Розробка системи молекулярно-генетичного моніторингу високопатогенного грипу птиці (вірус типу А субтип Н7)

Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ АГРАРНИХ НАУК УКРАЇНИ

НАЦІОНАЛЬНИЙ НАУКОВИЙ ЦЕНТР

«ІНСТИТУТ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЇ І КЛІНІЧНОЇ

ВЕТЕРИНАРНОЇ МЕДИЦИНИ»

УДК 619:578.832.1:636.5:616-076

РОЗРОБКА СИСТЕМИ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧНОГО МОНІТОРИНГУ ВИСОКОПАТОГЕННОГО ГРИПУ ПТИЦІ (ВІРУС ТИПУ А СУБТИП Н7)

16.00.03 -- ветеринарна мікробіологія,

епізоотологія, інфекційні хвороби та імунологія

АВТОРЕФЕРАТ дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата ветеринарних наук

СИМОНЕНКО Сергій Іванович

Харків 2010

Дисертацією є рукопис.

Роботу виконано в Харківській державній зооветеринарній академії і Національному науковому центрі «Інститут експериментальної і клінічної ветеринарної медицини».

Науковий керівник: доктор ветеринарних наук, професор, академік НААН України, заслужений діяч науки і техніки України, лауреат Державної премії України Стегній Борис Тимофійович, Національний науковий центр «Інститут експериментальної і клінічної ветеринарної медицини», директор

Офіційні опоненти: доктор ветеринарних наук, професор, академік НААН України Красніков Геннадій Андрійович, Національний науковий центр «Інститут експериментальної і клінічної ветеринарної медицини», завідувач відділу патоморфології, імунології та біохімії;

Для досягнення цієї мети були поставлені такі задачі:

· провести епізоотологічний аналіз щодо грипу птиці в Україні та світі;

· провести аналіз існуючих комерційних та некомерційних тест-систем з виявлення та типування вірусу грипу;

· розробити та випробувати системи праймерів для індикації та ідентифікації РНК вірусу високопатогенного грипу птиці H7-субтипу;

· розробити методики для виявлення РНК вірусу високопатогенного грипу птиці субтипу Н7 європейського та американського генотипів за допомогою полімеразної ланцюгової реакції;

· створити позитивний контрольний зразок гена гемаглютиніну вірусу грипу птиці субтипу Н7 європейського генотипу на основі технологій рекомбінантних ДНК;

· провести секвенування та філогенетичний аналіз вірусів грипу А субтипу Н7.

Об'єкт дослідження: високопатогенний грип птиці.

Предмет дослідження: вірус високопатогенного грипу птиці субтипу Н7, його лабораторна діагностика, молекулярно-генетичні тест-системи, полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР), молекулярне клонування, генотипова варіабельність, філогенетичний аналіз.

Методи дослідження. Робота виконана з використанням епізоотологічних, вірусологічних, молекулярно-генетичних, генно-інженерних, філогенетичних та статистичних методів досліджень.

Наукова новизна одержаних результатів. Наукова новизна роботи полягає у створенні бази даних секвенованих послідовностей основних генів та повністю секвенованих послідовностей кДНК ізолятів вірусу грипу А субтипу H7 з урахуванням генетичних структур, проведення їх комп'ютерного аналізу та виявлення консервативних структурних мотивів, вивчення рівнів ентропії останніх, варіабельності та ступеня філогенетичних зв'язків різних генотипів вірусу грипу підтипу Н7.

За результатами оцінки поліморфізму нуклеотидних послідовностей гена гемаглютиніну вірусу високопатогенного грипу субтипу Н7 встановлено наявність двох генотипів вірусу та сконструйовано системи праймерів для їх індикації. вірус птиця гемаглютинін генотип

На основі сконструйованих систем праймерів AivH7 (Eu) та AivH7 (Am) створено протоколи ідентифікації високопатогенних варіантів субтипу Н7 вірусу грипу А європейського та американського генотипів за допомогою ПЛР.

Уперше розраховано векторну молекулу на основі плазміди pCR_Blunt з вставкою гена гемаглютиніну вірусу грипу птиці субтипу Н7 європейського генотипу довжиною 641 п. н.

Уперше проведено широкі моніторингові дослідження щодо високопатогенного грипу птиці типу А Н5- та Н7-генотипів в Україні за допомогою розроблених методик з індикації та диференціації збудника захворювання на основі ПЛР.

Проведено генетичний аналіз ізолятів вірусу грипу А субтипу Н7 з колекції ННЦ «ІЕКВМ», за результатами якого встановлено їх належність до низькопатогенних штамів європейського генотипу субтипу Н7.

Практичне значення одержаних результатів. Результати досліджень були використані при розробці методик для виявлення РНК вірусів європейського та американського генотипів високопатогенного грипу птиці субтипу Н7 за допомогою ПЛР та дослідження їх внутрішньовидовової специфічності.

Розроблено позитивний контрольний зразок гена гемаглютиніну вірусу грипу птиці субтипу Н7 європейського генотипу на основі рекомбінантних ДНК.

Запропоновано «Методичні рекомендації щодо виявлення РНК американського та європейського генотипів високопатогенного вірусу грипу птиці субтипу Н7 та їх диференціації методом полімеразної ланцюгової реакції», які затверджені Науково-методичною радою Державного комітету ветеринарної медицини України (протокол № 1 від 23-24.12.2009 р.). Розроблено тест-систему для виявлення РНК високопатогенного вірусу грипу птиці субтипу Н7 методом ПЛР «Poul_RNA_test_AIV_H7», яка пройшла комісійне міжлабораторне випробування, розглянута та схвалена методичною комісією ННЦ «ІЕКВМ» (протокол № 5 від 23.09.2009 р.).

Особистий внесок здобувача полягає у самостійному виконанні методичних, аналітичних і експериментальних робіт.

Проведено дослідження з вивчення консервативних локусів гена гемаглютиніну вірусу грипу А субтипу H7, розрахунок праймерів АіvН7 (Ам) та АіvН7 (Eu) для детекції і генотипування американського та європейського генотипів відповідно, розроблено методики з виявлення РНК вірусів європейського та американського генотипів високопатогенного грипу птиці субтипу Н7 за допомогою ПЛР.

Генетичний аналіз вірусу грипу А субтипу Н7 здійснено під методичним керівництвом кандидата ветеринарних наук А. П. Геріловича.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень доповідались, обговорювались і отримали позитивну оцінку: на звітних сесіях вчених рад ФВМ ХДЗВА та ННЦ «ІЕКВМ» у 2006-2009 рр.; Міжнародній науково-практичній конференції «Високопатогенний грип птиці: актуальні аспекти епізоотології, епідеміології, діагностики та профілактики» (Новий Світ, АР Крим, 2006 р.); ІІІ_й Міжнародній практичній конференції з птахівництва (Судак, АР Крим, 2007 р.); Міжнародному конгресі з ветеринарної медицини, присвяченому 85_річчю з дня заснування ННЦ «ІЕКВМ» (Харків, 2008 р.); V Міжнародному ветеринарному конгресі з птахівництва (Москва, 2009 р.); науково-практичній і навчально-методичній конференції, присвячений 205_річчю започаткування наукової школи епізоотологів ХДЗВА з міжнародною участю «Проблеми, новітні здобутки та перспективи розвитку епізоотології» (Харків, 2009 р.).

Публікації. Основний зміст дисертації викладений у 9 друкованих працях, з них 4 опубліковані у фахових виданнях України, 2 статті та 1 тези у закордонних виданнях, описі деклараційного патенту на корисну модель України та методичних рекомендаціях.

Структура та обсяг дисертації. Основний зміст дисертації викладений на 130 сторінках комп'ютерного друку та ілюстрований 12 таблицями і 26 рисунками. Робота складається зі вступу, огляду літератури, матеріалів та методів досліджень, результатів власних досліджень, аналізу та узагальнення результатів власних досліджень, висновків і пропозицій виробництву, списку джерел літератури, який містить 133 найменування, у тому числі 87 авторів з далекого зарубіжжя, та додатків.

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Дисертаційна робота виконувалась у період з 2005 по 2009 рр. у лабораторії молекулярної діагностики ННЦ «ІЕКВМ» та на кафедрі вірусології, імунології та біотехнології ХДЗВА.

У роботі використовувались розплідки збудників грипу птиці різних субтипів, які були люб'язно надані лабораторією вивчення вірусних хвороб птиці ННЦ «ІЕКВМ», а також референтні зразки кДНК вірусу грипу А субтипу Н7 американського генотипу Influenza A virus /chicken/Iowa/2001/H7N2, що люб'язно надані доктором Д. Суарезом (David Suarez, США), та кДНК штаму Influenza A virus/mallard/Italy/2002/H7N1 і кДНК штаму Influenza A/virus/ Польща/S.021/2007/Н7N1 європейського генотипу, які люб'язно надані професором З. Мінтою (Zenon Minta, Польща).

З метою визначення циркуляції вірусу грипу А субтипів Н5 (у т. ч. H5N1) та Н7 на території України використовувались зразки клінічного матеріалу від курей та дикої птиці. Матеріалом для детекції та диференціації вірусу слугували трахеальні та клоакальні змиви, а також зразки легенів, селезінки, печінки, повітроносних мішків та головного мозку, з яких у подальшому готували суспензії на забуференому фізіологічному розчині. В якості консервуючої субстанції використовували 50 %_й гліцерин, до якого додавали стрептоміцин (кінцева концентрація 0,3 мг/см³) для попередження контамінації відібраного матеріалу (Andral В., 2000). Всього було досліджено 130 зразків матеріалу на наявність збудників пташиного грипу типу А, у т. ч. РНК вірусу субтипів Н5, Н5N1 та Н7. Крім клінічного матеріалу, досліджували ізоляти збудника грипу від свійської та дикої птиці на території АР Крим у період епізоотії 2005-2006 рр. і 2008 р. та у міжепізоотичний період.

З метою екстракції сумарної РНК застосовували комерційні набори, які використовували за принципом афінної сорбції, а також реагенти Рибосорб_50 (Амплісенс) та Рибосорб_100 (Амплісенс) виробництва ФДУН «Центрального науково-дослідного інституту епідеміології Росспоживнагляду» (Москва, Росія).

Реакцію зворотної транскрипції проводили за допомогою ревертази виробництва фірми Fermentas (Латвія) та комерційного набору Реверта_L виробництва ФДУН «Центрального науково-дослідного інституту епідеміології Росспоживнагляду» (Москва, Росія).

Ампліфікацію зразків проводили за допомогою наборів АмпліСенс_200 (№ 15-50-R), тест-системи виробництва ФДУН «Центрального науково-дослідного інституту епідеміології Росспоживнагляду» (Москва, Росія), SIGMA (№ R2523) виробництва фірми Sigma-Aldrich Biotechnology (Німеччина) та тест-системи для виявлення РНК високопатогенного вірусу грипу птиці субтипу Н5N1 методом ПЛР виробництва ННЦ «ІЕКВМ» у 40_цикловій ПЛР за температури відпалу праймерів 50-61 °С. Також для проведення ампліфікації застосовано системи праймерів AivM (для виявлення РНК вірусу грипу А), AivH5 та AivN1 (для ідентифікації субтипу H5N1) та NDV Fusion (для індикації вірусу ньюкаслської хвороби), розроблених дослідниками ННЦ «ІЕКВМ».

Для електрофоретичного аналізу застосовано агарозу виробництва SERVA (Німеччина). Для приготування буфера застосовані солі та бромід етидію виробництва Sigma-Aldrich Ltd. (США).

У якості маркера для електрофорезу застосовували 100 bp Ladder (ТОВ «Ізогон», Росія) та Low range loo bp Ladder («Fermentas», Латвія).

При створенні плазмідного контролю в якості вектора використовували відкриті вектори pBLUNT зі складу комерційних наборів Zero Blunt PCR Cloning Kit («Invitrogen», США). Для вбудовування ПЛР_продукту у плазміду проводили лігіювання за допомогою набору Zero Blunt PCR Cloning Reagent («Invitrogen», США). Для трансформації клітин E. coli плазмідною ДНК були використані набори Rapid DNA Transformation Kit («Fermentas» США). Інтактні та трансформовані культури E. coli вирощували на селекційних середовищах: м'ясо-пептонний агар (МПА) та рідке -- LB середовище (Луріа-Бертані). Для виділення плазмідної ДНК з E. coli застосовували метод S. Y. Lee (1990).

Для секвенування РНК (кДНК) вірусу грипу птиці були застосовані набори Rapid Gel DNA purify action Kit (Applied Bio systems, США). Секвенування проведено на базі Національного ветеринарного дослідницького інституту (Польща) та Віденського королівського університету (Австрія) за АВІ технологією.

Для коригування послідовностей, множинного вирівнювання та розрахунку праймерів використано програми BioEdit та AmplifX. Для філогенетичного аналізу фрагментів секвенованих послідовностей використані програми FASTA on_line та MEGA 3.1. Для порівняння користувались алгоритмом Neighbor Joining. Послідовності для порівняльного аналізу були завантажені з бази даних GenBank та з сайту глобального геномного проекту вірусів грипу (www.ncbi.nlm.mh.gov/ genomes/FLU/Database). Для конструювання плазмідного вектора використано програмний пакет Sci Ed Central (Clone Menager 7).

При оцінці епізоотичної ситуації щодо грипу птиці були зібрані та проаналізовані об'єктивні дані щодо особливостей поширення хвороби та відомості стосовно інфікування.

Поширення грипу птиці у світі вивчали за даними Міжнародного Епізоотичного Бюро (МЕБ), а в Україні -- за офіційною статистикою Державного комітету ветеринарної медицини України і Державного науково-дослідного інституту з лабораторної діагностики та ветеринарно-санітарної експертизи.

Проведено обстеження 15 птахогосподарств різних форм власності 4 областей України та АР Крим. При оцінці епізоотичної ситуації ураховували показники захворюваності та летальності (Бакулов И. А., 1979).

При більшості інфекційних захворювань діагноз встановлювали на підставі комплексу епізоотологічних, клінічних та патолого-анатомічних спостережень і результатів лабораторних досліджень з використанням серологічних, вірусологічних та молекулярно-генетичних методів.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Епізоотологічні аспекти високопатогенного грипу птиці в Україні та світі. Першим етапом наших досліджень було вивчення поширення високопатогенного грипу на різних континентах земної кулі в цілому, зокрема зумовленого вірусом субтипу Н7. Нами був проведений аналіз даних МЕБ з поширення цього захворювання з 50_х років минулого століття до сьогодення, а також проаналізовано звітність Державного комітету ветеринарної медицини України за 1998-2008 рр.

Аналітичні дослідження щодо епізоотології грипу птиці свідчать про те, що це захворювання досить поширене у світі, але якщо півстоліття тому (у 50-60_ті рр.) виявляли спалахи, які були зумовлені низькопатогенними ізолятами, то сьогодні майже весь Євразійський та частина Африканського континентів охоплені епізоотіями високопатогенного грипу, що призвело до знищення понад 200 мільйонів голів сільськогосподарської птиці та, як наслідок, до значних економічних збитків.

Взагалі від 1959 до 2008 рр. зареєстровано 33 великі спалахи високопатогенного грипу птиці, у тому числі спричинені субтипами H5N1 -- 4, H5N2 -- 5, H5N8 -- 1, H5N9 -- 1, H7N1 -- 3, H7N2 -- 1, H7N3 -- 10, H7N4 -- 1 і H7N7 -- 7. Аналіз даних ВООЗ показав, що з грудня 2003 р. по вересень 2009 р. у світі було зареєстровано 442 випадки інфікування людей вірусом пташиного грипу типу А (H5N1) у 15 країнах світу, з них 262 -- з летальним кінцем. Із зареєстрованих випадків захворювання людей на пташиний грип переважна більшість спостерігалась у сільських районах унаслідок прямого контакту з хворою або загиблою домашньою птицею.

Можна зазначити, що найбільша кількість випадків захворювання на пташиний грип у гострій формі, зумовленій субтипом Н7, в останні 5 років припадає на долю США, а саме на північну її частину. Друге місце належить країнам Європи (Італія, Великобританія, Німеччина тощо). Загальна кількість випадків захворювання на пташиний грип підтипу Н7 серед загальної кількості зареєстрованих спалахів з 2003 по 2009 рр. складає 30 % (рис. 1).

Небезпеку для країн Європи та, зокрема, для України в плані поширення американського генотипу вірусу серед птиці можуть становити дикі птахи. В світі існує декілька шляхів міграції перелітних птахів: місіссіпсько-американський, тихоокеанський, атлантичний, східно-атлантичний, середземноморський, східно-африканський-західно-азіатський, центрально-азіатський, східно-азіатсько-австралійський міграційні маршрути. Загрозу заносу вірусу з Європи та Азії створюють середземноморський тасхідно-африканський-західно-азіатський шляхи міграції. Східно-атлантичний шлях міграції птиці охоплює саме північні території Америки та може бути коридором поширення американських вірусів до Євразії.

Рис. 1 Дольова частка виникнення захворювання на грип птиці, зумовленого різними субтипами збудника, за останні 6 років

За даними Міжнародного Епізоотичного Бюро з 2003 по 2009 рр. зареєстровано 6629 спалахів високопатогенного грипу птиці у 52 країнах світу. У 2007-2009 рр. захворювання було виявлено у 46 країнах. Упродовж 2003-2009 рр. грип реєстрували серед курей (93 випадки), качок, гусей, лебедів (68 випадків), чайок (9 випадів), куликів (3 випадки), пастушок, лисух (12 випадків), бакланів (6 випадків), пагонок (6 випадків), яструбів, орлів (18 випадків), соколів (6 випадків), ворон (9 випадків), співучих птахів (36 випадків), фазанів, куропатв (12 випадків), голубів (6 випадків).

Відомо, що на грип хворіють усі види свійської та дикої птиці, але сприйнятливість до грипу залежить від підтипу збудника, виду та віку птиці. У сільськогосподарської птиці захворювання перебігало у вигляді ензоотій та епізоотій, часто в атиповій формі зі слабо вираженою клінічною картиною та супроводжувалося зниженням продуктивності. Циркуляцію окремих штамів вірусу було одночасно підтверджено у декількох видів птиці, що призводило до загибелі від 10 до 100 % захворілої птиці (рис. 2).

Рис. 2 Захворювання на ВППГ різних видів птиці за період з 2003 по 2009 рр

Проаналізовані нами дані Державного комітету ветеринарної медицини України щодо випадків спалахів ВППГ на території нашої держави за останні сім років свідчать про нестабільність виникнення випадків захворювання. Так, якщо на 2006 р. в Україні було зареєстровано 9 неблагополучних пунктів: 7 -- у Криму, 1 -- в Одесі, 1 -- у Сумах, у 2007 р. за даними Державного комітету ветеринарної медицини на території України обласними лабораторіями ветеринарної медицини не було виявлено жодного спалаху захворювання, у той час як у 2008 р. у Криму зареєстровано шість спалахів грипу птиці, а в 2009 р. не зафіксовано жодного спалаху захворювання (рис. 3).

Рис. 3 Зареєстрована кількість спалахів пташиного грипу в Україні за останні сім років за даними Державного комітету ветеринарної медицини України

Причиною виникнення грипу у приватних маєтках та господарствах України в більшості випадків були недотримання відповідних профілактичних і карантинних ветеринарно-санітарних заходів.

Порівняльний аналіз молекулярно-генетичних тест-систем для діагностики грипу птиці. На початку досліджень була використана розроблена для ветеринарних служб тест-система «ГРИП А» виробництва ФДУН «Центральний науково-дослідний інститут епідеміології Росспоживнагляду» (Москва, Росія). Ампліфікацію зразків проводили за рекомендованим протоколом до тест-системи, створеним та апробованим виробником у 2005_2006 рр. Результати проведеного за допомогою вказаної тест-системи дослідження розплідок вірусу грипу А субтипів Н1-Н14, у тому числі штамів Influenza A/virus/ch/Italy/82/2005/H7N3 та Influenza A/virus/Польща/S.021/2007/ Н7N1, показали, що праймери гібридизувались з усіма зразками, окрім кДНК з матеріалу, що містив штам Influenza A/virus/Польща/S.021/2007/Н7N1.

Отже, вказана тест-система за широтою детекції не відповідала вимогам, що унеможливило її подальше використання у моніторинговій роботі з індикації субтипів вірусу грипу А.

В іншому досліді було використано комерційний набір для детекції РНК вірусу грипу А та ідентифікації субтипів Н5 та Н7 за методом зворотної транскрипції та ПЛР «АмпліСенс Influenza virus A-H5/H7» виробництва ФДУН «Центральний науково-дослідний інститут епідеміології Росспоживнагляду» (Москва, Росія), який передбачав застосування праймерів, специфічних до гена NP (індикація) та НА (ідентифікація).

За проведеними дослідженнями встановлено, що праймери до вірусу типу А (індикація) гібридизувалися з усіма дослідженими зразками. Перевірка гетерологічних зразків показала відсутність утворення будь-яких продуктів реакції, що свідчить про її специфічність. Вивчення ж чутливості цього діагностикуму показало, що він виявляв РНК вірусу в зразках, де активність його становила лише 0,5-1,0 lg за РГА. У той же час методика ампліфікації, що була розроблена в ННЦ «ІЕКВМ», за ампліфікацією ділянки гена М довжиною 560 п. н. демонструвала вищу чутливість (поріг детекції складав менше 0,2 lg за РГА).

Вивчення широти детекції та специфічності систем праймерів до вірусів субтипу Н5 та Н7 показало, що вказані олігонуклеотиди мають високу специфічність, гібридизуючись тільки зі специфічними матрицями (ізоляту А/Сиваш/курка/2/05 та штамів Influenza A/virus/ch/Italy/82/2005/H7N3 і Influenza A/virus/Польща/S.021/2007/Н7N1 відповідно), та не вступають до реакції з неспецифічними (Н1-Н4, Н6, Н8-Н14, вірусу грипу А, вірусу грипу В, вірусів хвороби Гамборо та ньюкаслської хвороби) РНК матрицями.

Також нами було перевірено розроблену в ННЦ «ІЕКВМ» тест-систему для виявлення РНК високопатогенного вірусу грипу птиці субтипу Н5 методом ПЛР щодо чутливості та специфічності. Ампліфікацію зразків проводили згідно з протоколом до тест-системи з використанням праймерів AivH5 та AivN1.

Дослідження широти детектування тест-системи з застосуванням праймерів AivH5 проводилось з використанням панелі зразків РНК, екстрагованих з розплідки вірусу грипу А субтипів Н1-Н14, у т. ч. ізоляту А/Сиваш/курка/2/05 та штамів Influenza A/virus/ch/Italy/82/2005/H7N3 і Influenza A/virus/Польща/S.021/ 2007/Н7N1, а також гетерологічних вірусів (грипу В та ньюкаслської хвороби).

Проведені тестування проб показали, що тест-система виявляє РНК лише вірус грипу А субтипу Н5N1. У той же час праймери AivH5 не гібридизуються з РНК (кДНК)-зразками вірусу підтипу Н5 з іншою антигенною формою, а праймери AivN1 специфічні тільки до N1-підтипу нейрамінідази.

Чутливість тест-системи характеризувалась порогом детекції на рівні 0,5 lg і нижче, що свідчило про придатність її для застосування у діагностичній роботі. До того ж, на відміну від іншого комерційного набору (виробництва ФДУН «Центральний науково-дослідний інститут епідеміології Росспоживнагляду») тест-система для виявлення РНК високопатогенного вірусу грипу птиці субтипу Н5 методом ПЛР мала високу специфічність щодо детекції саме високопатогенних варіантів вірусу субтипу Н5N1 (табл. 1).

Отже, ми дійшли до висновку, що запропонована вітчизняними науковцями тест-системами для виявлення РНК високопатогенного вірусу грипу птиці субтипу Н5 методом ПЛР для молекулярної діагностики високопатогенного грипу птиці є достатньо чутливою, специфічною та придатною для індикації вірусів грипу А за геном матриксного протеїну та й ідентифікації субтипу Н5N1 за ампліфікації генів гемаглютиніну та нейрамінідази. Водночас, вказана система буде вважатися неповною у випадках, коли загроза високопатогенного грипу формується циркуляцією штамів субтипу Н7, які вже впродовж тривалого часу є ендемічними для ряду країн Західної та Центральної Європи.

Таблиця 1

Результати порівняльного дослідження різних методик молекулярної діагностики високопатогенного грипу птиці

На підставі зазначеного наші подальші зусилля були зосереджені на розробці методики виявлення вірусу підтипу Н7 методом ПЛР, її валідації та створенні діагностичної тест-системи.

Розробка систем праймерів для детекції та генотипування збудників типу А субтипу Н7. На першому етапі нашої роботи з метою створення специфічних праймерів для виявлення вірусу типу А субтипу Н7 у зразках біоматеріалу був проведений аналіз варіабельності основних генів вірусу. Субтип-репрезентуючими частинами геному збудника грипу є гени гемаглютиніну та нейрамінідази. Ураховуючи розмаїття нейрамінідазних субтипів вірусу типу Н7, ізольованих у світі за останні 10 років, нами був обраний як таргетний ген гемаглютиніну. При аналізі даних множинного вирівнювання за форматом мультилокусного (глобального) порівняння встановлено наявність двох ізогенотипів вірусу підтипу Н7. Орієнтуючись на географію ізоляції цих вірусів, їх ідентифіковано як американський та європейський генотипи.

Аналіз рівнів ентропії у досліджуваних послідовностях гена НА європейських ізолятів збудника після вирівнювання показав наявність 9 загальноконсервативних ділянок у межах цієї групи. У той же час аналіз послідовностей НА-гена американських та канадських ізолятів показав наявність 13 подібних ділянок.

На підставі поглибленого аналізу відповідності праймерів матриці та внутрішньовидової специфічності за допомогою FASTA on-line встановлено придатність для практичного використання чотирьох праймерів для виявлення європейських варіантів збудника і двох альтернативних варіантів праймерів для детекції вірусу Н7-субтипу американського генотипу. З числа цих праймерів обрано дві пари (AivH7 (Eu) та AivH7 (Am)), які були синтезовані та застосовані в експериментах з розробки методики ідентифікації генотипів вірусу підтипу Н7. Розраховані праймери АіvН7 (Аm) та АіvН7 (Eu) мали температуру плавлення 57 °С та 61 °С, а фланковані ними фрагменти вірусної РНК складали 284 п. н. та 641 п. н. відповідно (рис. 4).

Рис. 4 Праймери для ідентифікації генотипів вірусу грипу А субтипу Н7: позначена пара праймерів зверху -- праймери АіvН7 (Аm); позначена пара праймерів знизу -- АіvН7 (Eu); L -- довжина праймеру; Q -- якість праймеру; TM -- температура плавління праймеру

Після замовлення та синтезу праймерних систем був проведений комплекс досліджень, спрямований на підбір оптимальних параметрів ампліфікації та створення методик з виявлення РНК вірусів грипу А європейського та американського генотипів.

Розробка методики виявлення РНК вірусу високопатогенного грипу птиці європейського генотипу субтипу Н7 за допомогою полімеразної ланцюгової реакції та дослідження її чутливості та специфічності. На першому етапі нашої роботи зі зразків інактивованої ембріональної розплідки вірусу штаму Influenza A/virus/Польща/S.021/2007/Н7N1 була ізольована сумарна РНК і проведена зворотна транскрипція з метою напрацювання кДНК. Гомогенність отриманого препарату кДНК була перевірена шляхом електрофорезу, дані якого показали придатність її для проведення подальших досліджень.

Оптимізація методики виявлення РНК європейського генотипу вірусу субтипу Н7 полягала в зміні режиму відпалу праймерів, підборі оптимальної концентрації іонів магнію та кількості циклів ампліфікації, що є необхідною умовою збільшення контрастності смужок ампліконів при візуалізації результатів шляхом електрофорезу.

У результаті електрофоретичної оцінки продуктів ПЛР встановлено, що запропонована методика виявляє віруси грипу А субтипу Н7 в усіх зразках при активності від 0,2 до 7 lg, що було свідченням її задовільної чутливості. При дослідженні зразків від інтактної птиці амплікони не утворювались. Це свідчило про специфічність реакції. На задовільну внутрішньовидову специфічність розробленої методики вказувала відсутність продуктів ПЛР у ампліфікованих зразках гетерологічних матриць (віруси грипу А різних підтипів, що не відносяться до Н7, вірусів хвороби Ньюкасла та Гамборо, а також інфекційного бронхіту курей) (табл. 2).

На заключному етапі була досліджена аналітична чутливість створеного нами протоколу виявлення РНК вірусу грипу А субтипу Н7. З цією метою проведено тестування проб сумарної кДНК розплідки вірусу грипу А штаму Influenza A/virus/Польща/S.021/2007/Н7N1 в розведеннях від 1:10 до 1:10000. Було встановлено, що завдяки використанню системи специфічних праймерів Aiv H7 (Eu) можна виявляти РНК високопатогенного грипу птиці європейського генотипу субтипу Н7 в розведеннях до 1:10000, що відповідає активності вірусу 0,2 lg/см³ (рис. 5).

Таким чином нами було створено методику виявлення РНК вірусу грипу А субтипу Н7 європейського генотипу. Розроблений протокол має задовільні характеристики щодо чутливості, специфічності, внутрішньовидової специфічності та відтворюваності і, отже, може бути успішно застосований у рамках існуючої системи моніторингу високопатогенного грипу, доповнюючи розроблені тести з індикації та ідентифікації збудника захворювання.

Розробка методики виявлення РНК збудника грипу птиці субтипу Н7 американського генотипу за допомогою полімеразної ланцюгової реакції та дослідження її чутливості, та специфічності. Для створення повного спектра молекулярно-діагностичних засобів з індикації та ідентифікації високопатогенного грипу птиці підтипу Н7 нами була розроблена методика виявлення грипу птиці А субтипу Н7 американського генотипу.

В якості базового зразка нами було використано ембріональну розплідку американського вірусу грипу птиці штаму H7N2. Розроблена методика мала високу специфічність, про що свідчить утворювання амплікону з усіма позитивними зразками з різною активністю вірусу (рис. 6).

Мала високу внутрішньовидову специфічність, про це говорить наявність специфічних смуг довжиною 284 п. н. в усіх зразках вірусу американського генотипу та відсутність реакції з негативними та гетерологічнимі зразками.

Мала високу аналітичну чутливість, про що свідчить утворення амплікону в зразкові сумарної кДНК у розведеннях 1:5000, що відповідає активності вірусу 0,3-0,4 lg/см³.

Отже, нами була розроблена методика виявлення РНК вірусу грипу А субтипу Н7 американського генотипу, котра базується на використанні праймерів AivH7 (Am) до РНК збудника грипу птиці А субтипу Н7 американського генотипу та виборі оптимальних параметрів реакції, що забезпечує утворення специфічного амплікону довжиною 284 п. н.

Таблиця 2

Результати проведених досліджень чутливості, специфічності та відтворюваності методики

Розробка позитивного контрольного зразка гена гемаглютиніну вірусу грипу птиці субтипу Н7 європейського генотипу на основі рекомбінантних ДНК. Результати досліджень діагностичного матеріалу за допомогою жодної молекулярно-генетичної методики чи протоколу детекції збудника того чи іншого захворювання не можна вважати вірогідними, якщо немає прямих доказів специфічності реакції. Критерієм її у кожній окремо взятій постановці слугують контролі реакції. Негативний контроль доводить дослідникові факт специфічності отриманих результатів та відсутності контамінації застосованих компонентів реакційної суміші. Позитивний контроль реакції забезпечує доказову базу щодо активності компонентів реакційної суміші.

Питання створення та застосування позитивного контролю реакції при дослідженні матеріалів на інфекції, зумовлені РНК-вміщуючими вірусами, стоїть гостро, оскільки РНК-матриці є доволі нестабільними структурами. Вони піддаються швидкому руйнуванню при заморожуванні та під впливом ендогенних ферментів. Для забезпечення стабільності контрольних позитивних зразків учені всього світу вже давно користуються клонованими ДНК-копіями РНК-матриць.

При опрацюванні режиму детекції вірусу грипу А субтипу Н7 був відпрацьований регламент створення плазмідного контролю реакції у формі клонованої до плазмід E. coli ДНК копії гена гемаглютиніну.

Для створення рекомбінантного позитивного контрольного зразка була розрахована векторна молекула на основі відкритого комерційного вектора -- pCR-Blunt, на підставі чого був обраний саме цей вектор, оскільки він не потребував рестрикційних обробок і спеціальної підготовки вбудовуваного фрагмента, а також доопрацювання праймерів до синтезу останнього (рис. 7).

Рис. 7 Схема плазмідного вектору з вбудованими ділянками НА-гена вірусу грипу субтипу Н7 європейського генотипу на основі плазміди pCR-Blunt

На першому етапі створення плазмідного контрольного зразка нами були напрацьовані ділянки НА-гена вірусу грипу субтипу Н7 європейського генотипу з довжиною 641 п. н., який був вбудований до плазміди шляхом ТА-лігіювання. Отриману рекомбінантну ДНК було трансформовано до бактерії за рахунок хіміопарації при застосуванні хлористого кальцію.

За результатами проведеного ПЛР-скринінгу усіх отримуваних колоній та зразків біомаси рекомбінантних ДНК з рідкого середовища було виявлено, що всі дослідні проби були позитивними відносно НА-вставки. Утворювані при цьому продукти мали специфічний розмір та ампліфікувались у клітині E. coli у великій концентрації (рис. 8).

З накопиченої біомаси клітин клону було виділено сумарну ДНК,з якої методом селективної сорбції на розподільчих колонках було вилучено плазмідну ДНК. Останню заморозили за температури мінус 20 °С для подальшого використання в якості позитивного контролю при діагностиці грипу птиці субтипу Н7.

З метою перевірки стабільності рекомбінантної плазмідної ДНК при зберіганні були взяті нативні зразки та їх розведення 1:10; 1:100; 1:1000 та 1:10000. Аліквоти екстрактів та їх розведень були заморожені за температури мінус 20 °С та висушені і зберігалися за кімнатної температури. Спостереження здійснювали шляхом постановки ПЛР з періодичністю 1 раз на 3 місяці. У результаті досліджень встановили, що ліофілізовані зразки плазмідної ДНК у всіх закладених до панелі кількостях залишались незмінними через 3, 6, 9 та 12 місяців, у той час як заморожені зразки з низькою концентрацією матеріалу зазнавали руйнування після 9_місячного терміну (табл. 3).

Таблиця 3

Перевірка стабільності рекомбінантної плазмідної ДНК при зберіганні

Рекомбінантна плазмідна ДНК навіть у розведенні 1:10000 у ліофілізованому стані зберігалась протягом 12 місяців, що не можна сказати про заморожену, але ж результати цього дослідження свідчать про можливість довгого зберігання рекомбінантної плазмідної ДНК та використання її в якості позитивного контрольного зразка.

Розробка та випробування тест-системи для виявлення РНК високопатогенного вірусу грипу птиці субтипу Н7 методом полімеразної ланцюгової реакції. Після лабораторного випробування методики з виявлення РНК європейського генотипу високопатогенного грипу птиці субтипу Н7 за допомогою ПЛР на її основі створено тест-систему для виявлення РНК високопатогенного вірусу грипу птиці субтипу Н7 методом ПЛР (ТУ У 24.4_00497087_102:2009).

З метою вивчення циркуляції збудників грипу птиці серед птахопоголів'я, зокрема його типового складу, особливо в господарствах України, ми провели молекулярно-генетичні дослідження 360 проб біологічного матеріалу від загиблої та підозрюваної свійської та дикої птиці під час спалахів хвороби в Криму та інших регіонах України. Як тест-систему для індикації вірусу грипу субтипу Н5 використовували розроблену в ННЦ «ІЕКВМ» тест-систему для виявлення РНК високопатогенного вірусу грипу птиці субтипу Н5N1 методом ПЛР, а для виявлення вірусу грипу підтипу Н7 використовували розроблену нами методику по виявленню РНК європейського генотипу високопатогенного грипу птиці субтипу Н7 за допомогою ПЛР.

Діагностичні дослідження у деяких птахогосподарствах здійснювали впродовж 2-3 років поспіль. У ході проведення роботи всього було виявлено 87 позитивних зразків щодо вірусу грипу типу А, у тому числі 84 -- субтипу Н5 та 3 -- вірусу грипу субтипу Н7 (рис. 9).

Рис. 9 Дольова частка виявлення високопатогенного вірусу грипу А різних підтипів на території України за останні 5 роки -- усього досліджено; -- вірус грипу підтипу Н5; -- вірус грипу підтипу Н7

Якщо проаналізувати випадки виникнення захворювання свійської птиці на грип, які спостерігались на території України впродовж останніх 5 років, то можна зазначити, що на долю підтипу Н7 припадає 2 % від усіх зареєстрованих спалахів. Нами було зареєстровано 3 випадки виявлення РНК збудника високопатогеного грипу птиці субтипу Н7. Зразки були виділені з клінічного матеріалу від гусей одного з птахогосподарств Сумської області у 2006 р. Збудник був ідентифікований як вірус грипу А штаму Influenza A virus/goose/Ukraine/ 2006/H7N7.

Дослідження генетичної варіабельності вірусу грипу А субтипу Н7. На цьому етапі роботи нами був проведений генетичний аналіз вірусів грипу А субтипу Н7 з колекції ННЦ «ІЕКВМ». Причиною для проведення цієї роботи стала розрізненість інформаційних ресурсів щодо дослідження філогенетичних профілів вірусів грипу А субтипу Н7 у світі.

Нами було проведене множинне вирівнювання 307 послідовностей фрагментів гена гемаглютиніну вірусу грипу А субтипу Н7, ізольованого від птиці у країнах американського та євроазіатського континентів, яке показало наявність двох ендемічних гілок вірусів, які мали дивергенцію до 22 % між собою.

Гілка 1 була представлена американськими штамами вірусу грипу переважно субтипу H7N2 та деякими субтипами H7N3. Дивергенція в середині кладу складала до чотирьох відсотків. Американська геногрупа була представлена шістьма підгрупами (1а-1е) з різницею нуклеотидних послідовностей від 0,1 до 2,5 % та зовнішньою дивергенцією від 1 до 4 %.

Клад вірусу грипу А європейського генотипу був представлений п'ятьма генетичними підгрупами (2а-2д), кожна з яких вміщувала від чотирьох до 50 ізолятів. Більшість європейських ізолятів була виділена від дикої водоплавної птиці та індичок. Дивергенція між групами кладу склала до 6 %, а дивергенція в середині груп - до 5 %. Найбільшу нуклеотидну поліморфність продемонструвала група вірусів, позначена як 2в. Вона була представлена чотирма високопатогенними штамами, ізольованими від різних видів птиці (качка, лебідь, індичка та курча) в Європі та Америці. Цю групу можна розцінювати як переміжну ланку в еволюції відокремлених ендемічних популяцій вірусу. Дивергенція у ній склала понад 5 %, що свідчить про високий мутаційний фон в аналізованого кластера вірусів.

Після визначення топографічних особливостей дендрограми, яка відображала зв'язки вірусу грипу А субтипу Н7, було встановлено, що збудник американського генотипу не змішувався з популяцією європейських вірусів філогенетично. Тому при аналізі секвенованих послідовностей ізолятів Influenza A virus/ch/Italy/2001/02/H7N1 (IZPVe) та Influenza A virus/goose/Ukraine/2006/H7N7 ми досліджували їх лише у порівнянні до кДНК вірусів європейського генотипу.

Проведене клонування та секвенування фрагментів гена гемаглютиніну українських ізолятів показало (рис. 10), що вірус українського походження найбільш подібний до італійського вірусу, виділеного від страусів у 2001 р. Дивергенція між ізолятами складала 0,5 %.

У кладу вірусів з послідовностями плазмідного контрольного зразка pBlunt_AIVH7 були присутні віруси італійського та китайського походження з дивергенцією не більше 2 %, всі ізоляти характеризувались хазяїноспецифічністю по відношенню до диких водоплавних.

ВИСНОВКИ

1. Виконані дослідження дали можливість визначити епізоотичну ситуацію щодо високопатогенного грипу птиці в Україні та світі, вивчити поширення захворювання, його етіологічну структуру, особливості виникнення хвороби, з'ясувати патотип епізоотичних ізолятів збудника хвороби, що циркулюють серед птиці у птахогосподарствах України та за кордоном, провести аналіз існуючих комерційних та некомерційних тест-систем з виявлення та типування вірусу грипу та з'ясувати їх місце у системі діагностики захворювання, розробити методики та тест-систему для виявлення та типування збудника захворювання, зумовленого вірусом грипу птиці субтипу Н7, створити позитивний контрольний зразок гена гемаглютиніну вірусу грипу птиці субтипу Н7, проведений генетичний аналіз вірусів грипу А субтипу Н7.

2. Проведений епізоотологічний аналіз щодо інтенсивності епізоотичного процесу при ВППГ на території України, який свідчить про нестабільність виникнення захворювання. Так, у 2005 р. в Україні було зареєстровано 5 неблагополучних пунктів, у 2006 р. -- 9, а у 2008 р. -- 6. У той же час у 2007 та 2009 рр. повідомлень про захворювання не надходило. Це пов'язано з динамікою міграції птиці та спалахів хвороби на території країн світу, які знаходяться в межах середземноморського, східно-африкансько-західно-азіатськго та східно-атлантичного шляхів перельотів.

Рис. 10 Філогенетичні зв'язки між вірусами європейського генотипу (^ -- українські ізоляти)

3. За результатами вивчення консервативних локусів гена гемаглютиніну вірусу грипу А субтипу H7 встановлено відсутність у штамів європейського та американського генотипів загальноконсервативних локусів ділянки гена, що аналізується.