Розробка системи молекулярно-генетичного моніторингу високопатогенного грипу птиці (вірус типу А субтип Н7)

4. Отримані на підставі аналізу консервативних ділянок дані дозволили розрахувати праймери АіvН7 (Аm) до американського генотипу та АіvН7 (Eu) до європейського генотипу вірусу грипу А субтипу H7, які мають температуру плавлення 57 °С та 54 °С відповідно. Фланковані ними фрагменти олігонуклеотидів мають довжину 284 п. н. та 641 п. н. та демонструють високу внутрішньовидову специфічність по відношенню до перехресних генотипів вірусу грипу А інших субтипів, до інших вірусів птиці та геномної ДНК курки й інших видів птиці.

5. Розроблені методики виявлення РНК вірусів європейського та американського генотипів високопатогенного грипу птиці субтипу Н7 за допомогою полімеразної ланцюгової реакції є ефективними та мають високу внутрішньовидову специфічність.

6. Використання праймерів Aiv H7 (Eu) до вірусу європейського генотипу і Аіv Н7 (Аm) -- американського генотипу за оптимізованих параметрів реакції забезпечує утворення специфічних ампліконів довжиною 641 п. н. (європейський генотип) та 284 п. н. (американський генотип) та детекцію вірусу в пробах з активністю до 0,2-0,4 lg/см³ за РГА, що задовольняє діагностичним потребам.

7. Створена на підставі теоретичного аналізу гена гемаглютиніну вірусу грипу А субтипу Н7 модель рекомбінантної плазміди, що складається з pCR-Blunt відкритого вектора, вставки ділянки гена НА європейського генотипу, довжиною 641 п. н., може застосовуватися як позитивний контрольний зразок при діагностиці грипу птиці (тип А, субтип Н7). Отриманий за допомогою трансформації вектором pCR-Blunt стабільний клон № 3 інтродукує фрагмент гена НА вірусу грипу субтипу Н7 європейського генотипу.

8. Розроблена тест-система для виявлення РНК високопатогенного вірусу грипу птиці субтипу Н7 методом полімеразної ланцюгової реакції «Poul_RNA_test_AIV_H7» здатна виявляти кДНК вірусу високопатогенного грипу птиці підтипу Н7 у дослідному матеріалу з активністю вірусу до 0,2 lg/см³ за РГА, що відповідає за чутливістю світовим аналогам.

9. За секвенування та філогенетичного аналізу штами вірусу грипу А субтипу Н7 з колекції ННЦ «ІЕКВМ» віднесено до низькопатогенних штамів європейського генотипу субтипу Н7. Найбільша гомологія нуклеотидних послідовностей кДНК вірусу (96-98 %) спостерігалась зі збудниками, виділеними в Італії. Послідовності гена гемаглютиніну клону pBlunt_AIVH7 та розплідки збудника Influenza A virus/ch/Italy/2001/02/H7N1 є тотожними та на 99,6 % гомологічними до послідовності низькопатогенного ізоляту EU158105 Influenza A virus (A/mallard/Italy/250/02(H7N1)).

ПРОПОЗИЦІЇ ВИРОБНИЦТВУ

1. Нормативна документація на технологію виготовлення тест-системи для виявлення РНК високопатогенного вірусу грипу птиці субтипу Н7 методом полімеразної ланцюгової реакції (розглянута і схвалена на засіданні Методичної комісії ННЦ «ІЕКВМ», протокол № 5 від 23 вересня 2009 р.).

2. Методичні рекомендації щодо виявлення РНК американського та європейського генотипів високопатогенного вірусу грипу птиці субтипу Н7 та їх диференціації методом полімеразної ланцюгової реакції (затверджені Науково-методичною радою Державного комітету ветеринарної медицини України, протокол № 1 від 23-24 грудня 2009 р.).

3. Спосіб виявлення РНК американського та європейського генотипів високопатогенного вірусу грипу птиці субтипу Н7 та диференціація за геном гемаглютиніну (деклараційний патент на корисну модель України № 42434).

СПИСОК РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

Герілович А. П. Розробка систем праймерів для диференціації вірусів грипу А субтипу Н7 [Текст] / А. П. Герілович, С. І. Симоненко // Ветеринарна біотехнологія: бюл. К., 2009. № 14. С. 69-73. (Дисертант вивчив консервативні локуси гена гемаглютиніну вірусу грипу А субтипу H7, за результатами оцінки поліморфізму нуклеотидних послідовностей гена гемаглютиніну вірусу високопатогенного грипу субтипу Н7 встановив наявність двох генотипів вірусу та сконструював системи праймерів для їх індикації).

Герілович А. П. Розробка методики виявлення РНК Європейського генотипу високопатогенного грипу птиці субтипу Н7 за допомогою полімеразної ланцюгової реакції та дослідження внутрішньовидової специфічності [Текст] / А. П. Герілович, Б. Т. Стегній, С. І. Симоненко, О. С. Солодянкін // Проблеми зооінженерії та ветеринарної медицини: зб. наук. праць. Х., 2009. Вип. 19, ч. 2, т. 1. С. 152-157. (Дисертант розробив протокол ідентифікації високопатогенних варіантів субтипу Н7 європейського генотипу вірусу грипу А за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР), який показав високу внутрішньовидову специфічність по відношенню до високопатогенного грипу птиці субтипу Н7).

Герілович А. П. Розробка позитивного контрольного зразка гена гемаглютиніну вірусу грипу птиці субтипу Н7 європейського генотипу на основі рекомбінантних ДНК [Текст] / А. П. Герілович, С. І. Симоненко, В. І. Болотін, О. С. Солодянкін // Ветеринарна медицина: міжвід. темат. наук. зб. Х., 2009. Вип. 92. С. 113-119. (Дисертант розробив плазмідний вектор як позитивний контрольний зразок для діагностики грипу птиці (тип А, субтип Н7) з використанням методики виявлення РНК європейського генотипу високопатогенного грипу птиці субтипу Н7 за допомогою полімеразної ланцюгової реакції).

Стегній Б. Т. Секвенування та дослідження генетичної варіабельності вірусів грипу А субтипу Н7 [Текст] / Б. Т. Стегній, С. І. Симоненко, А. П. Герілович // Проблеми зооінженерії та ветеринарної медицини: зб. наук. праць. Х., 2009. Вип. 20, ч. 2, т. 1. С. 162-167. (Дисертант провів генетичний аналіз вірусу грипу А субтипу Н7 з колекції ННЦ «ІЕКВМ»).

Декл. пат. на кор. модель № 42434 Україна МПК C12N 7/00 Спосіб виявлення РНК американського та європейського генотипів високопатогенного вірусу грипу птиці субтипу Н7 та диференціація за геном гемаглютиніну [Текст] / А. П. Герілович, Б. Т. Стегній, С. І. Симоненко, О. С. Солодянкін, Д. В. Музика ; заявник та патентовласник Нац. наук. центр «Ін_т експерим. і клін. вет. медицини» (Україна). № 2008u14548 ; заявл. 17.12.08 ; опубл. 10.07.09, Бюл. № 13. 2 с.

Герілович А. П. Створення системи засобів ПЛР-моніторингу високопатогенного грипу птиці та ньюкаслської хвороби / А. П. Герілович, Б. Т. Стегній, А. Б. Стегній, С. І. Симоненко [Текст] // Птахівництво: міжвід. темат. наук. зб. Х., 2007. Вип. 60, ч. ІІ. С. 140-150. (Дисертант розробив методики виявлення РНК вірусу грипу А (за М-геном), вірусу високопатогенного грипу птиці субтипу H5N1 за генами ГА та НА, вірусу ньюкаслської хвороби за ампліфікацією високоваріабельної ділянки гена F).

Герилович А. П. Создание средств индикации высокопатогенного гриппа и ньюкаслской болезни, а также идентификации изолятов N1-, Н5- и Н7-субтипов [Текст] / А. П. Герилович, Б. Т. Стегний, С. И. Симоненко // V междунар. вет. конгр. по птицеводству: материалы. М., 2009. С. 91-95. (Дисертант описав створення протоколу ідентифікації високопатогенних варіантів субтипу Н7 вірусу грипу А).

Симоненко С. И. Разработка методики выявления РНК высокопатогенного гриппа птиц субтипа Н7 американского генотипа при помощи полимеразной цепной реакции и исследование внутривидовой специфичности [Текст] / С. И. Симоненко, Б. Т. Стегний, А. П. Герилович // Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов: материалы науч.-практ. конф. Щелково, 2009. С. 319-323. (Дисертант розробив протокол ідентифікації високопатогенних варіантів субтипу Н7 американського генотипу вірусу грипу А за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР)).

Gerilovych A. P. Development of avian influenza virus detection protocol for RNA European of type H7 [Text] / A. P. Gerilovych, B. T. Stegniy, S. I. Symonenko // XVI^th World Veterinary Poultry Association Congress: Book of abstracts. Marrakesh, Morocco, 2009. P1-A1. (Дисертант описав протокол ідентифікації високопатогенних варіантів субтипу Н7 європейського генотипу вірусу грипу А за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР)).

АНОТАЦІЯ

Симоненко С. І. Розробка системи молекулярно-генетичного моніторингу високопатогенного грипу птиці (вірус типу А субтип Н7). -- Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата ветеринарних наук за спеціальністю 16.00.03 -- ветеринарна мікробіологія, епізоотологія, інфекційні хвороби та імунологія. Національний науковий центр «Інститут експериментальної і клінічної ветеринарної медицини». Харків, 2010.

Дисертація присвячена з'ясуванню епізоотичної ситуації щодо високопатогенного вірусу грипу птиці, зумовленого субтипами Н5 та Н7, в Україні, аналізу різних тест-систем та визначення їх придатності та місця у діагностиці грипу птиці, а також розробці засобів діагностики цього захворювання, викликаного збудником субтипу Н7.

Було вивчено епізоотичну ситуацію щодо високопатогенного грипу птиці, зумовленого субтипами Н5 та Н7, в Україні та світі. Вивчено поширення захворювання на різних континентах земної кулі, його етіологічну структуру, особливості виникнення хвороби. З'ясовано патотип епізоотичних ізолятів збудника хвороби, що циркулюють серед птиці у птахогосподарствах України та за кордоном. Проаналізовані різні тест-системи з індикації та ідентифікації збудника захворювання. Вивчено консервативні локуси гена гемаглютиніну вірусу грипу А субтипу H7, що дозволило встановити наявність європейського і американського генотипів вірусу та створити системи праймерів до кожного з генотипів. Розроблені методики та тест-система для виявлення та типування збудника захворювання, зумовленого вірусом грипу птиці субтипу Н7. Розроблено позитивний контрольний зразок гена гемаглютиніну вірусу грипу птиці субтипу Н7 європейського генотипу на основі рекомбінантних ДНК. Проведено генетичний аналіз вірусів грипу А субтипу Н7. Викладено методику виявлення РНК американського та європейського генотипів високопатогенного вірусу грипу птиці субтипу Н7 та їх диференціації методом полімеразної ланцюгової реакції.

Ключові слова: високопатогенний грип птиці, лабораторна діагностика, молекулярно-генетичні тест-системи, полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР), молекулярне клонування, генотипова варіабельність, філогенетичний аналіз.

Симоненко С. И. Разработка системы молекулярно-генетического мониторинга высокопатогенного гриппа птицы (вирус типа А субтип Н7). -- Рукопись.

Диссертация на соискание учёной степени кандидата ветеринарных наук по специальности 16.00.03 -- ветеринарная микробиология, эпизоотология, инфекционные болезни и иммунология. Национальный научный центр «Институт экспериментальной и клинической ветеринарной медицины». Харьков, 2010.

Диссертация посвящена выяснению эпизоотической ситуации относительно высокопатогенного вируса гриппа птицы, обусловленного субтипами Н5 и Н7, в Украине, анализу разных тест-систем и определения их пригодности и места в диагностике гриппа птицы, а также разработке средств диагностики этого заболевания, вызванного возбудителем субтипа Н7.

Была изучена эпизоотическая ситуация относительно высокопатогенного гриппа птицы, обусловленного субтипами Н5 и Н7, в Украине и мире. Изучено распространение заболевания на разных континентах земного шара, его этиологическую структуру, особенность возникновения болезни. Выяснено патотип эпизоотических изолятов возбудителя болезни, которые циркулируют среди птицы в птицехозяйствах Украины и за границей. Проанализированы разные тест-системы по индикации и идентификации возбудителя болезни, что дало возможность установить отсутствие специфических средств идентификации вирусов гриппа субтипа Н7. Для заполнения этой ниши в системе диагностики высокопатогенного гриппа птицы нами были изучены консервативные локусы гена гемагглютинина вируса гриппа А субтипа Н7, что позволило установить наличие европейского и американского генотипов вируса. На основе проведенного анализа уровней энтропии в исследуемых последовательностях гена НА, анализа определенных консервативных регионов, теоретический анализ праймеров относительно качества по параметрам образования вторичных структур и термодинамическим характеристикам позволил создать системы праймеров к каждому из генотипов. Разработаны методики и тест-система для выявления и типирования возбудителя заболевания, обусловленного вирусом гриппа птицы субтипа Н7, которые продемонстрировали высокую эффективность и специфичность и соответствуют международным стандартам. Для обеспечения стабильности положительных контрольных образцов, используемых в реакции, разработан положительный контрольный образец гена гемагглютинина вируса гриппа птицы субтипа Н7 европейского генотипа на основе рекомбинантных ДНК. Проведен генетический анализ вирусов гриппа А субтипа Н7, который позволил установить филогенетические связи между выделенными штаммами вирусов в Украине и в других странах Европы. Изложена методика выявления РНК американского и европейского генотипов высокопатогенного гриппа птицы субтипа Н7 и их дифференциации методом полимеразной цепной реакции.

Ключевые слова: высокопатогенный грипп птицы, лабораторная диагностика, молекулярно-генетические тест-системы, полимеразная цепная реакция (ПЦР), молекулярное клонирование, генотиповая вариабельность, филогенетический анализ.

Symonenko S. I. Elaboration of molecular-genetic monitoring system of high pathogenic avian influenza (A virus H7 subtype). -- Manuscript.

Thesis for scientific degree of candidate of veterinary science on speciality 16.00.03 -- veterinary microbiology, epizootology, infection diseases and immunology. National Scientific Center “Institute of Experimental and Clinical Veterinary Medicine”. Kharkiv, 2010

The thesis is devoted to study of epizootic situation in Ukraine concerning high-pathogenic avian influenza, that is caused by A virus H5 and H7 subtypes. It was analyzed different kits and determined of their adaptability and the rank in influenza disease diagnostics as well as diagnostic facilities elaboration for this disease in case H7 subtype infection.

It was determined epizootic situation in Ukraine and all over the world concerning high-pathogenic avian influenza, which is caused by H5 and H7 subtypes. It was studied contagion in different continents, etiologic structure, and characteristic of its occurrence.

It was determined a pathotype of epizootic isolates, which circulate among birds population in poultry farms of Ukraine and abroad. It was analyzed different diagnostic kits for detection and identification of agent.

It was studied the HA-gene conservative loci, that made possible to determine European and American genotypes presence and to designed the primers for each of them. The developed methods and diagnostic kit for detection and typing of agent. It was developed a positive sample of HA-gene from avian influenza virus A subtype H7 that bases on recombinant DNA. It was carried out the genetic analysis of viruses A subtype H7. It was expounded the methods of RNA detection for high-pathogenic avian influenza virus A subtype H7 both genotypes (European and American) and their differentiation by PCR.

Keywords: high pathogenic avian influenza, laboratory diagnostics, molecular-genetic diagnostic kits, polymerase chain reaction (PCR), molecular cloning, genotypic variability, phylogenic analyses.

Размещено на Allbest.ru