004-2003, ТУ У 24.4. 00493712.006-2003).

Ефективність застосування комплексного антианемічного препарату Полімет. Основними фізико-хімічними параметрами одержаного комплексного препарату Полімет є: стерильна, стабільна комплексна сполука Феруму (ІІІ) гідроксиду з декстринами у вигляді захищеного колоїду з концентрацією діючої речовини Fe (ІІІ) - 85 мг/мл та металохелатних сполук Купруму - 0,5 мг/мл, Кобальту - 0,2 мг/мл, Цинку - 0,4 мг/мл .

Впровадження у практику антианемічних препаратів потребує токсикологічного контролю, який здійснюють відповідно до стандарту, розробленого Державним науково-дослідним контрольним інститутом ветеринарних препаратів та кормових добавок (Косенко М.В. та ін., 1997; Коцюмбас І.Я. та ін., 2006). Цей стандарт регламентує основні положення щодо встановлення нешкідливості ветеринарних препаратів, одним з яких є визначення їх токсичності. Гостру токсичність препарату Полімет досліджували на білих щурах 2,5-місячного віку. У результаті проведених випробувань установлено, що DL₅₀ для білих щурів становить 2 380 мг/кг маси, тобто створений препарат належить до класу малотоксичних сполук (Малинін О.О. та ін., 2002).

Основне завдання при розробці препаратів для потреб ветеринарної медицини - це одержання високоефективної, стабільної лікарської форми. Для оцінки стабільності біопрепаратів різної природи при їх тривалому зберіганні використовували прискорений ізотермічний тест термостабільності при підвищених температурах (Котиков С.В. и др., 1991). Вивчення кінетики інактивації комплексного препарату Полімет при підвищених температурах дозволило кількісно оцінити його стабільність, прогнозувати термін зберігання залежно від температури і встановити, що препарат є стабільним протягом 2-х років.

Дослідженнями крові поросят виявлено, що введення антианемічних препаратів Урсоферан (Німеччина) та Полімет (Україна) призводить до вірогідного підвищення вмісту гемоглобіну та кількості еритроцитів у дослідних поросят порівняно з тваринами контрольної групи (p<0,01 та p<0,05 відповідно). Проведені нами дослідження показали, що загальний вміст білків у плазмі крові поросят контрольної групи знижується на 10- та 15-й дні, тобто зменшується білоксинтезуюча функція печінки. Найбільший уміст білків у плазмі був у поросят дослідної групи, які отримували препарат Полімет (p<0,01).

Аналіз активності аспартатамінотрансферази та аланінамінотрансферази дозволив встановити, що у поросят, яким уводили Урсоферан, спостерігали тенденцію до підвищення активності АсАТ, вірогідне підвищення активності АлАТ на 10-у добу експерименту та зниження коефіцієнта Де Рітіса на 10-у та 15-у добу експерименту (p<0,01 та p<0,05). Зміни кількісного співвідношення активностей амінотрансфераз вказують на певне гальмування системи природної детоксикації організму поросят, яким уводили монокомпонентний ферумдекстрановий препарат. У поросят, яким уводили Полімет, спостерігали зниження активності трансаміназ (p<0,05) та нормалізацію коефіцієнта Де Рітіса.

Проведені дослідження показали, що концентрація сечовини - індикатора інтенсивності дезамінування амінокислот - у плазмі крові 10- та 15-добових поросят дослідних груп була вірогідно меншою (p<0,01). Дані результати свідчать про зниження інтенсивності дезамінування амінокислот і підвищення ефективності анаболічних процесів у тканинах поросят дослідних груп, особливо тих, яким уводили препарат Полімет.

Одночасно встановлено, що вміст загального білірубіну у поросят контрольної групи вірогідно зростає на 15-у добу (p<0,01), а у поросят першої дослідної групи спостерігали підвищення вмісту білірубіну відносно 2-ї групи (p<0,05).

Отримані дані свідчать, що введення поросятам ферумдекстранового препарату призводить до активації пероксидних процесів та збільшення у крові вмісту продуктів пероксидного окиснення ліпідів.

Кількість сполук з ізольованими подвійними зв'язками (СІПЗ) - субстратів ПОЛ, вірогідно зменшується на 5-у та 10-у добу (p<0,01, p<0,05), а концентрація дієнових кон'югатів (ДК), гідропероксидів ліпідів, кетодієнів і сполучених триєнів збільшується відповідно на: 5-у добу - p<0,05; 10-у добу - p<0,01, p<0,05, p<0,01).

У пізніші строки (15-а доба) спостерігається тенденція до нормалізації показників ПОЛ. Одночасно на 15-у добу експерименту у крові поросят контрольної групи знижувався вміст СІПЗ (p<0,001), зростала кількість ДК (p<0,001) та гідропероксидів ліпідів (p<0,05). При дослідженні крові поросят, яким уводили Полімет, виявлено оптимізацію вмісту СІПЗ відносно 1-ї групи на 5-у добу (p<0,01), зменшення концентрації дієнових кон'югатів, гідропероксидів ліпідів, кетодієнів та сполучених триєнів на 10-у добу (відповідно: p<0,001, p<0,05, p<0,01). Такий ефект, на нашу думку, зумовлений формою Феруму, яка наближена до нативної, та біологічною роллю комплексних сполук біометалів як компонентів та індукторів природних біологічних антиоксидантних систем, що беруть участь у підтриманні окисно-відновного гомеостазу. Використання комплексних сполук з різним механізмом дії збільшує їхній антиоксидантний потенціал та підсилює сукупний біологічний ефект.

Результати досліджень вмісту у плазмі крові кінцевих продуктів ПОЛ та стану антиоксидантної системи поросят свідчать про те, що при введенні тваринам залізодекстранового препарату спостерігається статистично вірогідне підвищення концентрації ТБК-активних продуктів (малоновий діальдегід та ін.) у плазмі крові поросят, яким уводили Урсоферан, на 10- та 15-у добу експерименту (p<0,01, p<0,001).

У плазмі крові поросят, яким уводили Полімет (2-а група) вірогідно підвищується вміст церулоплазміну (ЦП) на 10- (p<0,01) та 15-у добу (p<0,05). ЦП є основним зовнішньоклітинним антиоксидантом плазми, завдяки прискоренню окиснення Fe²⁺ до Fe³⁺, він сприяє зв'язуванню Феруму з трансферином.

Разом із трансферином церулоплазмін утворює прооксидантно-антиоксидантну буферну систему крові, яка бере участь у підтриманні окиснювального гомеостазу. Таким чином, підвищення активності ЦП у плазмі крові поросят 2-ї дослідної групи сприяє переходу прооксидної форми Феруму у транспортну у складі трансферину і зменшенню пула низькомолекулярного токсичного Феруму у плазмі. При цьому гальмуюється його взаємодія з H₂O₂, який при зниженні активності глутатіонпероксидази та каталази клітин шляхом дифузії проникає в плазму і вступає у реакцію Фентона з утворенням токсичного гідроксильного радикалу.

Використання Урсоферану призводить до зниження активності супероксиддисмутази у крові поросят 1-ї дослідної групи на 10-у добу експерименту (p<0,05). Дослідженнями встановлено підвищення вмісту токоферолу, антиоксиданта ліпідної фази, у крові поросят 1-ї дослідної групи на 5-у добу експерименту (p<0,05) , яке зумовлено або його перерозподілом між тканинами, або виходом із “депо”. На 10-у добу досліду у крові поросят цієї групи спостерігали зменшення концентрації токоферолу (p<0,05), можливо, пов'язане з тим, що фактори, які стимулюють активацію ПОЛ, сприяють використанню токоферолу в захисних реакціях. На 15-у добу експерименту було встановлено відновлення рівня токоферолу порівняно з 2-ю дослідною групою.

Таким чином встановлено, що введення тваринам препарату Урсоферан спричинює активацію вільнорадикальних процесів, що за умови зниження активності системи антиоксидантного захисту може призводити до окиснювальних ушкоджень клітинних компонентів та розвитку оксидативного стресу (Снітинський В.В. та ін., 2003).

При вивченні обміну мікроелементів в організмі поросят у результаті застосування антианемічних препаратів було встановлено, що концентрація сироваткового Феруму на 10-й день була більшою порівняно з аналогічними показниками у тварин контрольної групи (p<0,001). Загальна ферумзв'язувальна здатність (ЗФЗЗ) сироватки крові поросят дослідних груп була вірогідно нижчою, ніж у тварин контрольної групи (p<0,001). Високі значення загальної ферумзв'язувальної здатності сироватки у поросят контрольної групи є наслідком підвищеного синтезу трансферину як компенсаторного фактора у відповідь на дефіцит Феруму в організмі (Дворецкий Л.И., 1998).

Коефіцієнт насичення трансферину Ферумом у поросят дослідних груп був вірогідно вищим, ніж у тварин контрольної групи, і досягав максимуму у групі, де застосовували ферумдекстрановий препарат Урсоферан. У нормі трансферин насичується Ферумом приблизно на 30-40% його максимальної можливості. При насиченні трансферину Ферумом більш як на 50% деяка частина його може зв'язуватися з іншими білками (альбумінами) або знаходитись у вигляді низькомолекулярних комплексів (Andrews N.C., 1999). Ступінь утилізації Феруму не може бути вищим, ніж ферумзв'язувальна здатність транспортних білків. Підтвердженням цього є та обставина, що у поросят, яким застосовували Урсоферан, спостерігається підвищення рівня Феруму у сироватці крові порівняно з показниками тварин, яким уводили Полімет, при фактично однаковій ЗФЗЗ сироватки та підвищення коефіцієнта насичення трансферину Ферумом. Це свідчить про збільшення фонду нетрансферинового Феруму при використанні монокомпонентного ферумдекстранового препарату.

Відомо, що гем-оксигеназа, яку вважають маркерним ферментом оксидативного стресу (Калиман П.А., 2002), функціонує як захисна система й індукується при збільшенні концентрації низькомолекулярного Феруму. Зниження рівня загального білірубіну в сироватці крові поросят, яким уводили Полімет, свідчить про гальмування активності гем-оксигенази внаслідок зменшення концентрації низькомолекулярного нетрансферинового Феруму - джерела активних форм Оксигену, які ушкоджують мембрани клітин, оскільки індукцію синтезу гем-оксигенази розглядають як складову частину механізму захисту клітин від окиснювального стресу .

Результати проведених нами досліджень свідчать, що використання Полімету спричинює вірогідне збільшення (p<0,01) концентрації Цинку у плазмі крові поросят на 5-у добу експерименту відносно контрольної та 1-ї дослідної груп. На 10- та 14-у добу досліду рівень Цинку знижується до показників 1-ї дослідної групи. Відомо, що існує чітка обернена залежність між рівнем металотіонеїнів (МТ) та вмістом Цинку у плазмі крові. Оптимізація рівня Цинку у плазмі крові поросят, яким уводили Полімет, свідчить, що за рахунок здійснення ендокринної регуляції відбувається індукція експресії МТ у печінці, що спричинює зниження рівня Цинку у плазмі крові поросят даної групи. Одночасно у плазмі крові поросят цієї групи підвищується вміст Купруму у складі церулоплазміну, що узгоджується з літературними даними (Барабой В.А. та ін., 2003).

Важливу роль у процесах гемопоeзу відіграє Кобальт, який є індуктором продукції еритропоетину (ЕРП) (Ohigasi N., at al., 1993). Дослідженнями вмісту цього елемента у плазмі крові поросят встановлено, що на 5-у добу досліду спостерігається вірогідне (p<0,05) підвищення вмісту біометалу в крові поросят 2-ї дослідної групи, на 10-у добу досліду не встановлено вірогідних змін його вмісту у крові поросят усіх груп, а на 15-у добу відмічалося вірогідне зниження вмісту Кобальту у крові поросят контрольної групи (p<0,05).

Таким чином, проведені дослідження дають змогу зробити висновок, що використання антианемічного монокомпонентного ферумдекстранового препарату спричинює підвищення пулу низькомолекулярного токсичного Феруму, який є ініціатором утворення активних метаболітів Оксигену, внаслідок чого спостерігається зміщення антиоксидантно-прооксидантної рівноваги в бік прооксидантних процесів. Уведення комплексного препарату сприяє нормалізації метаболізму Феруму в організмі та супроводжується зменшенням концентрації його лабільної форми у тканинах та нетрансферинового Феруму - у крові.

Метаболічний захист від оксидативного стресу пов'язаний з активацією антиоксидантних систем і тому стає важливим використання такого препарату, як Полімет, котрий спрямовано регулює стан антиоксидантного захисту, що значною мірою визначає характер перебігу антиоксидантно-прооксидантного процесу. Дослідженнями щодо визначення ефективності препарату Полімет встановлено, що на 60-й день жива маса поросят в 2-й групі тварин (Полімет) була більшою (p<0,001), ніж у поросят контрольної групи та у поросят, яким уводили Урсоферан (p<0,01).

Ефективність застосування антианемічного препарату Полімет-Селен. Для підсилення антиоксидантної дії та активації глутатіонової ланки антиоксидантного захисту нами сконструйований препарат Полімет-Селен, в якому Селен знаходиться в комплексі з метіоніном. Це стерильна, стабільна комплексна сполука Феруму (ІІІ) гідроксиду з поліцукрами з концентрацією Fe (ІІІ) - 85 мг/мл та металохелатними сполуками Купруму - 0,5 мг/мл, Кобальту - 0,2 мг/мл, Цинку-0,4 мг/мл та Селену - 0,05 мг/мл.